芽胞桿菌肽聚糖水解酶的功能研究進(jìn)展

王丹丹 郭淑元

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

芽胞桿菌肽聚糖水解酶的功能研究進(jìn)展

王丹丹 郭淑元

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

長(zhǎng)久以來(lái)，肽聚糖水解酶都被認(rèn)為是破壞性的角色，如噬菌體利用它裂解宿主以釋放病毒粒子，一些細(xì)菌分泌它來(lái)溶解競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手等。但近幾年來(lái)，隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，它的積極作用更為重要。綜述了芽胞桿菌肽聚糖水解酶在細(xì)胞整個(gè)生命過(guò)程中的功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、能動(dòng)性、芽胞形成及萌發(fā)、蛋白分泌、信息傳遞、先天性免疫以及致病性各個(gè)方面，為研究芽胞桿菌及其他微生物中肽聚糖水解酶和細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)奠定了理論基礎(chǔ)。

芽胞桿菌；肽聚糖；肽聚糖水解酶；功能

絕大多數(shù)細(xì)菌都具有一層剛硬的細(xì)胞壁，它主要由肽聚糖（PG）組成。PG在細(xì)胞膜外層形成了網(wǎng)狀、堅(jiān)韌而富有彈性的分子層，稱為PG球囊，尤其在革蘭氏陽(yáng)性菌中，PG層數(shù)可多達(dá)50層，占細(xì)胞壁干重的50%-80%。PG球囊構(gòu)成了細(xì)胞壁的骨架成分，與僵硬的植物細(xì)胞壁不同，它具有彈性，在決定和維持細(xì)胞固有形態(tài)、防止細(xì)胞在低滲溶液中脹裂、維持細(xì)胞完整性等方面起著重要的作用［1］。在細(xì)菌的細(xì)胞壁上存在著一群比較特殊的酶，被命名為肽聚糖水解酶（Peptidoglycan hydrolase）。這類酶能夠裂解PG球囊或者PG片段之間的共價(jià)鍵，在細(xì)胞的生命過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用［2］。

芽胞桿菌是一類分布廣泛的好氧或兼性厭氧菌，一般為革蘭氏陽(yáng)性（Gram-positive，G+），多數(shù)具有鞭毛，最主要的特點(diǎn)為生長(zhǎng)后期生成抗逆性芽胞，對(duì)高溫高壓及酸堿環(huán)境具有抗性，個(gè)別菌種伴隨芽胞生成伴胞晶體［3］。目前芽胞桿菌作為益生菌被廣泛開發(fā)成微生態(tài)制劑，用于醫(yī)藥、保健、農(nóng)林、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)方面［4-6］。本文綜述了芽胞桿菌中PG水解酶的功能，為進(jìn)一步研究和利用PG水解酶奠定了理論基礎(chǔ)。

1 肽聚糖（PG）

PG是由許多相同亞基構(gòu)成的網(wǎng)狀大分子聚合物，每個(gè)PG亞基由雙糖、四肽尾及肽橋（或肽鏈）組成。各種細(xì)菌細(xì)胞壁的雙糖支架均相同，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）兩種氨基糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵相互間隔連接而成；四肽尾的組成及連接方式則各異，在G+菌中，一般為L(zhǎng)-Ala+D-Glu+L-Lys+D-Ala，G-（Gram-negative） 菌中為L(zhǎng)-Ala+D-Glu+m-DAP+D-Ala［7］。在G-菌中，四尾肽連接是直接的，即前后兩肽尾的D-Ala與m-DAP直接相連，交聯(lián)率低；而在大多數(shù)G+菌（但不是全部）中連接是間接的，連接前后兩個(gè)四肽尾分子的“橋梁”往往是一段富含甘氨酸的“肽橋”［8］。

2 PG水解酶

根據(jù)作用于PG化學(xué)鍵位點(diǎn)的差異，可將PG水解酶分為3大類［7，9，10］。

2.1 糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶

水解N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）之間的糖苷鍵，切開多糖骨架，如圖1中箭頭1所示。

