嗜熱鏈球菌的特性與應(yīng)用研究進(jìn)展

田輝 梁宏彰 霍貴成 Evivie Sm ith Etareri

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)　乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150030）

嗜熱鏈球菌的特性與應(yīng)用研究進(jìn)展

田輝 梁宏彰 霍貴成 Evivie Sm ith Etareri

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

嗜熱鏈球菌是一種重要的工業(yè)用乳酸菌，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。近年來，對嗜熱鏈球菌的研究已不僅僅停留于應(yīng)用方面，而有關(guān)該菌基因組學(xué)等深層次特性機(jī)理的研究越來越多，對嗜熱鏈球菌的研究和應(yīng)用開發(fā)具有較好的參考價值。綜述了嗜熱鏈球菌的認(rèn)定和應(yīng)用、基因組學(xué)特征、發(fā)酵特性、噬菌體防御和共生機(jī)制等方面的研究進(jìn)展，并展望了現(xiàn)代生物技術(shù)在嗜熱鏈球菌特性研究中的應(yīng)用前景。

嗜熱鏈球菌；基因組；發(fā)酵；噬菌體；共生

嗜熱鏈球菌是一種重要的工業(yè)用乳酸菌，可用于生產(chǎn)酸奶和奶酪等多種發(fā)酵乳制品。長期以來，人們對嗜熱鏈球菌的研究和應(yīng)用僅限于傳統(tǒng)的菌株篩選和低效的反復(fù)試驗(yàn)之中，難以滿足現(xiàn)代食品工業(yè)的需求。而隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，基因組學(xué)和各種現(xiàn)代生物技術(shù)以嶄新的面貌呈現(xiàn)，并以前所未有的速度解析多種生物規(guī)律和機(jī)理。截至2014年底，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）共公布了3 511條全基因組序列，其中細(xì)菌3 036條，古細(xì)菌176條，真核生物299條［1］。

現(xiàn)代生物技術(shù)能夠使人們將某一物種的基因組序列等靜態(tài)數(shù)據(jù)，與在不同環(huán)境中的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)修飾等動態(tài)數(shù)據(jù)系統(tǒng)地結(jié)合，從整體上對物種的生長代謝性能進(jìn)行分析和預(yù)測。近幾年，人們應(yīng)用基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法深入研究了嗜熱鏈球菌的特性，為嗜熱鏈球菌在現(xiàn)代食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了豐富的依據(jù)。本文從嗜熱鏈球菌的種屬認(rèn)定和應(yīng)用、嗜熱鏈球菌的基因組學(xué)特征和發(fā)酵特性、嗜熱鏈球菌的防御體系、以及與保加利亞乳桿菌的共生機(jī)制等方面，依據(jù)現(xiàn)代生物技術(shù)的研究，對嗜熱鏈球菌的特性和應(yīng)用展開論述，為乳品微生物研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 嗜熱鏈球菌的認(rèn)定與應(yīng)用

乳酸菌是一類公認(rèn)安全的食品級微生物，普遍存在于水果、蔬菜、谷物、酒、牛乳和人類胃腸道及泌尿生殖道等諸多環(huán)境中。乳酸菌能夠代謝乳糖和葡萄糖等產(chǎn)生乳酸，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品、肉制品和青貯飼料等生產(chǎn)中。乳酸菌對人類健康具有重要作用，如人體腸道內(nèi)的乳酸菌通過產(chǎn)生細(xì)菌素拮抗有害微生物。另外，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和胞外多糖等代謝產(chǎn)物都是有益物質(zhì)。乳酸菌是一類細(xì)菌的統(tǒng)稱，所包含的種屬涉及到乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、酒球菌屬（Oenococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、和乳桿菌屬（Lactobacillus）等［2］。

