敏捷食酸菌腈水解酶基因在大腸桿菌中的表達

管啟旺 馬江鋒 賀愛永 姜岷 宮長斌

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料與化學工程國家重點實驗室，南京 211816）

敏捷食酸菌腈水解酶基因在大腸桿菌中的表達

管啟旺 馬江鋒 賀愛永 姜岷 宮長斌

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料與化學工程國家重點實驗室，南京 211816）

以含有敏捷食酸菌的腈水解酶基因的克隆質粒為模板，通過PCR擴增獲得長度為1 080 bp的腈水解酶（Nitrilase）基因片段。使用表達質粒pET-28-a構建表達載體，獲得重組質粒pET-Nit。對所表達的基因進行測序對比發(fā)現與GenBank所公布的基因序列比較，相似性99%，讀碼框出現2 bp的突變，但并未引起相應氨基酸突變，故不影響酶的表達與特性。將重組質粒轉化到表達宿主Escherichia coli Rosetta（DE3）感受態(tài)中，使用誘導劑IPTG對菌株進行誘導表達，獲取菌液進行SDS-PAGE分析，得知目的蛋白分子量約為41.28 kD，與預期所想的一致。酶活力分析表明，上清的比活力為3 U/mg。進一步對誘導條件進行優(yōu)化，包括誘導溫度，IPTG濃度，誘導時間等一系列條件。在最優(yōu)條件下，擴大培養(yǎng)體積，比活力可達15 U/mg，活力提高了5倍左右。

腈水解酶；敏捷食酸菌；大腸桿菌；克隆

腈水解酶（EC 3.5.5.1，Nitrilase）是一類催化腈類物質水解的特異性酶，屬于腈水解酶超家族［1］。該酶兼具有腈水合酶（EC 4.2.1.84，nitrile hydratase）催化腈類水解成酰胺，以及酰胺水解酶（EC 3.5.1.4，amidase）催化酰胺水解成羧酸和氨兩種功能，它能直接催化腈類物質水解成相應的羧酸并釋放出氨氣［2］。

腈水解酶的水解反應機制（圖1），酶促反應的中心是一個半胱氨酸殘基，半胱氨酸巰基的強親核性使得整個酶促反應類似于堿條件下的酸堿催化，整個反應包含了兩分子的水的結合與一分子氨氣的脫離［3］。腈水解酶的活性不受大多數金屬離子和螯合劑的影響，但Ag+和Hg+等重金屬離子能和巰基作用，對酶的活性有較大影響，這證明了半胱氨酸的巰基在反應中的重要作用。Brenner等［4］根據蠕蟲的NitFhit的晶體結構分析，認為腈水解酶一族的催化活性中性，是一個含谷氨酸-賴氨酸-半胱氨酸（Glu-Lys-Cys）的脆性催化三聯體（catalytic triad）。

圖1 腈水解酶（a）與腈水合酶酰胺水解酶（b）催化底物水解機制

由于腈水解酶具有高度的區(qū)域以及立體選擇性，使得該酶在化工和藥物合成等領域越來越受關注［5］。腈水解酶的作用底物主要分為以下幾類：脂肪和芳香族脂肪腈，芳香腈，脂環(huán)和雜環(huán)腈，二腈等腈類化合物。例如，研究脂肪和芳香族脂肪腈水解，用于乙醇酸的生產［6，7］；以芳腈作為底物時，萘普生、布洛芬和氟比洛芬等α-芳基丙酸化合物以及R-扁桃酸的生產［8］；脂環(huán)和雜環(huán)類的腈轉化，比較有特色的是利用紅球菌屬實現煙酸的生產以及有關擬南芥的腈水解酶用于合成吲哚-3-乙酸的研究［9］；二腈的選擇性水解比較代表性的是，普瑞巴林合成過程中手性中間體的生產［10］。

目前該酶的研究主要集中在國外，國內有關研究還處于較落后階段，有關雙腈的選擇性催化水解的文章基本較少，亟待篩選高產該類酶的菌株或通過基因手段構建相關的工程菌［11］，Acidovorax facilis ATCC 55746是目前報道的選擇性水解雙腈活力突出的菌株［12］。本研究選用在大腸桿菌中有高表現的pET系統，構建pET-Nit重組質粒，實現成功誘導表達，并對發(fā)酵產酶的誘導相關條件進行系列優(yōu)化，優(yōu)化后酶產量提高了5倍，能達到產酶的先進水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 表達質粒pET-28a和表達宿主E.coli Rosetta（DE3）由本實驗室自主保藏；敏捷食酸菌腈水解酶基因片段由上海生物工程公司合成（基因克隆在PUC57質粒上，插入位點為BamH I）。