2.2 酰胺酶

水解N-乙酰胞壁酸（MurNAc）與L-丙氨酸之間的酰胺鍵，從而斷開多糖主鏈和肽橋，如圖1中箭頭2所示。

圖1 一般革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及PG酶切位點(diǎn)圖解［7，9，10］

2.3 肽鏈內(nèi)切酶

水解肽橋中間以及氨基酸側(cè)鏈的肽鍵，如圖1中箭頭3所示。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PG中的糖苷鍵和酰胺鍵都可作為底物被至少一種酶（或經(jīng)常是幾種不同的的酶）切割［11］；并且每一種酰胺鍵幾乎都有相應(yīng)的肽酶存在，甚至有幾種結(jié)構(gòu)和機(jī)制不同的肽酶家族可以作用于同一種酰胺鍵［8，12］。

3 芽胞桿菌PG水解酶的功能

PG水解酶幾乎參與了細(xì)胞的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程：包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分離、分化、自溶和細(xì)胞壁的翻轉(zhuǎn)、能動(dòng)性、趨向性、蛋白分泌、先天性免疫，以及致病性、細(xì)胞間的信息傳遞及菌群間競(jìng)爭(zhēng)等［1，13-15］。

3.1 PG水解酶在芽胞桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用

細(xì)菌的PG細(xì)胞壁在維持細(xì)胞形態(tài)，保持細(xì)胞完整性方面發(fā)揮著決定性的作用，然而不難想象，這個(gè)由共價(jià)鍵連接起來(lái)的“外骨骼”在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)卻是限制性因素，所以隨著細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)，細(xì)胞壁PG也要連續(xù)、動(dòng)態(tài)地?cái)U(kuò)張［14］。PG球囊是一個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在其連續(xù)擴(kuò)展的過(guò)程中，PG水解酶與PG合成酶之間的相互作用非常關(guān)鍵：水解酶首先切斷PG網(wǎng)絡(luò)之間的連接，隨后合成酶插入新生成的PG單位。如果水解酶不參與，只有合成酶發(fā)揮作用，那么只能增加細(xì)胞壁的厚度而不能增大細(xì)胞壁的表面積，細(xì)胞也就無(wú)法生長(zhǎng)。

2010年，Sudiarta等［16］研究發(fā)現(xiàn)了與Bacillus subtilis細(xì)胞壁降解有關(guān)的蛋白酶CwlP（cell wall lytic enzyme related to phage），它是噬菌體區(qū)最大的一個(gè)蛋白，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：SLT結(jié)構(gòu)域、M23家族肽酶結(jié)構(gòu)域以及與噬菌體有關(guān)的尾巴蛋白結(jié)構(gòu)域。前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與Escherichia coli的溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶Slt70、Staphylococcus aureus的Gly-Gly肽鏈內(nèi)切酶LytM相似。酶普法顯示，CwlP的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以水解B. subtilis的PG細(xì)胞壁［16］。2014年文獻(xiàn)報(bào)道，CwlO 或 LytE D，L-肽鏈內(nèi)切酶型自溶素是B. subtilis細(xì)胞活力所必須的，二者至少要有一個(gè)存在，細(xì)胞才能存活［17］，而PG的合成受肌動(dòng)蛋白MerB控制，PG水解酶與MerB的同源蛋白MerBH能發(fā)生互作［18］，后者主要是負(fù)責(zé)LytE在細(xì)胞壁柱細(xì)胞上正確定位［19］。這些研究都證明PG水解酶在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但具體哪一類酶在細(xì)胞的哪個(gè)時(shí)期、哪個(gè)位置發(fā)揮了作用，還需要進(jìn)一步的探究。

3.2 PG水解酶在芽胞桿菌PG加工、翻轉(zhuǎn)和成熟中的作用

電子顯微鏡圖像和脈沖追蹤標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示B.subtilis的細(xì)胞壁由3層組成，且由內(nèi)向外流動(dòng)［20］：新合成、無(wú)應(yīng)力的PG層緊貼細(xì)胞膜，形成細(xì)胞壁的內(nèi)層；隨著細(xì)胞的伸長(zhǎng)，新的PG向外傳遞和擴(kuò)張，變成耐壓的中層；最外層包含舊的、部分被水解的PG，并等待PG水解酶的下一步溶解［21］。細(xì)胞壁這種由內(nèi)向外的動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)模型要求舊的PG必須被PG水解酶水解，新的PG才能擴(kuò)展并隨著細(xì)胞的伸長(zhǎng)承受相應(yīng)的壓力和張力。