嗜熱鏈球菌作為一種重要的工業(yè)用乳酸菌，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)之中，其重要性僅次于第一位的乳酸乳球菌，其每年的市場份額約為400億美元［3］。鑒于嗜熱鏈球菌在食品發(fā)酵中具有悠久歷史，歐洲食品安全局（European food safety authority，EFSA）認(rèn)定其具有安全資格（Qualified presumption of safety，QPS）［3，4］。作為最經(jīng)典的酸奶發(fā)酵劑菌種，嗜熱鏈球菌常與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）一起用于酸奶生產(chǎn)，通過共生作用，二者相互促進(jìn)，大大提高生長速度并改善酸奶品質(zhì)［5］。嗜熱鏈球菌是一種耐高溫型乳酸菌，在酸奶和硬質(zhì)奶酪生產(chǎn)中可耐受較高的發(fā)酵和加工溫度［6］，與同為耐高溫型乳酸菌的保加利亞乳桿菌或瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）一起用于生產(chǎn)，共同作用，快速產(chǎn)酸，賦予產(chǎn)品良好的質(zhì)構(gòu)特性和風(fēng)味［7］。

人們對嗜熱鏈球菌的分離與研究工作開始于上個世紀(jì)初。1991年，首次報(bào)道了嗜熱鏈球菌的部分特性：革蘭氏陽性、不運(yùn)動、無芽孢、過氧化氫酶陰性、兼性厭氧、同型乳酸發(fā)酵、可生存于牛乳房黏膜和生牛乳中，而通過分析對比16S rRNA和超氧化物歧化酶sodA基因得知，與嗜熱鏈球菌親緣相近的是唾液鏈球菌和前庭鏈球菌，因此，嗜熱鏈球菌曾一度被劃為唾液鏈球菌的一個亞種，直到1991年通過DNA-DNA重組實(shí)驗(yàn)才將嗜熱鏈球菌恢復(fù)到種的水平［6，8］。隨后，嗜熱鏈球菌被美國和歐盟確定為93個鏈球菌屬中唯一的公認(rèn)安全菌種［9］。現(xiàn)在，人們每年攝食的活體嗜熱鏈球菌約1021個，在注重飲食營養(yǎng)與安全的現(xiàn)代生活中，由嗜熱鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸乳已成為一種遍布世界各地的產(chǎn)業(yè)化健康美食［6］。

發(fā)酵乳制品的產(chǎn)業(yè)化使得人們對發(fā)酵劑菌種（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和乳酸乳球菌）提出更嚴(yán)格的要求，如何開發(fā)利用嗜熱鏈球菌，研制出滿足要求的工業(yè)發(fā)酵劑，是嗜熱鏈球菌研究的新內(nèi)容?，F(xiàn)代乳制品產(chǎn)業(yè)多采用的固定菌株，以及酸奶發(fā)酵劑的單一化，導(dǎo)致產(chǎn)品種類不足、生產(chǎn)過程易受噬菌體侵染等諸多缺點(diǎn)，因此分離和篩選新菌種作為發(fā)酵劑成為亟待解決的問題［10］；而另一方面，對候選菌種特性的了解程度，會直接影響到其產(chǎn)品質(zhì)量的安全性與穩(wěn)定性。所以，如何全面了解候選菌種的多方面特性是新菌株篩選所面臨的一大難題。

2 嗜熱鏈球菌的基因組學(xué)研究

2.1 嗜熱鏈球菌的基因組特征

從2001年第一株乳酸菌（乳酸乳球菌IL1403）的全基因組測序完成，以后每年公布的乳酸菌全基因組序列的數(shù)量不斷增加。2008年，Mayo等［11］報(bào)道乳酸菌的全基因組序列有屬于15個種類的20多株被公布，其中包括嗜熱鏈球菌CNRZ1066、LMG13811和LMD9。2011-2013年公布測序全基因組完成的嗜熱鏈球菌有JIM8232、MN-ZLW-002、ND03和MTCC5461［12，13］。截至2014年底，在National Center for Biotechnology Information（NCBI） 網(wǎng)站能夠查詢到詳細(xì)信息的嗜熱鏈球菌有7株，分別是CNRZ 1066（基因組編號CP000024）、LMG 13811（基因組編號CP000023）、LMD-9（基因組編號CP000419）、MN-ZLW-002（基因組編號CP003499）、ND 03（基因組編號CP002340）、JIM 8232（基因組編號FR875178）及ASCC 1275（基因組編號CP006819），見表1［14］。通過統(tǒng)計(jì)分析表明：其基因組大小在1.85 Mb左右，含單一環(huán)狀染色體，不含或含少量質(zhì)粒，G+C含量低，約含有2 000個基因，不同嗜熱鏈球菌的基因組在堿基水平上的相似度約95%［15］。嗜熱鏈球菌與真核生物相比具有基因組小、不含內(nèi)含子、富含多種營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)載體基因、代謝底物合成和分解基因以串聯(lián)形式組成的操縱子等特點(diǎn)，為基因的高效轉(zhuǎn)錄、表達(dá)產(chǎn)物快速發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)，也為其組學(xué)研究創(chuàng)造了有利條件。

