三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去飽和酶基因全長cDNA克隆與組織表達(dá)

施秋燕 楊志剛 王偉 姚琴琴 王瑤 成永旭

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海　201306）

三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去飽和酶基因全長cDNA克隆與組織表達(dá)

施秋燕 楊志剛 王偉 姚琴琴 王瑤 成永旭

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

旨在探討三疣梭子蟹高度不飽和脂肪酸自身合成能力，探究三疣梭子蟹HUFA生物合成途徑。采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆得到三疣梭子蟹△6去飽和酶cDNA 全長序列，并利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行肝胰腺、腸道、鰓等8種組織的表達(dá)分析。通過分析序列表明，基因序列全長2 875 bp，其中5'非編碼區(qū)長465 bp，3'非編碼區(qū)長1 078 bp，開放閱讀框（ORF）長1 332 bp，編碼443個氨基酸；并且編碼的蛋白序列具有典型的去飽和酶特性：3個組氨酸保守區(qū)，一個N端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域以及一個血紅素結(jié)合的HPGG結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR結(jié)果顯示，Δ6脂肪酸去飽和酶基因在三疣梭子蟹多個組織中均有表達(dá)，在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次是腸道和肌肉，心臟中表達(dá)最少。結(jié)果表明三疣梭子蟹具有△6去飽和酶。

三疣梭子蟹；脂肪酸去飽和酶；組織表達(dá)分析

脂肪酸是一類重要的營養(yǎng)成分，對人體起著十分重要的作用，尤其是高度不飽和脂肪酸（Highly unsaturated fatty acid，HUFA），能降低心腦血管疾病［1］，抗衰老［2］，促進(jìn)嬰幼兒發(fā)育，增強(qiáng)記憶力［3］，同時對能量代謝、維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動有著至關(guān)重要的作用［4］。脂肪酸去飽和酶和碳鏈延長酶是HUFA合成過程中的關(guān)鍵酶［5，6］。動物脂肪酸去飽和酶主要有4種，包括△9去飽和酶、△5去飽和酶、△6去飽和酶和△4去飽和酶，其中△6去飽和酶為第一限速酶。這種膜結(jié)合的蛋白酶催化HUPA生物合成的第一步，能分別將亞油酸（C18：2n-6）和亞麻酸（C18：3n-3）催化為C18：3n-6和C18：4n-3［7，8］。除此之外，有研究表明△6去飽和酶是EPA和花生四烯酸合成過程中的限速關(guān)鍵酶［9，10］。△6去飽和酶在水產(chǎn)動物，尤其是水產(chǎn)脊椎動物上的研究較多。研究者們分別從虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［11］、斑馬魚（Danio rerio）［12］、鯉魚［13］、大西洋鮭（Salmo salar）［14］、軍曹魚（Rachycentron canadum）［15］等多種脊椎魚類中克隆得到△6去飽和酶基因全長。然而這在甲殼動物中研究甚少，僅在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）［16］有過報道。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）俗稱梭子蟹，屬甲殼綱，十足目，梭子蟹科，是我國重要的經(jīng)濟(jì)海水蟹類，其營養(yǎng)豐富，滋味獨(dú)特，深受人們的喜愛。其中，HUFA在三疣梭子蟹中發(fā)揮十分重要的生理功能，能夠促進(jìn)蟹類生長及性腺發(fā)育［17-19］?，F(xiàn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，對經(jīng)濟(jì)蟹類的營養(yǎng)需求方面多集中在中華絨螯蟹上，對三疣梭子蟹脂肪酸需求，特別是對HUFA需求報道甚少。鑒于此，我們試從分子學(xué)角度入手，首次克隆三疣梭子蟹△6去飽和酶基因全長，同時進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)分析，并構(gòu)建其組織表達(dá)譜，旨在為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹△6去飽和酶功能，探明三疣梭子蟹HUFA合成機(jī)理奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用三疣梭子蟹，雌雄（雌126±10 g，雄212±10 g）各3只，均購自上海蘆潮港水產(chǎn)市場。解剖三疣梭子蟹，取其肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、心臟、肌肉、眼柄、腸道、胃、鰓共8種組織存于-80℃冰箱作為實驗樣品。