最內(nèi)層PG合成初期，在高分子量的盤尼西林結(jié)合蛋白（Penicillin-binding proteins，PBPs）的參與下，通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用和轉(zhuǎn)肽作用使雙糖單位和五肽聚合。隨后，初始的PG要經(jīng)過(guò)加工，才能轉(zhuǎn)變成正確的結(jié)構(gòu)形態(tài)，這個(gè)過(guò)程需要PG水解酶的催化，如成熟的聚糖鏈非還原性終端為MurNAc，說(shuō)明氨基葡糖苷酶發(fā)揮了作用［22］。

3.3 PG水解酶在芽胞桿菌細(xì)胞分裂中的作用

芽胞桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞沿其縱向軸線伸長(zhǎng)，新的聚糖鏈和肽段側(cè)鏈將插入到已有的PG層結(jié)構(gòu)中；分裂時(shí)細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)終止，新的PG材料聚集形成隔膜，隨后形成半球狀的細(xì)胞兩極，子細(xì)胞分離［23，24］。

B.subtilis中已有35種細(xì)胞壁水解酶（這35種PG水解酶被分組到相應(yīng)的11個(gè)不同家族［10］）得到鑒定，但只有兩種D，L-肽鏈內(nèi)切酶參與了細(xì)胞增殖［25］：LytE與CwlO。二者的催化結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜lpC/P60家族，該家族酶序列中保守存在的一個(gè)半胱氨酸殘基被認(rèn)為是催化位點(diǎn)。2012年，Hashimoto 等［25］通過(guò)對(duì)這兩個(gè)酶的催化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)（將半胱氨酸替換為絲氨酸LytEC247S、CwlOC377S），LytE和CwlO失活，結(jié)果細(xì)胞增殖出現(xiàn)停滯；通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)CwlO存在于細(xì)胞的圓柱體部位，LytE則在細(xì)胞的隔膜、兩極和圓柱體部位都有分布；而 lytE和cwlO的合成致死效應(yīng)是由于二者在外側(cè)細(xì)胞壁上的D，L-肽鏈內(nèi)切酶活性缺失而引起的?？梢?jiàn)，PG水解酶在細(xì)胞分裂時(shí)扮演著不可替代的角色。但PG在局部大量水解顯然是一個(gè)危險(xiǎn)的過(guò)程，必須受到機(jī)體的嚴(yán)格控制，既要防止母細(xì)胞自溶，又要保證分裂時(shí)子細(xì)胞能繼承該種屬特異性的形態(tài)和大?。?6］。這主要依賴PG合成酶和PG水解酶的協(xié)調(diào)作用，這種作用的失調(diào)很可能會(huì)導(dǎo)致完整的PG球囊出現(xiàn)大的缺口，最終導(dǎo)致細(xì)胞自溶。

3.4 PG水解酶在芽胞形成和萌發(fā)中的作用

芽胞形成初期，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞不對(duì)稱地分割，產(chǎn)生兩個(gè)大小不等、命運(yùn)不同的子細(xì)胞，其中較小的細(xì)胞分化為休眠的芽胞，稱為前芽胞；較大的細(xì)胞為芽胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，稱為母細(xì)胞。最初前芽胞和母細(xì)胞并列存在，二者中間被雙層隔膜分開；不久，母細(xì)胞便指導(dǎo)合成PG水解酶，水解隔膜PG，促進(jìn)母細(xì)胞薄膜圍繞前芽胞移動(dòng)（這個(gè)過(guò)程稱為吞沒(méi)），吞沒(méi)完成之后，前芽胞被兩層PG膜包圍，內(nèi)層PG后來(lái)發(fā)展為細(xì)胞壁，外層皮質(zhì)是從母細(xì)胞衍生而來(lái)。此時(shí)前芽胞就存在于母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，作為一個(gè)具有雙層膜的游離原生質(zhì)體存在，當(dāng)芽胞完全成熟后，母細(xì)胞裂解，將芽胞釋放到外界環(huán)境中并繼續(xù)保持休眠狀態(tài)［3］。

