斯達(dá)油脂酵母中自噬與油脂積累的關(guān)聯(lián)性分析

韓冰 楊琴 崔清華

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091）

斯達(dá)油脂酵母中自噬與油脂積累的關(guān)聯(lián)性分析

韓冰 楊琴 崔清華

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091）

旨在證明斯達(dá)油脂酵母中自噬參與油脂積累過(guò)程。在不同油脂積累水平下，檢測(cè)相關(guān)自噬基因的表達(dá)，觀察自噬與油脂積累是否有潛在相關(guān)性；用自噬促進(jìn)劑促進(jìn)自噬后，觀察酵母油脂積累水平是否有差異。結(jié)果表明，與油脂低積累水平相比，在油脂高積累條件下，斯達(dá)油脂酵母自噬水平較低；用自噬促進(jìn)劑處理后，酵母油脂積累降低。在斯達(dá)油脂酵母中，自噬與油脂積累成負(fù)相關(guān)性，自噬水平的提高會(huì)使酵母中油脂積累降低。

自噬；斯達(dá)油脂酵母；油脂積累；泛素樣共軛體系

細(xì)胞自噬（autophagy）是真核細(xì)胞中高度保守的細(xì)胞內(nèi)自身降解的代謝過(guò)程［1］，通常細(xì)胞自噬的發(fā)生主要是將部分胞漿和壞死或衰老的細(xì)胞器隔離在具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊狀自噬體中，通過(guò)自噬體運(yùn)輸，將這些細(xì)胞成分運(yùn)送到降解性的細(xì)胞器（如動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體和植物細(xì)胞的液泡）中進(jìn)行分解，分解產(chǎn)生的大分子物質(zhì)進(jìn)一步回收利用。自噬是細(xì)胞內(nèi)自我更新的重要途徑，對(duì)細(xì)胞的生命維持和細(xì)胞繁殖具有重要的意義。在真核細(xì)胞中，主要存在3種類(lèi)型的自噬，即大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。這些自噬過(guò)程不僅有明顯的功能分工，而且它們的作用機(jī)理顯著不同［2］。由于在小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬的研究進(jìn)展一直比較緩慢，一般所說(shuō)的自噬通常指的是大自噬。大自噬的發(fā)生主要是通過(guò)自噬相關(guān)蛋白Atg（Autophagy-related genes）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一般來(lái)說(shuō)，大自噬主要涉及兩個(gè)過(guò)程：自噬的誘導(dǎo)（圖1-A）和自噬體的形成（圖1-B）。在自噬體的形成和成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是兩個(gè)自噬泛素樣共軛體系：Atg8-PE（磷脂酰乙醇胺）和Atg12-Atg5-Atg16系統(tǒng)［3］。細(xì)胞自噬水平一般通過(guò)共軛體系的表達(dá)量來(lái)衡量。Atg8-PE體系的形成是通過(guò)新合成的Atg8蛋白的C末端甘氨酸殘基在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下暴露出來(lái)，隨后在泛素活化樣酶（E1）Atg7和泛素結(jié)合樣酶（E2） Atg3的作用下激活A(yù)tg8，并通過(guò)甘氨酸與PE結(jié)合［4］。此外，新合成的Atg12蛋白在E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg10的作用下與Atg5結(jié)合，最終Atg12-Atg5綴合物與Atg16結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16體系。

圖1 自噬過(guò)程

真核細(xì)胞自噬的發(fā)生通常是程序化的調(diào)控過(guò)程，特別是由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TOR（Target of rapamycin）介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路，在自噬的發(fā)生過(guò)程中經(jīng)常起著主導(dǎo)作用。在正常營(yíng)養(yǎng)條件下，TOR處于激活狀態(tài)，細(xì)胞自噬受到抑制；當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)饑餓的條件下，TOR被抑制，使得Atg13與Atg1、 Atg17的親和力上升，形成大量的Atg1-Atg13-Atg17激酶復(fù)合物，這些激酶復(fù)合物進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞自噬增強(qiáng)［5］。除了TOR信號(hào)通路，磷脂酰肌醇-3-激酶（PtdIns3K）復(fù)合物I也對(duì)細(xì)胞自噬起著非常重要的調(diào)控作用。PtdIns3K復(fù)合物I是一種脂質(zhì)激酶，包含4種組分，即Vps34、Vps15、Vps30/Atg6和Atg14［6］。PtdIns3K復(fù)合物I定位到PAS（Preautophagosomal structure/Phagophore assembly site）位點(diǎn)（自噬體形成的位點(diǎn)）并形成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns（3）P）進(jìn)而通過(guò)PtdIns（3）P募集自噬體形成必須的Atg蛋白。PtdIns（3）P主要的下游蛋白是Atg18和Atg21，Atg2-Atg18復(fù)合體在自噬體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用。