實驗室所用的試劑均來自日本TaKaRa公司（RNAisoTMPlus、Reverse Transcriptase、dNTPs、r Taq聚合酶、DNA Marker、pMD19-T Simple載體試劑盒、IPTG、X-Gal、SYBR Premix Ex TaqTM、瓊脂糖）、天根生化科技有限公司（氨芐青霉素、TOP10感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒）、Clontech公司（SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit）；、生工生物工程有限公司（無菌去離子水、DEPC水、50×TAE buffer、5×TBE buffer）、上海賽百盛基因技術(shù)有限公司（核酸染料Gold view）及國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（酒精、三氯甲烷等）。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄 參照RNAisoTMPlus（TaKaRa）操作說明書，取三疣梭子蟹肝胰腺樣品提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計（Q5000）檢測RNA完整度及濃度。根據(jù)PrimscriptTMReverse Transcriptase（TaKaRa）說明書，取1.0 μg三疣梭子蟹肝胰腺總RNA反轉(zhuǎn)錄成模板第一鏈cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計及序列驗證 根據(jù)實驗室所構(gòu)建的三疣梭子蟹肝胰腺cDNA文庫，通過NCBI blast比對發(fā)現(xiàn)，有一預(yù)測的Δ6去飽和酶基因序列片段與中華絨螯蟹的Δ6去飽和酶（GenBank登錄號JX946434）相似度十分高。根據(jù)已知片段序列設(shè)計一對上下游引物（表1），PCR擴(kuò)增，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根）回收純化，并送上海工程生物工程公司測序，對已知序列進(jìn)行驗證。

1.2.3 △6去飽和酶基因的克隆 根據(jù)已驗證的序列，設(shè)計3'-FAD RACE上游引物和5'-FAD RACE下游引物（表1）。利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成3'-cDNA第一鏈和5'-cDNA第一鏈，作為基因3'和5'端序列快速擴(kuò)增的模板，并按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書上的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因的擴(kuò)增。

PCR反 應(yīng) 體 系：3'-cDNA（5'-cDNA） 模 板2.5 μL，10 μmol/L的 3'-FAD（5'-FAD） 引 物 1.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50× Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，10×Advantage 2 PCR buffer緩沖液5.0 μL，UPM通用引物5.0 μL，加無菌去離子水至總體積50.0 μL。反應(yīng)條件：94℃ 30 s，72℃3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)。RACE PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆并送上海生工生物工程公司測序。

表1 核苷酸引物序列

1.2.4 目的基因序列分析 利用NCBI Vecscreen網(wǎng)站去除測序結(jié)果的載體序列，然后進(jìn)行片段的拼接。開放閱讀框的尋找利用ORF（Open reading frame）finder軟件；序列翻譯和蛋白質(zhì)相似性分析利用ClustalW及DNAMAN等軟件；相對分子量和蛋白質(zhì)等電點的計算使用Compute pI/Mw（http：// web.expasy.org/compute_pi/）；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行。

1.2.5 Δ6去飽和酶基因在各組織中的表達(dá) 將已獲得的各組織cDNA作為模板，通過克隆得到的全長序列設(shè)計熒光定量PCR引物（表1）。根據(jù)Livak等［20］提出的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2-ΔΔCt，以三疣梭子蟹β-actin基因（GenBank登錄號FJ641977.1）為內(nèi)參，雌雄各3只，每個組織分別3個重復(fù)。利用CFX96儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及不同組織熒光定量PCR的擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以肝胰腺cDNA為模板，以5倍梯度進(jìn)行稀釋，分別進(jìn)行Δ6去飽和酶基因和β-actin基因引物的熒光定量PCR，得出各稀釋模板Ct值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，上下游引物各0.25 μL，cDNA模板2 μL，加去離子水至終體積為25 μL；反應(yīng)程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，62℃ 30 s，40個循環(huán)，65℃至熔解曲線。利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 Δ6去飽和酶基因cDNA的序列分析

從三疣梭子蟹肝胰腺中提取總RNA，反轉(zhuǎn)為模板，設(shè)計驗證引物擴(kuò)增獲得三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因部分片段，大小為953 bp，與實驗室基因庫中預(yù)測結(jié)果相符（圖1-A），初步確定為三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因。根據(jù)已驗證的引物設(shè)計RACE引物，經(jīng)過3'-RACE PCR和5'-RACE PCR擴(kuò)增后分別獲得1 367 bp（圖1-B）和1 259 bp（圖1-C）片段，與預(yù)期片段大小基本一致。拼接測序結(jié)果，該基因全長2 875 bp，其中包括465 bp的5'非編碼區(qū)（UTR），1 078 bp的3'非編碼區(qū)（UTR），開放閱讀框（ORF）長1 332 bp，編碼443個氨基酸，同時具有加尾信號（AATAAA）以及Poly-A尾（圖2）。分析序列表明，編碼理論等電點為8.52，分子量為50.62 kD的氨基酸。同時，該序列具有典型的組氨酸簇保守區(qū)域，HNXFH（第186-190位）、HALSHH（第214-219位）和HTLHH（第378-382位），屬于典型的去飽和酶結(jié)構(gòu)［16，22］。經(jīng)BLASTn、BLASTp等比對表明，此序列與中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）Δ6去飽和酶基因序列具有高度的相似性，由此初步確定此序列為三疣梭子蟹Δ6去飽和酶序列。