Bacillus的芽胞衣是由三層構(gòu)成的——高電子密度的外層、輕微著色的中間層和電子松散的內(nèi)層［3］，這種復(fù)雜的“分子篩”結(jié)構(gòu)只允許小分子通過(guò)，皮層溶解酶（如胞壁質(zhì)酶或者SleB）等則不能滲入芽胞內(nèi)［27］。由于芽胞外衣具有化學(xué)和生物抗性，可以保護(hù)核心不被外界因素（高溫、紫外、輻射、有機(jī)溶劑、機(jī)械損傷、化學(xué)毒素等）破壞，同時(shí)對(duì)細(xì)菌中的各種酶具有抗性。因此，芽胞可以長(zhǎng)時(shí)間暴露在外界環(huán)境中，最長(zhǎng)可達(dá)數(shù)年。但是在休眠期間，芽胞并非不活動(dòng)，它具有對(duì)外界環(huán)境的感受能力，當(dāng)環(huán)境適宜其生長(zhǎng)的時(shí)候，它便復(fù)蘇、萌發(fā)并生長(zhǎng)［28］。

芽胞皮層的形成需要細(xì)胞壁PG大量的重排和修飾，在 B. subtilis中，DacB與DacF 是最主要的DD-縮肽酶，參與芽胞的PG合成。DacB主要是在前芽胞形成之前的細(xì)胞隔膜上表達(dá)，DacF 則是在前芽胞的隔層上表達(dá)，而PG水解酶SpoIID主要負(fù)責(zé)PG隔膜的水解，它與LytB同源（LytB可以作為修飾蛋白提高酰胺酶LytC的活性），基因spoIID的突變使芽胞生成停留在隔膜被部分水解的階段。

芽胞萌發(fā)的關(guān)鍵即是芽胞皮層的降解，阻止皮層降解將導(dǎo)致芽胞代謝停止、大分子不能合成，芽胞生存能力因此急劇降低。芽胞皮層的本質(zhì)是一層有特殊修飾的PG［29］，皮層降解是通過(guò)兩個(gè)特殊的PG水解酶CwlJ和SleB以及SleB的伴侶蛋白YpeB來(lái)完成的［30］，ΔcwlJΔsleB雙突變株的芽胞呈現(xiàn)出非常低的生存力［31，32］。SleB是一個(gè)溶菌性的轉(zhuǎn)糖苷酶，去除信號(hào)肽后由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端PG結(jié)合區(qū)（SleBN），沒(méi)有催化活性，但是可以與皮層PG結(jié)合；C端為活性催化區(qū)（SleBC）［33，34］，可以降解芽胞皮層。無(wú)論是體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證明，去除信號(hào)肽序列的SleB（SleBM）和SleB的C端結(jié)構(gòu)域（SleBC）都能單獨(dú)有效地引發(fā)Bacillus megaterium和Bacillus subtilis芽胞的萌發(fā)，而SleB的N端結(jié)構(gòu)域（SleBN）僅能結(jié)合PG，沒(méi)有酶解活性。CwlJ與SleB 具有相似的結(jié)構(gòu)，但它的催化活性還沒(méi)有得到體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。伴侶蛋白YpeB的N端和C端結(jié)構(gòu)域（YpeBN和 YpeBC），以及缺少其假定膜錨定序列的蛋白（YpeBM）都不能單獨(dú)表現(xiàn)出降解活性，但YpeBN可以抑制體外SleBM和SleBC的活性［30］。另有文獻(xiàn)證明，在B. subtilis芽胞萌發(fā)過(guò)程中，兩個(gè)N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶類的基因的同時(shí)缺失會(huì)導(dǎo)致萌發(fā)受阻；B. subtilis LytH蛋白含有M23結(jié)構(gòu)域，可以體內(nèi)水解芽胞PG中的L-Ala-D-Glu肽鍵，引起芽胞皮層降解，而ytH基因僅在芽胞期表達(dá)［35］。