自噬通常參與細(xì)胞的發(fā)育和分化、維護(hù)細(xì)胞的生命以及調(diào)節(jié)生命的延長(zhǎng)等重要的生理過(guò)程。最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬可能與油脂代謝有緊密的聯(lián)系。Lapierre等［7］在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，自噬作用參與了線蟲(chóng)油脂代謝，通過(guò)清理細(xì)胞內(nèi)多余脂肪，促進(jìn)了能量的重新利用，最終延長(zhǎng)了機(jī)體的壽命；Heaton和Randall［8］研究發(fā)現(xiàn)登革病毒能夠通過(guò)調(diào)控寄主自噬來(lái)提高油脂代謝水平，進(jìn)而產(chǎn)生大量ATP提供病毒復(fù)制的能量；Vescovo等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以抵消由丙型肝炎病毒引起的油脂代謝改變，自噬的中斷會(huì)促進(jìn)攜帶丙型肝炎病毒病人脂肪肝的發(fā)展；特別是Singh等［10］在小鼠的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，自噬參與了脂滴中油脂的降解，并且提出了一個(gè)“脂類(lèi)自噬”的模型，在調(diào)控通路的作用下自噬泛素樣共軛體系會(huì)在脂滴外膜上聚集并包裹著一部分脂滴形成“脂類(lèi)自噬體”，脂類(lèi)自噬體包裹著含有三酰甘油的脂滴與溶酶體融合并被溶酶體內(nèi)的水解酶水解形成脂肪酸，隨后脂肪酸在線粒體內(nèi)通過(guò)β-氧化為細(xì)胞提供能量。這些在動(dòng)物細(xì)胞中的研究都預(yù)示著自噬在油脂代謝中的主要作用是通過(guò)降解脂肪來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，Zhang等［11］的研究發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)油酵母-圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）中，在細(xì)胞增殖和油脂累積過(guò)程中自噬相關(guān)基因，如Atg1、Atg2、Atg8和Atg20，表達(dá)水平顯著上調(diào)，強(qiáng)烈預(yù)示了這些自噬相關(guān)基因可能參與了油脂的生物合成過(guò)程。但是對(duì)自噬相關(guān)基因參與油脂累積的代謝機(jī)理至今知之甚少。在酵母中，自噬相關(guān)基因是否參與調(diào)控了油脂的生物合成還不清楚。

斯達(dá)油脂酵母（Lipomyces starkeyi）是一種重要的產(chǎn)油酵母，由于細(xì)胞能夠利用多樣的碳源，高效累積儲(chǔ)存油脂（單細(xì)胞油脂累積能夠達(dá)到干重65%），斯達(dá)油脂酵母在工業(yè)上利用微生物工程化產(chǎn)油的生產(chǎn)實(shí)踐中受到高度關(guān)注［12］。本研究通過(guò)調(diào)查斯達(dá)油脂酵母在油脂累積過(guò)程中自噬泛素樣共軛體系基因的表達(dá)規(guī)律，揭示酵母中細(xì)胞自噬與油脂積累的內(nèi)在聯(lián)系，不僅有助于探討在酵母中自噬相關(guān)基因參與調(diào)控油類(lèi)代謝的分子機(jī)理，而且對(duì)提高產(chǎn)油效率的斯達(dá)油脂酵母菌株工程化改良具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 斯達(dá)油脂酵母AS 2.1560，由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）提供，保藏于-80℃中。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基成分包括：酵母膏10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂15 g/L（固體培養(yǎng)基）?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基［13］成分包括：KH2PO412.5 g/L；Na2HPO41 g/L；（NH4）2SO40.5 g/L；MgSO4·7H2O 2.5 g/L；CaCl2·2H2O 0.25 g/L；酵母浸粉 1.9 g/L；葡萄糖 36 g/L；微量元素溶液 0.625 mL；pH5.0。其中微量元素溶液的成分：FeSO4·7H2O 16 g/L；MnSO4·H2O 4 g/L；Al2（SO4）3·18H2O 5.52 g/L；CoCl2·6H2O 2.92 g/L；ZnSO4·7H2O 0.8 g/L；Na2MoO4·2H2O 0.8 g/L；CuCl2·2H2O 0.4 g/L；H3BO30.2 g/L；KI 1.6 g/L，所有成分溶于5 mol/L的鹽酸中?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基各成分溶解于去離子水中，高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 用接種針蘸取少量菌液，在YPD平板上劃線培養(yǎng)直至出現(xiàn)單克?。s5 d），挑取單克隆于裝有30 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中，30℃，200 r/min培養(yǎng)2 d。吸取500 μL菌液于新的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)2 d，在600 nm處檢測(cè)菌液OD值并根據(jù)OD值吸取一定量的菌液于2 mL EP管中，離心收集并用滅菌水洗2遍，然后分別轉(zhuǎn)移到裝有30 mL碳氮比30和150發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中，使菌液起始OD值為0.4，30℃，200 r/min培養(yǎng)，每24 h收集菌液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。不同碳氮比培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上配制的，在其他成分不變的前提下，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)中氮源（酵母浸粉和硫酸銨）的含量使得碳元素和氮元素的比值為30和150（硫酸銨和酵母浸粉同比例增加或減少）。