1.1.2 主要試劑 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自BioDev公司；限制性內切酶Nde I，Sal I，DL15000 DNA Maker，Solution I高效連接酶等購自TaKaRa公司；小量質粒提取和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；PCR引物由金斯瑞合成；其余試劑為國產或者進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10（固體平板加入瓊脂粉20）。SOC培養(yǎng)基（g/L）：20胰蛋白胨，5酵母粉，0.5氯化鈉，0.2 氯化鉀，0.94氯化鎂，1.6葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和腈水解酶的克隆 根據敏捷食酸菌ATCC 55746腈水解酶基因序列（GenBank 登錄號為DQ444267.1），設計上下游擴增引物：P1：5'-GCTCATATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCCTCG -3'；P2：5'-GGTGTCGACCTTTGCTGGGACCGGTTCTT-3'。在上下游引物分別引入Nde I和Sal I酶切位點（下劃線部分），將原始基因的起始密碼子GTG改為大腸優(yōu)選的ATG，去除末端的終止密碼子使得表達蛋白帶上純化標簽，并同時在引物前方加入3個bp的保護堿基。預計擴增產物長度約為1 080 bp的基因片段。引物由金斯瑞（南京）公司合成。

提取含有敏捷食酸菌腈水解酶基因的質粒作為擴增模板，利用上述引物進行PCR擴增。PCR反應條件為：蓋溫99℃，94℃預變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，工作時間30個循環(huán)。

1.2.2 重組表達質粒的構建和測序對比 PCR產物與質粒pET-28a使用Nde I/Sal I內切酶雙酶切過夜，膠回收酶切產物。將純化的目的基因片段和線性化載體按適當比例，用Solution I高效連接酶連接過夜，使用氯化鈣轉化法進行感受態(tài)轉化。篩選陽性重組子，培養(yǎng)和提取質粒進行PCR驗證與測序。經鑒定正確的重組質粒命名為pET-Nit。通過Blast對測序結果進行對比分析。

1.2.3 腈水解酶酶液的提取 挑取重組大腸桿菌E.coli Rosetta（DE3）/pET-Nit單菌落，接種到含有50 mg/L硫酸卡那霉素的5 mL的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min過夜培養(yǎng)后，按1%接種量接種到新鮮的含有50 mg/L硫酸卡那霉素的50 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h后，加入IPTG進行誘導表達。

菌液冷凍離心（4℃，8 000 r/min，20 min），棄去上清，沉淀使用磷酸鉀緩沖液清洗（pH7.0，100 mmol/L的濃度）兩次后，超聲破碎（功率300 W，超聲3 s，間隔5 s，工作時間3 min），超聲后菌液冷凍離心（4℃，8 000 r/min，20 min）。棄去沉淀取上清液測定酶活力。

1.2.4 SDS-PAGE分析 取方法1.2.3中的酶液進行SDS-PAGE分析。采用12.5%的分離膠和4%的濃縮膠制膠，電泳后使用考馬斯亮藍R-250進行染色。以原始宿主菌和未經誘導的重組菌株的破碎上清作為對照。

1.2.5 腈水解酶活力測定 酶活力測定使用苯酚硫酸鹽顯色法，顯色液與標準液的制備方法如文獻［13］所述。取酶液20 μL，加入到10 mL含有100 mmol/L最適底物反丁烯二腈的磷酸鉀緩沖液（pH7.0，100 mmol/L）中（反丁烯二腈使用N，N-二甲基甲酰胺當助溶劑，終濃度為5%），酶促反應 30 min后取出使用硫酸銨作為標準樣，測定銨根離子的濃度。一個酶活力單位（U）定義為：每分鐘能催化1 μmol底物水解所需的酶量。

蛋白質含量測定使用Brandford法［14］，以牛血清白蛋白為標準樣。腈水解酶比活力定義為：每毫克蛋白所具有的酶活單位數。

2 結果

2.1 Nit基因的克隆與分析

擴增腈水解酶基因，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），在1 080 bp左右具有很清晰的條帶，與預期設計一致。提取質粒對目的基因測序分析，目的片段與GenBank所報道的基因相似性為99%，在酶讀碼框的第996和1 032位的堿基G和A發(fā)生突變分別突變?yōu)門和G，對應的332和343位的氨基酸仍然是纈氨酸和谷氨酸，并不影響酶的表達和性質。

圖2 目的片段PCR擴增

2.2 重組質粒的構建和表達

構建的表達質粒經Nde I/Sal I雙酶切鑒定（圖3），pET-Nit在1 080 bp左右比空載體明顯多出一個條帶，與插入目的基因大小相同，表明片段已經成功插入，重組質粒構建成功。

圖3 pET-Nit重組質粒雙酶切驗證

2.3 腈水解酶的誘導表達和SDS-PAGE分析

重組菌pET-Nit/Rosetta（DE3）經過0.2 mmol/L的IPTG在30℃誘導表達12 h后，腈水解酶比酶活為3 U/mg，而空宿主不具備酶活，未誘導的重組菌表達量幾乎為零。SDS-PAGE電泳結果顯示（圖4），重組菌株經誘導表達后在41.28 kD處有明顯的融合條帶，與預期的判斷一致，出發(fā)菌和未誘導的在該區(qū)域不具有明顯條帶。根據酶活測定和SDS-GAGE結果顯示，腈水解酶Nit已經在重組大腸桿菌中成功表達。