所以芽胞的形成和萌發(fā)對(duì)PG水解酶活性具有依賴，并且在這個(gè)過(guò)程中，PG水解酶顯示出十分明顯的功能冗余的現(xiàn)象，也就是說(shuō)，這個(gè)過(guò)程不是一個(gè)或幾個(gè)PG水解酶單獨(dú)完成的，而是要依靠許多相關(guān)酶的共同作用。

3.5 PG水解酶參與蛋白復(fù)合體裝配和蛋白的分泌

細(xì)菌蛋白復(fù)合體的裝配對(duì)菌體許多行為產(chǎn)生著重要的影響，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、趨藥性、分裂、分化、群集和細(xì)胞間的交互作用等，而復(fù)合體的裝配需要PG水解酶的參與；細(xì)菌細(xì)胞壁中共價(jià)交聯(lián)的PG網(wǎng)絡(luò)對(duì)蛋白的分泌有一定的阻礙作用，這種阻礙可以通過(guò)PG水解酶的水解作用消除。例如，芽胞期，B. subtilis的母細(xì)胞和前芽胞各自選擇性表達(dá)不同的基因，通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳遞系統(tǒng)彼此聯(lián)系［18，36］，同時(shí)組裝由母細(xì)胞膜蛋白SpoIIIAH、前芽胞膜蛋白SpoIIQ以及其他蛋白組成的轉(zhuǎn)運(yùn)分泌跨膜復(fù)合體，橫跨隔開二者的兩層隔膜進(jìn)行信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸［37，38］。形成跨膜復(fù)合體的關(guān)鍵是蛋白的定位。一般來(lái)說(shuō)，被稱為“創(chuàng)始蛋白”的第一個(gè)蛋白可以識(shí)別特定的亞細(xì)胞位置，然后其他的蛋白就通過(guò)直接或者間接地與“創(chuàng)始蛋白”發(fā)生作用而固定在該位置，所以，定位的精確性其實(shí)僅僅取決于“創(chuàng)始蛋白”的識(shí)別。2010年，Meisner等［40］研究了芽胞生成時(shí)膜蛋白的定位機(jī)制，證明B. subtilis芽胞生成時(shí)，首先母細(xì)胞膜蛋白SpoIIIAH通過(guò)與前芽胞膜蛋白SpoIIQ的交互作用識(shí)別細(xì)胞-細(xì)胞界面［39］，然后其他蛋白通過(guò)SpoIIIAH-SpoIIQ復(fù)合體進(jìn)行定位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SpoIIIAH和SpoIIQ的交互作用分別是通過(guò)它們的YscJ和退化的LytM結(jié)構(gòu)域控制的［40］。SpoIIIAH和SpoIIQ均包含N端跨膜片段和C端胞外結(jié)構(gòu)域，其中SpoIIIAH胞外結(jié)構(gòu)域與YscJ-FliF家族蛋白具有相似性，后者參與G-菌中形成III型分泌系統(tǒng)和鞭毛［38，41］；而SpoIIQ的胞外結(jié)構(gòu)域包含活性位點(diǎn)退化的LytM結(jié)構(gòu)域，該蛋白是一種金屬肽鏈內(nèi)切酶，屬于M23家族，可以特異性切斷PG細(xì)胞壁中的肽橋。2013年，Rodrigues等［42］進(jìn)一步證明SpollQ的定位不僅需要SpolllAH，還需要另外兩種PG水解酶SpollP和SpollD的幫助。另一實(shí)驗(yàn)也證明，PG水解酶lytC和/或lytD的失活阻礙了B. subtilis分泌蛋白的分泌［13］。