1.2.2 Atg蛋白的鑒定與序列分析 以釀酒酵母數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.yeastgenome.org/）和擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）里已知的Atg蛋白序列作為探針，在斯達(dá)油脂酵母數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome. jgi.doe.gov/pages/blast.jsf？db=Lipst1_1）中進(jìn)行blastp比對(duì)，對(duì)于具有顯著E值（＜10-5）的蛋白被認(rèn)為是潛在的斯達(dá)油脂酵母Atg蛋白。同樣的方法用于鑒定畢赤酵母（Pichia pastoris）潛在的Atg蛋白。在在線服務(wù)器GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）中，通過(guò)比對(duì)釀酒酵母、畢赤酵母和斯達(dá)油脂酵母共軛體系中自噬相關(guān)基因的基因組和cDNA序列，檢測(cè)這些基因的外顯子和內(nèi)含子的分布。

1.2.3 油脂含量的檢測(cè) 采用磷酸-香草醛法檢測(cè)油脂含量［14］。取2 mL菌液，12 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗2次。定容至2 mL，取50 μL（對(duì)照取蒸餾水），加入一帶塞試管中，加入18 mol/L H2SO41 mL，沸水浴中孵化10 min，常溫水浴5 min，加入2.5 mL磷酸-香草醛試劑，37℃保溫1 h，常溫水浴10 min，于530 nm測(cè)其OD值。剩余的1.95 mL菌液烘干，測(cè)量干重。油脂含量=（0.10718+3.63×吸光度）/干重。

1.2.4 自噬共軛系統(tǒng)的表達(dá)檢測(cè) 采取液氮研磨法提取RNA。離心收集一定量的酵母菌液，用蒸餾水洗滌3遍，離心收集菌體并放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨將研磨后的菌體轉(zhuǎn)移到裝有1 mL Trizol的試管中，在渦旋儀上震蕩30 s，室溫靜置5 min，4℃，12 000 r/min離心15 min；取上清加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，靜置5 min；4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，加入等量的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清；待乙醇揮發(fā)完全，加入適量RNase free水溶解。吸取少量提取的RNA通過(guò)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，確定提取的RNA無(wú)明顯降解（有3個(gè)明亮條帶），通過(guò)Thermo Scientific NanoDrop 2000進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，A260/A280值在1.8-2.0之間說(shuō)明RNA純度較好。提取的RNA通過(guò)寶生物公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系中加入1 μg的RNA模板，逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)Thermo Scientific NanoDrop 2000檢測(cè)體系中cDNA濃度，并將所有樣品的cDNA濃度稀釋到100 ng/μL。通過(guò)Real-time PCR的方法檢測(cè)自噬共軛體系轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，使用的儀器為Applied Biosystems7300，使用的熒光染料為寶生物的SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），PCR體系為20 μL，cDNA模板量加入200 ng。共軛體系所涉及到的基因引物序列如表1所示，引物擴(kuò)增片段為80-150 bp之間，Tm值為60℃左右。