圖1 三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 三疣梭子蟹Δ6去飽和酶氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用ClustalX軟件將三疣梭子蟹去飽和酶氨基酸序列與其他代表性的脊椎動物與無脊椎動物進(jìn)行Δ6去飽和酶氨基酸多序列比對。結(jié)果（圖3）表明，三疣梭子蟹的Δ6去飽和酶氨基酸與中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、大西洋鮭（Salmo salar）、羅非魚（Oreochromis niloticus）、利什曼原蟲（Leishmania donovani）以及線蟲（Caenorhabditis elegans）的Δ6去飽和酶氨基酸都具有一個血紅素結(jié)合的HPGG保守結(jié)構(gòu)域，相似性分別為66%、37%、37%、24%和40%。與人（Homo sapiens）的Δ6去飽和酶氨基酸相似性要高于與Δ5去飽和酶氨基酸的相似性，分別為39%和32%。

圖2 三疣梭子蟹Δ6去飽和酶氨基酸全長cDNA序列及推測的氨基酸序列

圖3 三疣梭子蟹與其他物種Δ6去飽和酶氨基酸序列比較

利用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）將相關(guān)代表脊椎動物和無脊椎動物的Δ6去飽和酶氨基酸序列構(gòu)建發(fā)育樹。此外，該發(fā)育樹還包括可能存在于脊椎動物中的另一種與Δ6去飽和酶相似度較大的膜結(jié)合蛋白Δ5去飽和酶。脊椎動物中，包括魚類的很多Δ6去飽和酶已經(jīng)被確定，但是在無脊椎動物中被確定較少。因此選擇所做的魚類和其他脊椎動物發(fā)育樹的分支比無脊椎動物的分支要寬廣，共同聚成一大支。同時，三疣梭子蟹的Δ6去飽和酶與中華絨螯蟹的Δ6去飽和酶同聚一小支，形成單獨(dú)的一體，表明這兩個物種親緣關(guān)系接近。

2.3 三疣梭子蟹Δ6去飽和酶mRNA不同組織的表達(dá)分析

繪制得到的Δ6去飽和酶基因和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y=-3.260x+33.59，R2=0.997，擴(kuò)增效率E為102.6%；y=-3.203x+30.72，R2=0.992，擴(kuò)增效率E為105.2%，因此滿足2-ΔΔCt法。

圖4 基于Δ6去飽和酶氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

取三疣梭子蟹成蟹的腸、胃、心臟、肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、肌肉、眼柄和鰓8個組織，利用熒光定量PCR方法研究三疣梭子蟹Δ6去飽和酶mRNA的組織表達(dá)特征，設(shè)定三疣梭子蟹在心臟中的表達(dá)量為1，根據(jù)Δ6去飽和酶在各個組織中的相對表達(dá)量作柱形圖。結(jié)果（圖5）顯示，Δ6去飽和酶在上述所有檢測的組織中均有表達(dá)，且在三疣梭子蟹的肝胰腺中表達(dá)量最高，表達(dá)水平顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次是腸道和肌肉組織；在心臟、胸神經(jīng)節(jié)、眼柄、鰓和胃組織中微量表達(dá)。

圖5 三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因m RNA組織表達(dá)圖譜

3 討論

去飽和酶基因家族在脂肪酸代謝調(diào)節(jié)中有著十分廣泛而又不可或缺的功能，Δ6去飽和酶在HUFA合成過程中起著關(guān)鍵限速酶的作用［13］。在所有已知結(jié)構(gòu)的去飽和酶中都有一個典型的特征：3個典型的組氨酸簇保守域，一個細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域和一個血紅素結(jié)合的HPGG結(jié)構(gòu)域［21，22］。本實驗所克隆的三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因與上述特征完全相符，初步確定為三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因。分析多序列比對結(jié)果，三疣梭子蟹Δ6去飽和酶氨基酸與人的Δ6去飽和酶氨基酸相似性高于Δ5去飽和酶氨基酸，同時與中華絨螯蟹Δ6去飽和酶氨基酸的相似性為66%，因此初步確定為三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因。在構(gòu)建三疣梭子蟹、多種魚類、小鼠、人和中華絨螯蟹的進(jìn)化發(fā)育樹中，三疣梭子蟹和中華絨螯蟹單獨(dú)聚為一支，表明兩者親緣關(guān)系最近，而與其他脊椎動物關(guān)系較遠(yuǎn)。