綜上，PG水解酶通過(guò)水解PG，直接或間接影響著蛋白分泌和蛋白復(fù)合體的裝配，為細(xì)胞的正常生命活動(dòng)提供不可或缺的保證。

3.6 芽胞桿菌PG水解酶促進(jìn)細(xì)胞裂解和殺蟲蛋白的釋放

芽胞桿菌中的一個(gè)獨(dú)立種蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前使用最廣泛的生物殺蟲劑，能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystalprotein，ICP） 或稱伴胞晶體（Crystal Protein，簡(jiǎn)稱Cry蛋白）是它區(qū)別于其他芽胞桿菌的標(biāo)志。Cry蛋白對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目和食毛目等多種昆蟲，以及線蟲、蝸類和原生動(dòng)物等具有特異性的殺蟲活性，也被用于轉(zhuǎn)基因植物，在農(nóng)業(yè)害蟲防治中發(fā)揮重要作用［43，44］。

伴胞晶體是在Bt菌體裂解后隨著芽胞釋放到體外的，隨后在昆蟲中腸液中被激活成活性形式，發(fā)揮殺蟲作用［45］，所以菌體細(xì)胞壁的裂解是伴胞晶體釋放的必要條件。2013年，楊靜妮等研究了Bt中參與母細(xì)胞裂解的一個(gè)PG水解酶CwlB，通過(guò)構(gòu)建突變體HD（ΔcwlB）并對(duì)其不同時(shí)相的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在 T0 與 T16（成熟芽胞已經(jīng)形成）時(shí)期，突變體的細(xì)胞形態(tài)與野生型 Bt_HD73并無(wú)差異；在T20 時(shí)，野生型 Bt_HD73菌株幾乎 90%以上的母細(xì)胞已經(jīng)裂解，芽胞和晶體已經(jīng)被釋放，而突變體 HD（ΔcwlB）中僅有少部分細(xì)胞發(fā)生了裂解，大多數(shù)還保持著正常形態(tài)；到T24 時(shí)期，HD（ΔcwlB）中 90%以上的母細(xì)胞才裂解，芽胞和晶體被釋放。說(shuō)明PG水解酶CwlB 的缺失延遲了母細(xì)胞的裂解時(shí)間，致使殺蟲蛋白釋放延遲［9］。由此證明，PG水解酶在細(xì)胞裂解過(guò)程中發(fā)揮了不可替代的作用，它可以促進(jìn)細(xì)胞裂解，從而促進(jìn)殺蟲蛋白及芽胞的釋放，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究殺蟲晶體蛋白的保護(hù)奠定了重要基礎(chǔ)。

3.7 PG水解酶在調(diào)節(jié)免疫激活中的作用

由于細(xì)菌駐留在哺乳動(dòng)物宿主中，PG水解酶功能的丟失可能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生或消除先天免疫受體中的PG受體激活劑，從而誘發(fā)或者抑制免疫應(yīng)答。而特定的PG碎片的釋放代表了一種特定的信號(hào)，可以被特定的動(dòng)物、植物宿主受體識(shí)別。例如，PG亞基中包含的m-DAP是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中先天免疫受體Nod1的激活劑，二肽單體是Nod2的激活劑［46］。而PG球囊在細(xì)胞周質(zhì)中發(fā)生的規(guī)則性翻轉(zhuǎn)，可以提供各種PG激活劑。

炭疽桿菌（Bacillus anthraci）屬于需氧芽胞桿菌屬，能引起羊、牛、馬等動(dòng)物及人類的炭疽病，它曾被帝國(guó)主義作為致死戰(zhàn)劑之一。Sun 等［48］證明，該菌造成的G+敗血癥中，PG碎片是引發(fā)系統(tǒng)性炎癥的原因［47］，2013年，他們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微技術(shù)確定了PG碎片對(duì)人類血小板的激活作用，發(fā)現(xiàn)其會(huì)誘發(fā)血小板凝集。該菌PG碎片是人血漿中補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的有效激活劑，也是血小板的有效激活劑，如果PG碎片與抑制PG的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，將引起凝集功能紊亂，引發(fā)病菌感染。2014年文獻(xiàn)也展示，一些G+致病菌的PG水解酶通過(guò)“修剪”PG碎片，隱藏這些炎癥分子，使其不被果蠅的PG識(shí)別蛋白（PGRPs）識(shí)別。并且PG水解酶的活性并不局限于生產(chǎn)者細(xì)胞，還可以改變相鄰細(xì)菌的表面，促進(jìn)寄生在該宿主的所有菌體存活［49］。所以PG水解酶在調(diào)節(jié)免疫激活中的作用可能遠(yuǎn)大于人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)的程度。