表1 Real-time PCR引物

1.2.5 自噬誘導(dǎo)劑-雷帕霉素處理對(duì)油脂累積的影響 為了檢測(cè)自噬活性增加后對(duì)油脂累積的影響，在斯達(dá)油脂酵母培養(yǎng)基中增加了細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑-雷帕霉素。首先將雷帕霉素溶解于DMSO中（使其儲(chǔ)存濃度為10 000 μmol/L），再分別加入到碳氮比30和150培養(yǎng)基中，使雷帕霉素在培養(yǎng)基中的濃度為0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L（不同濃度的雷帕霉素溶解于相同體積的DMSO中），揺菌培養(yǎng)4 d后，檢測(cè)細(xì)胞的油脂含量。

2 結(jié)果

2.1 斯達(dá)油脂酵母中自噬相關(guān)基因的鑒定與序列分析

基于斯達(dá)油脂酵母全基因組序列，以釀酒酵母和擬南芥中已知的Atg基因氨基酸序列為搜索探針，以序列相似性E值＜10-5閾值為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒別了13個(gè)潛在的斯達(dá)油脂酵母Atg基因（表2），根據(jù)這些基因在釀酒酵母和擬南芥自噬過(guò)程中的作用，13個(gè)潛在的斯達(dá)油脂酵母Atg基因作用于不同自噬過(guò)程，包括Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg8、Atg12參與形成以Atg8和Atg12為主體的自噬泛素樣共軛體系，Atg1、Atg6、Atg13、Atg20和Vps15、Vps34參與到上游的自噬調(diào)控通路中，Atg2、Atg9和Atg18參與到Atg9循環(huán)系統(tǒng)中。

通常，自噬泛素樣共軛體系在自噬過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。參與這些過(guò)程的Atg基因結(jié)構(gòu)，尤其是外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）在基因組中的分布規(guī)律，包括數(shù)量和發(fā)生位置，能夠反映基因的產(chǎn)生和進(jìn)化過(guò)程［15］。為了進(jìn)一步檢查酵母自噬泛素樣共軛體系在基因結(jié)構(gòu)上的保守性，我們根據(jù)畢赤酵母的基因組序列，鑒別了畢赤酵母泛素樣共軛體系相關(guān)的基因，比較分析了釀酒酵母、畢赤酵母和斯達(dá)油脂酵母泛素樣共軛體系基因的結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)含子的數(shù)目和位置、特征性位點(diǎn)。如圖2所示，釀酒酵母6個(gè)基因都沒(méi)有內(nèi)含子，畢赤酵母的Atg8和Atg12各有1個(gè)內(nèi)含子，而斯達(dá)油脂酵母的每個(gè)Atg基因都有內(nèi)含子，其中Atg3和Atg12的內(nèi)含子數(shù)為1個(gè)，Atg4、Atg5和Atg8的內(nèi)含子數(shù)均為3個(gè)，Atg7的內(nèi)含子數(shù)為5個(gè)。比較斯達(dá)油脂酵母和畢赤酵母內(nèi)含子發(fā)生的位置發(fā)現(xiàn)，盡管畢赤酵母的Atg8和Atg12各只有一個(gè)內(nèi)含子，但他們發(fā)生的位置和斯達(dá)油脂酵母相似。通過(guò)比對(duì)在釀酒酵母中每個(gè)基因已經(jīng)鑒別到的特征位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，斯達(dá)油脂酵母和畢赤酵母都具有相似的位點(diǎn)，包括Atg3和Atg7中的半胱氨酸位點(diǎn)（C），Atg5中的賴(lài)氨酸受體位點(diǎn)（K），Atg8和Atg12上參與共價(jià)結(jié)合的保守甘氨酸位點(diǎn)（G）（畢赤酵母未檢出保守甘氨酸位點(diǎn)），以及Atg4蛋白水解活性的半胱氨酸位點(diǎn)（C）。這些結(jié)果說(shuō)明酵母共軛體系蛋白的保守性很強(qiáng)，可能與Atg蛋白相似的功能有關(guān)。然而，這些基因序列的長(zhǎng)度以及特征位點(diǎn)的位置在3個(gè)酵母中有很大的變異，特別是斯達(dá)油脂酵母在基因結(jié)構(gòu)上和其它兩個(gè)酵母有更大的差異，反映了在系統(tǒng)發(fā)生上斯達(dá)油脂酵母和其它兩種酵母的關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2 斯達(dá)油脂酵母自噬相關(guān)蛋白