2.4 誘導條件優(yōu)化

通過對誘導溫度，誘導物濃度和誘導時間進行優(yōu)化，找到了工程菌的最佳產酶條件。

2.4.1 誘導溫度優(yōu)化 加入IPTG后分別在20、25、30、35和40℃下進行誘導，時間為12 h，結果顯示（圖5）低溫時候比酶活更高，這表明低溫有助于酶的正確折疊，不易形成包涵體，但是溫度過低，對菌體生長速度有限制［15］。

圖4 pET-Nit SDS-PAGE 電泳圖譜（全細胞蛋白）

圖5 誘導溫度優(yōu)化

2.4.2 IPTG濃度的優(yōu)化 分別加入0.05、0.1、0.2、0.4、0.8及1.2 mmol/L終濃度的IPTG，25℃誘導表達12 h。結果（圖6）顯示，加入量為0.2 mmol/L IPTG時菌體密度最佳，并且比酶活最高，為15 U/mg。IPTG濃度過小，表達量和菌體濃度都不夠，而IPTG濃度過大菌體量和酶活力反而下降，這表明不能為菌體代謝的高濃度的IPTG會抑制菌體生長。2.4.3 IPTG誘導時間優(yōu)化 加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25℃分別誘導4、8、12、16、20和24 h。如圖7所示，加入誘導16 h左右的比酶活達到最高值，之后酶活變化幅度很小。這表明到達一定的表達量以后，再過量的外源酶蛋白會對菌體產生負荷，部分會被菌體所水解，過度延長誘導時間不具實用意義［16］。

圖6 IPTG濃度的優(yōu)化

圖7 誘導時間優(yōu)化

經過一系列的優(yōu)化后，在200 mL裝液量的搖瓶中放大培養(yǎng)，使用25℃培養(yǎng)溫度，終濃度為0.2 mmol/的IPTG誘導表達16 h，重組菌的活力可達到15 U/mg，比優(yōu)化前提高了5倍。

3 討論

腈水解酶在醫(yī)藥、化工和有機合成等方面具有十分廣泛的應用，目前國內有關該方面的研究還處在較落后水平，且有關研究還多集中在扁桃酸、煙酸等一些比較基礎的研究層面［17］，有關化學選擇性和立體選擇性相結合的腈水解酶篩選更是鮮有耳聞，有關的酶蛋白克隆表達和分子改造等相關研究較少。在國外特別是歐洲和美國等國家，有關研究可追溯到20世紀80到90年代［18］。

pET表達系統具有乳糖誘導性能，通過α互補作用，含有該質粒菌株能利用乳糖的類似物IPTG來高表達目的蛋白［19，20］。雖然有敏捷食酸菌的腈水解酶基因克隆的相關報道［21］，但有關誘導表達和產酶的優(yōu)化研究還未見報道。本研究切除了基因自帶的啟動子，采用pET-28自帶的T7強啟動子對其進行表達，選擇了能利于稀有密碼子表達的大腸桿菌Rosetta株作為宿主菌。在優(yōu)化了一系列表達條件下，酶的表達量和活力均有提高，而質粒所帶的His-tag標簽對于蛋白純化十分有利。在酶活測定方面，本試驗測量量化到了毫克比酶活，并使用苯酚硫酸鹽顯色法，測定更加快捷和精確，有助于研究轉化反應酶用量的控制。具有化學選擇性的脂肪族腈水解酶工程菌的成功構建，為使用該菌株催化相關底物的研究，以及相關分子改造奠定了實驗基礎。

4 結論

本研究以具有化學選擇的敏捷食酸菌腈水解酶DNA作為模板，PCR擴增獲得目的片段，測序驗證所克隆的目的片段，選用pET-28a質粒作為表達載體構建表達重組質粒并轉化。對重組菌株進行誘導表達，優(yōu)化誘導條件，結果顯示經過優(yōu)化后比酶活大幅度提高，優(yōu)化后的酶比活力高達15 U/mg，比未優(yōu)化的提高了5倍。

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（責任編輯 李楠）

Expression of Nitrilase Gene from Acidovorax facilis in Escherichia coli

Guan Qiwang Ma Jiangfeng He Aiyong Jiang Min Gong Changbin
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）

Plasmid containing Acidovorax facilis gene， was used as a template， and length of 1 080 bp nitrilase（Nitrilase）gene fragment was obtained by PCR. Expressed genes were sequenced and compared to gene sequences found in GenBank. There are 2 bp mutation was found， which can not affect the expression and characterization of the enzyme. The recombinant plasmid was transformed into the Escherichia coli Rosetta（DE3）competent cell， which was induced IPTG for strain- expression. SDS-PAGE analysis was used and showed that the protein molecular weight was about 41.28 kD. Enzyme activity analysis showed that the specific activity of the supernatant was 3 U/mg. Induction conditions were optimized， including induction temperature， IPTG concentration， induction time and a series of conditions. Under optimal conditions and with the expansion of the culture volume， the specific activity can up to 15 U/mg， and activity increased by about five times.

nitrilase；Acidovorax facilis；Escherichia coli；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.027

2014-06-12

國家自然科學基金項目（21076105），國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）（2009CB724701），江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目

管啟旺，男，碩士，研究方向：工業(yè)微生物；E-mail：819468208@qq.com

馬江鋒；E-mail：bioengine@njut.edu.cn