3.8 PG水解酶可影響菌體運(yùn)動(dòng)能力和感受能力

PG水解酶參與形成細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官——鞭毛，并在其運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。許多PG水解酶缺陷型突變株細(xì)胞分散性降低，具體表現(xiàn)為單細(xì)胞大小不變，但多個(gè)單細(xì)胞之間交聯(lián)成不規(guī)則的長(zhǎng)鏈，與正常的可以自由運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞相比，串聯(lián)在一起的細(xì)胞具有不對(duì)稱的趨向性，導(dǎo)致群體運(yùn)動(dòng)能力降低。

野生型B. subtilis細(xì)胞以短鏈狀或者單細(xì)胞的形式存在，尤其在穩(wěn)定期主要以單細(xì)胞形式存在，這有助于細(xì)胞彼此分散并趨向營(yíng)養(yǎng)富集的環(huán)境。B. subtilis中有5種酶參與了細(xì)胞分離：酰胺酶LytC、氨基葡糖苷酶LytD、DL-肽鏈內(nèi)切酶II家族的兩個(gè)成員LytE和LytF及自溶素YwbG。通過(guò)插入突變的方法構(gòu)建B. subtilis 168的多個(gè)突變體發(fā)現(xiàn)，失活的PG水解酶種類越多，細(xì)胞越容易聚集成長(zhǎng)鏈：剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，突變株SH115（ΔlytC）和SH119（ΔlytD）形成的菌鏈稍長(zhǎng)與野生型菌株；雙突變株SH128（ΔlytCΔlytD）則形成非常長(zhǎng)的菌鏈，橫跨顯微鏡的多半個(gè)視野并常常彼此交錯(cuò)形成的菌塊；突變株SH131（ΔlytCΔlytDΔsigD）與SH128在顯微鏡下觀察到的表型相似，但前者在液體培養(yǎng)基中已經(jīng)出現(xiàn)了肉眼可見(jiàn)的菌塊，說(shuō)明出現(xiàn)了更明顯的菌體聚集現(xiàn)象［13，50］。另有研究顯示，PG水解酶缺陷型突變菌不能游動(dòng)，而自溶素LytC和LytD、肽鏈內(nèi)切酶LytF的表達(dá)跟鞭毛、趨藥性基因的表達(dá)是共調(diào)節(jié)的，調(diào)節(jié)基因?yàn)閟igD和sinR；此外，LytC的失活可引起細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)能力降低［13］，說(shuō)明PG水解酶確實(shí)影響著菌體的能動(dòng)性。

除上述作用之外，PG水解酶還參與菌體致病性、毒力、潛伏期調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等一系列活動(dòng)，為細(xì)菌的整個(gè)生命過(guò)程提供不可或缺的保證。

4 芽胞桿菌PG水解酶的應(yīng)用前景及展望

4.1 抗菌藥物

迄今已有100多種抗菌藥物運(yùn)用于臨床，然而，細(xì)菌的抗藥性和耐藥性不斷增強(qiáng)，新發(fā)現(xiàn)的抗生素卻越來(lái)越少，致使慢性細(xì)菌感染成為最令人頭疼的問(wèn)題。PG水解酶可引起細(xì)菌代謝紊亂，最終發(fā)生自溶，因此具有十分理想的應(yīng)用前景。

芽胞桿菌是許多疾病的病原菌，如食入性疾病、吸入性炭疽病等，目前臨床上主要采用聯(lián)合使用抗生素的方法治療這些感染，但是這些疾病多為芽胞引起，而芽胞皮層的PG具有維護(hù)芽胞休眠、延長(zhǎng)芽胞生命的作用，所以治療效果并不理想。芽胞桿菌自身會(huì)產(chǎn)生PG水解酶，它們可以破壞細(xì)胞壁或降解芽胞皮層，最終導(dǎo)致細(xì)菌自溶、將芽胞暴露在外界環(huán)境中，降低其生存力。此外，一些PG水解酶能水解致病菌中的黏多糖，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解，還有一些PG水解酶可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活，具有抗菌 、消炎、抗病毒等作用。因此，PG水解酶具有潛在的抗感染藥用價(jià)值，而這方面的利用現(xiàn)在還沒(méi)有深入的研究。