2.2 斯達(dá)油脂酵母油脂積累過(guò)程中泛素樣共軛體系基因的表達(dá)分析

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞油脂累積通常受到培養(yǎng)基中的碳氮比的強(qiáng)烈誘導(dǎo)［16］。在我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，斯達(dá)油脂酵母在碳氮比為30和150的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)良好、且累積油脂呈現(xiàn)了很大的差異。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了斯達(dá)油脂酵母分別在碳氮比為30和150的培養(yǎng)條件下，不同時(shí)期油脂的累積規(guī)律（圖3）顯示，油脂快速累積主要發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的前4 d，在培養(yǎng)第4天時(shí)細(xì)胞干重的油脂含量相差很大，在碳氮比為30和150的培養(yǎng)條件下油脂累積分別為31.2%和49.4%。

為探討斯達(dá)油脂酵母油脂的累積是否與自噬相關(guān)，我們同時(shí)檢測(cè)了在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，泛素樣自噬共軛體系相關(guān)基因（包括Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg8和Atg12）隨著油脂的積累在轉(zhuǎn)錄水平上基因的表達(dá)變化。由于油脂快速累積主要發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的前4 d，因此我們集中檢查了斯達(dá)油脂酵母細(xì)胞在前4 d的表達(dá)規(guī)律。將碳氮比150條件下培養(yǎng)1 d的細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的表達(dá)量設(shè)為1，其它時(shí)期基因的表達(dá)量和培養(yǎng)1 d的比較，獲得基因的相對(duì)表達(dá)量。如圖4所示，在碳氮比為30培養(yǎng)下條件6個(gè)Atg基因的表達(dá)均高于碳氮比為150培養(yǎng)條件下基因的表達(dá)，說(shuō)明斯達(dá)油脂酵母在高的碳氮比培養(yǎng)下Atg基因的表達(dá)降低。在碳氮比為30 的培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Atg3、Atg4、Atg5和Atg7的基因表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，而Atg8呈上升趨勢(shì)，Atg12在開(kāi)始階段呈上升趨勢(shì)，隨后開(kāi)始下降；在碳氮比為150的培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，6個(gè)基因的表達(dá)量變化不大。

圖2 斯達(dá)油脂酵母（Ls）、畢赤酵母（Pp） 和釀酒酵母（Sc）自噬共軛體系基因結(jié)構(gòu)圖

2.3 促進(jìn)自噬可降低油脂積累

雷帕霉素（rapamicin）作為T(mén)OR的抑制劑，有助于Atg13的去磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Atg1-Atg13-Atg17激酶復(fù)合物的形成并誘導(dǎo)自噬。為了檢測(cè)細(xì)胞自噬對(duì)油脂累積的影響，我們利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，分別在碳氮比30和碳氮比150培養(yǎng)條件下促進(jìn)酵母的自噬活動(dòng)，培養(yǎng)4 d后檢測(cè)不同雷帕霉素處理濃度的酵母生物量（通過(guò)檢測(cè)OD值），發(fā)現(xiàn)酵母生物量變化不大，說(shuō)明不同濃度的自噬誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響非常有限。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的油脂含量，結(jié)果（圖5）顯示，在碳氮比30和碳氮比150的培養(yǎng)條件下，隨著雷帕霉素處理濃度的增加斯達(dá)油脂酵母的油脂含量呈下降趨勢(shì)，在低濃度（如1和10 nmol/L）的雷帕霉素處理下，斯達(dá)油脂酵母細(xì)胞油脂累積沒(méi)有顯著變化，而在高濃度（如100-10 000 nmol/L）的雷帕霉素處理下，油脂累積顯著降低，特別是在碳氮比150條件下，高濃度的雷帕霉素處理大幅度降低了斯達(dá)油脂酵母細(xì)胞的含油量。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明在斯達(dá)油脂酵母中細(xì)胞自噬活性增加確實(shí)能夠減少細(xì)胞儲(chǔ)存油脂的累積。