Δ6去飽和酶作為脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，在組織中廣泛表達(dá)［15，16，23，24］。本實驗熒光定量PCR表明，三疣梭子蟹Δ6去飽和酶mRNA在胃、心臟、胸神經(jīng)組織、肌肉、肝胰腺、腸道、眼柄和鰓組織中均有表達(dá)。Δ6去飽和酶在三疣梭子蟹肝胰腺中表達(dá)量最高，這與前人研究中Δ6去飽和酶基因在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［23］和中華絨螯（Eriocheir sinensis）［16］等的表達(dá)情況均一致。有研究認(rèn)為［25，26］，Δ6 脂肪酸去飽和酶基因在肝臟中的高表達(dá)與肝臟參與調(diào)控脂肪酸的新陳代謝有關(guān)?？梢姼我认僮鳛橹惔x中心在三疣梭子蟹生命過程中極其重要。

實驗結(jié)果顯示Δ6 脂肪酸去飽和酶基因在腸道中表達(dá)量相對較高，表明腸道可能是合成HUFA的重要部位。在大西洋鮭魚［27］、建鯉［24］Δ6 去飽和酶基因mRNA組織表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，其在腸中表達(dá)量均較高；由此可見，腸道在HUFA合成過程中必定發(fā)揮著重要作用。2001年，Seiliez等［23］在虹鱒幼魚Δ6 脂肪酸去飽和酶mRNA組織定量表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，該基因在腦、肝臟和鰓等組織中高表達(dá)，而在肌肉中的表達(dá)量則較低，這與本實驗在成蟹肌肉中表達(dá)較高的結(jié)果有所不同。許友卿［15］、任洪濤［24］等同樣在軍曹魚幼魚、建鯉幼魚組織表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，Δ6脂肪酸去飽和酶基因在幼魚肌肉組織中表達(dá)量較低。究其原因，可能與所研究物種的發(fā)育階段有關(guān)。有研究表明，水產(chǎn)動物組織中脂肪酸的功能就是為機(jī)體提供三磷酸腺苷（ATP）［28］，因此肌肉中高表達(dá)的Δ6 脂肪酸去飽和酶預(yù)示著成蟹肌肉較幼蟹肌肉功能更完善。

目前研究表明，Δ6 脂肪酸去飽和酶通常參與C18多不飽和脂肪酸（PUFA）轉(zhuǎn)化為C20的 HUFA的過程。一般認(rèn)為海水蟹類合成HUFA的能力較弱，但是缺乏相關(guān)的功能驗證，故此初步確定的三疣梭子蟹Δ6 脂肪酸去飽和酶基因是否具有合成HUFA的能力及合成能力的大小還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實驗首次成功克隆獲得三疣梭子蟹Δ6去飽和酶基因全長cDNA序列，該序列全長2 875 bp，ORF長1 332 bp，編碼443個氨基酸，具有典型的去飽和酶特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹符合物種傳統(tǒng)分類進(jìn)化原則，進(jìn)化結(jié)果顯示三疣梭子蟹與中華絨螯蟹親緣關(guān)系最近。該基因在肝胰腺中高表達(dá)，其次是腸道和肌肉，其他組織少量表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Tissue Expression of Full-length cDNA in Gene Encoding Δ6-desaturase Fatty Acyl of Portunus trituberculatus

Shi Qiuyan Yang Zhigang Wang Wei Yao Qinqin Wang Yao Cheng Yongxu
（The College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306）

The goal of this work is to investigate the self-synthesis capability of highly unsaturated fatty acid（HUFA）and understand the synthesis pathway of HUFA in Portunus trituberculatus. Full-length cDNA of gene for Δ6-desaturase fatty acyl in P. trituberculatus was cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE）， and the expressions in 8 tissues such as hepatopancreas， intestine and gill etc. were analyzed by real-time quantitative PCR（qRT-PCR）. Analysis of the full-length cDNA of gene for Δ6-desaturase fatty acyl revealed that it was 2 875 bp， including 465 bp of 5' UTR and 1 078 bp of 3' UTR， and encoded 443 amino acids. The presumed protein sequence had a typical desaturase structure：3 histidine-rich motifs， a b5 domain of an N terminal cytochrome and a heme-binding HPGG domain. qRT-PCR showed that gene for Δ6-desaturase fatty acyl expressed in all 8 tissues while the highest in hepatopancreas， less in intestine and muscle， and the least in the heart. The results indicate that P. trituberculatu s possesses Δ6-desaturase fatty acyl.

Portunus trituberculatus；fatty acid desaturase；tissue expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.019

2015-01-19

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2012AA10A409-5），國家自然科學(xué)基金項目（31472287，41276158），科技部港澳臺科技合作專項（2014DFT30270），上海教委知識服務(wù)平臺項目（ZF1206）

施秋燕，女，碩士研究生，研究方向：分子營養(yǎng)；E-mail：shiqy1105@163.com

楊志剛，男，博士，研究方向：分子營養(yǎng)；E-mail：zgyang@shou.edu.cn