4.2 細(xì)菌殺蟲蛋白的保護(hù)

細(xì)菌的一些代謝產(chǎn)物本身具有很高的利用價(jià)值，但是由于菌體的裂解，使其喪失了天然保護(hù)層，暴露在外界環(huán)境中而很快失活。如蘇云金芽胞桿菌雖是目前世界上應(yīng)用最廣泛的商業(yè)化生物殺蟲劑［51］，但是Bt在田間的應(yīng)用仍面臨很多問(wèn)題，其中最主要的一個(gè)便是殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPS）穩(wěn)定性低，持效期短，容易被外界環(huán)境因素（如UV、雨水、溫度、干燥等）破壞而失活。隨著科學(xué)的發(fā)展，一些新穎的技術(shù)已陸續(xù)應(yīng)用到殺蟲蛋白保護(hù)方面，如本課題組制備了納米到微米級(jí)的包裹Cry蛋白的微膠囊，并檢測(cè)了其對(duì)外界環(huán)境的抗性及殺蟲活性，結(jié)果顯示在不影響其殺蟲活性的條件下，微膠囊能有效地保護(hù)殺蟲蛋白不受外界環(huán)境的影響，大大提高了殺蟲蛋白的穩(wěn)定性和抗逆性，這一創(chuàng)新和突破為Cry蛋白的商業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［44，52］。保護(hù)殺蟲蛋白的另一天然途徑即是：研究一種方式，在不影響芽胞和晶體形成的情況下，阻礙Bt細(xì)胞壁的降解，為殺蟲蛋白包裹上天然的保護(hù)層，調(diào)節(jié)PG水解酶的活性是實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的一個(gè)理想途徑，可以構(gòu)建關(guān)鍵性PG水解酶的突變株，使其在細(xì)胞裂解時(shí)期，細(xì)胞壁不能發(fā)生自溶，芽胞和晶體蛋白不能被釋放，從而達(dá)到保護(hù)晶體蛋白的功能。

4.3 作為防腐劑使用

PG水解酶具有高度特異性，對(duì)人體來(lái)說(shuō)是一種無(wú)毒、無(wú)副作用的蛋白質(zhì)；但是對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，有時(shí)起著殺傷性的作用，因此可用作天然的食品防腐劑。

4.4 作為工具酶

PG水解酶可以在不損傷菌體內(nèi)其他物質(zhì)的條件下消化細(xì)胞壁，從而釋放壁內(nèi)原生質(zhì)體。與其他方法相比，PG水解酶的作用更加溫和，不會(huì)對(duì)原生質(zhì)體造成機(jī)械損傷，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。因此，PG水解酶是基因工程、細(xì)胞工程中必不可少的工具酶，尤其在細(xì)胞融合過(guò)程中，發(fā)揮著不可替代的作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Development of Functions of Peptidoglycan Hydrolase Produced by Bacillus

Wang Dandan Guo Shuyuan
（School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081）

Over the years， peptidoglycan hydrolases are considered destructive roles， for example the phage lysis host use them to release the virus particles， some bacterias dissolve their competitors， etc. But in recent years， with the continuous research depth found：in cell growth and metabolism process， its positive roles are more important. This paper reviewed the functions of peptidoglycan hydrolase in Bacillus throughout the cell life course， including cell growth， division， motility， sporulation and spore germination， protein secretion， information transmission， innate immunity and other aspects， laid the theoretical foundation for the study of peptidoglycan hydrolases and cell metabolism in Bacillus and the other microorganism.

Bacillus；peptidoglycan；peptidoglycan hydrolase；functions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.006

2014-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171911）

王丹丹，女，碩士研究生，研究方向：芽胞桿菌分泌蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：dandan.quan@126.com

郭淑元，女，博士，副教授，研究方向：病原微生物與宿主間作用的分子機(jī)制；E-mail：guosy@bit.edu.cn