圖3 不同碳氮比條件下的油脂累積曲線

圖4 自噬共軛體系相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

本研究基于斯達(dá)油脂酵母的基因組序列，利用生物信息學(xué)方法鑒別了參與細(xì)胞自噬的13個(gè)Atg基因，集中分析了斯達(dá)油脂酵母泛素樣共軛體系基因的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)與釀酒酵母、擬南芥Atg基因進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，斯達(dá)油脂酵母不僅存在自噬過(guò)程中所涉及到的關(guān)鍵Atg基因，而且自噬泛素樣共軛體系基因的保守位點(diǎn)與釀酒酵母完全相同，這說(shuō)明真核生物中自噬是一個(gè)高度保守的過(guò)程。然而基因結(jié)構(gòu)的顯著差異，說(shuō)明斯達(dá)油脂酵母自噬共軛體系基因在系統(tǒng)發(fā)生上與畢赤酵母和釀酒酵母關(guān)系較遠(yuǎn)。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)油酵母的培養(yǎng)過(guò)程中碳氮比能夠顯著影響細(xì)胞的油脂累積，增加碳源或減少氮源都能促進(jìn)產(chǎn)油酵母的油脂累積。本研究利用減少氮源的方式來(lái)調(diào)節(jié)碳氮比，在高碳氮比的條件下（碳氮比為150）斯達(dá)油脂酵母細(xì)胞累積油脂顯著增加。在高碳氮比培養(yǎng)條件下，隨著細(xì)胞油脂的累積，參與自噬相關(guān)基因的表達(dá)均顯著低于低碳氮比條件下的細(xì)胞培養(yǎng)，可能預(yù)示著隨著細(xì)胞自噬活動(dòng)降低確實(shí)減少了油體的降解，從而增加了油脂的累積。然而，在高碳氮比條件下，實(shí)際上相當(dāng)于減少了培養(yǎng)基中的氮源，使細(xì)胞處于缺氮的逆境中，由于氮源是蛋白質(zhì)合成的主要成份，而細(xì)胞自噬活動(dòng)主要是依靠Atg蛋白的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，本研究在高碳氮比條件下Atg基因的表達(dá)降低也可能是由于氮源的缺乏而引起的。

圖5 雷帕霉素處理對(duì)斯達(dá)油脂酵母的油脂含量影響

在利用酵母細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑增加Atg活性的試驗(yàn)中，結(jié)果顯示了在一定濃度范圍內(nèi)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素不影響斯達(dá)油脂酵母的細(xì)胞生長(zhǎng)，但隨著雷帕霉素的增加細(xì)胞油脂的累積顯著降低，說(shuō)明酵母細(xì)胞自噬活動(dòng)可能直接降解細(xì)胞內(nèi)油體，而減少細(xì)胞油脂累積。從本研究結(jié)果來(lái)看，在產(chǎn)油酵母油脂累積過(guò)程中，細(xì)胞自噬的活動(dòng)和油脂累積呈負(fù)相關(guān)，暗示了細(xì)胞自噬相關(guān)基因確是通過(guò)降解活動(dòng)參與了產(chǎn)油酵母的油脂代謝活動(dòng)。然而，自噬活動(dòng)在酵母細(xì)胞繁殖和生長(zhǎng)過(guò)程中參與和調(diào)控了廣泛的代謝和生理過(guò)程，且生理調(diào)控機(jī)制通常是復(fù)雜的［17］，而且本研究也缺乏在蛋白水平上引起自噬活動(dòng)變化的證據(jù)，自噬相關(guān)基因?qū)τ椭鄯e的調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)油脂合成通路中的關(guān)鍵酶，從而減弱了油脂累積，還是直接參與油體的降解減少油脂的累積，這些問(wèn)題尚不清楚，有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究基于斯達(dá)油脂酵母的全基因組鑒別了13個(gè)參與細(xì)胞自噬過(guò)程的Atg基因，針對(duì)泛素樣共軛體系的自噬基因，結(jié)合其它酵母自噬基因的序列結(jié)構(gòu)，集中分析、比較了斯達(dá)油脂酵母泛素樣共軛體系基因的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)雖然酵母自噬基因的功能位點(diǎn)很保守，但在物種間基因的結(jié)構(gòu)變異較大。在不同碳氮比的培養(yǎng)條件下，斯達(dá)油脂酵母細(xì)胞油脂累積和泛素樣共軛體系基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)人為調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞油脂累積和自噬活性呈負(fù)相關(guān)的規(guī)律，強(qiáng)烈地預(yù)示著酵母細(xì)胞自噬活動(dòng)參與（或影響）了油脂累積過(guò)程。

［1］Reggiori F， Klionsky DJ. Autophagy in the eukaryotic cell［J］. Eukaryotic Cell， 2002， 1（1）：11-21.

［2］Klionsky DJ， Meijer AJ， Codogno P， et al. Views and commentaries autophagy and p70S6 kinase［J］. Autophagy， 2005， 1（1）：59-61.

［3］ Tanida I， Ueno T， Kominami E. LC3 conjugation system in mammalian autophagy［J］. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology， 2004， 36（12）：2503-2518.

［4］ Kirisako T， Ichimura Y， Okada H， et al. The reversible modification regulates the membrane-binding state of Apg8/Aut7 essential for autophagy and the cytoplasm to vacuole targeting pathway［J］. The Journal of Cell Biology， 2000， 151（2）：263-276.

［5］ Cheong H， Nair U， Geng J， et al. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae［J］. Molecular Biology of the Cell， 2008， 19（2）：668-681.

［6］Kihara A， Noda T， Ishihara N， et al. Two distinct Vps34 phosphatidylinositol 3-kinase complexes function in autophagy and carboxypeptidase Y sorting in Saccharomyces cerevisiae［J］. The Journal of Cell Biology， 2001， 152（3）：519-530.

［7］ Lapierre LR， Gelino S， Meléndez A， et al. Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less C. elegans［J］. Current Biology， 2011， 21（18）：1507-1514.

［8］Heaton NS， Randall G. Dengue virus-induced autophagy regulates lipid metabolism［J］. Cell Host & Microbe， 2010， 8（5）：422-432.

［9］Vescovo T， Romagnoli A， Perdomo AB， et al. Autophagy protects cells from HCV-induced defects in lipid metabolism［J］. Gastroenterology， 2012， 142（3）：644-653.

［10］Singh R， Kaushik S， Wang Y， et al. Autophagy regulates lipid metabolism［J］. Nature， 2009， 458（7242）：1131-1135.

［11］Zhu Z， Zhang S， Liu H， et al. A multi-omic map of the lipid-producing yeast Rhodosporidium toruloides［J］. Nature Communications， 2012， 3：1112.

［12］郭書(shū)賢， 王振偉， 劉歡， 等. 斯達(dá)油脂酵母發(fā)酵食品生產(chǎn)廢水產(chǎn)油脂的研究［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2010 （4）：245-252.

［13］Angerbauer C， Siebenhofer M， Mittelbach M， et al. Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production［J］. Bioresource Technology， 2008， 99（8）：3051-3056.

［14］李仁民， 王菊芳， 馬爽， 等.利用脂肪酸合成酶抑制劑和磷酸香草醛反應(yīng)篩選高產(chǎn)油脂酵母菌［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2008，35（4）：545-549.

［15］Betts MJ， Guigó R， Agarwal P， et al. Exon structure conservation despite low sequence similarity：a relic of dramatic events in evolution？［J］. The EMBO Journal， 2001， 20（19）：5354-5360.

［16］ Holdsworth JE， Veenhuis M， Ratledge C. Enzyme activities in oleaginous yeasts accumulating and utilizing exogenous or endogenous lipids［J］. Journal of General Microbiology， 1988，134（11）：2907-2915.

［17］ Komatsu M， Ueno T， Waguri S， et al. Constitutive autophagy：vital role in clearance of unfavorable proteins in neurons［J］. Cell Death & Differentiation， 2007， 14（5）：887-894.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

An Investigation of Cellular Autophagy and Oil Accumulation in the Oleaginous Yeast Lipomyces starkeyi

Han Bing Yang Qin Cui Qinghua
（The School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming 650091）

It was to prove autophagy is involved in the accumulation of lipid in Lipomyces starkeyi. Detecting the expression of autophagyrelated gene in different lipid accumulation level to determine whether autophagy is potentially involved in lipid accumulation； promoting autophagy by autophagy accelerator to observe whether there are differences in yeast lipid accumulation level. Results showed that the level of autophagy is low in high lipid accumulation condition compare with low condition. After treatment with autophagy accelerator， the lipid accumulation in yeast is reducing. In Lipomyces starkeyi， autophagy is negatively related to lipid accumulation， the improving of autophagy level will reduce the lipid accumulation in yeast.

autuphagy；Lipomyces starkeyi；oil accumulation；autophagy ubiquitin-like conjugated system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.031

2014-07-14

云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（2011C1123），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160237）

韓冰，男，碩士研究生，研究方向：自噬與油脂代謝關(guān)系的研究；E-mail：1017830953@qq.com

崔清華，女，教授，研究方向：自噬與腫瘤關(guān)系研究；E-mail：cuiqinghua@ynu.edu.cn