表1 七株嗜熱鏈球菌的全基因組信息

2.2 嗜熱鏈球菌的基因組進(jìn)化

嗜熱鏈球菌CNRZ 1066和LMG 13811分離自法國和英國傳統(tǒng)酸奶，是首次完成全基因組測序的嗜熱鏈球菌，其序列特征見表2。CNRZ 1066和LMG 13811菌株都含有一個約1.80 Mb的染色體，含約1 900個編碼序列，其中近80%與鏈球菌屬中其他菌種的序列同源，證實(shí)了嗜熱鏈球菌在細(xì)菌分類中的重要地位。而兩株菌（CNRZ 1066和LMG 13811）間也存在90%以上的同源序列，表明兩者可能由共同的祖先菌株進(jìn)化而來，根據(jù)兩者基因組特征和自然突變速率估測，如果按照每天細(xì)胞裂殖1-10代計(jì)算，兩株菌的共同祖先可追溯至107代之前，即3 000-30 000年前，與人們開始制作發(fā)酵乳制品的時間相吻合，說明此時人們已經(jīng)開始使用嗜熱鏈球菌了。Bolotin等［12］于2004年對這兩株菌（CNRZ 1066和LMG 13811）的全基因組序列進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌與鏈球菌屬的其他菌種相比，基因組中明顯發(fā)生了基因退化，其中10%的假基因多為糖代謝相關(guān)基因。因此，推測嗜熱鏈球菌發(fā)生基因退化之前，其糖代謝基因可正常發(fā)揮作用，使菌株具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力，其部分糖代謝基因失活是由于長期被人們應(yīng)用于乳制品的發(fā)酵中，對糖類貧乏的乳環(huán)境（只含乳糖）的產(chǎn)生了適應(yīng)；另一方面，嗜熱鏈球菌基因組缺少存在于致命性鏈球菌中的諸多致病相關(guān)基因，如肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、生膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）和引起齲齒的變形鏈球菌（Streptococcus mutans）［12，20］。因此，現(xiàn)代生物技術(shù)的組學(xué)在嗜熱鏈球菌研究中的應(yīng)用，明確了嗜熱鏈球菌的進(jìn)化進(jìn)程，也證實(shí)了嗜熱鏈球菌的安全性。

表2 嗜熱鏈球菌CNRZ 1066和LMG 13811的基因組特征

2.3 基因的水平轉(zhuǎn)移

不同菌株的基因組之間存在差異，可能是由基因丟失、基因重疊和基因的水平轉(zhuǎn)移等引起的［2］。2011年，Delorme等［18］對一株分離自乳中的嗜熱鏈球菌JIM 8232進(jìn)行了基因組測定分析。由于能夠產(chǎn)生黃色色素，因此該菌株具有較高的特異性。通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，JIM 8232基因組中存在一段長度為129 kb的特異性序列，這段序列可分為2.6-55 kb長度不等的9個區(qū)域，其中胞外多糖基因簇、限制/修飾系統(tǒng)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列為該段的高變異區(qū)域，另外3個區(qū)域與抗氧化代謝相關(guān)，這6個區(qū)域的兩側(cè)都有基因座等移動元件；而最后3個區(qū)域?yàn)檎蠀^(qū)域，包括剪接酶合成基因以及兩個主要的基因島（色素合成操縱子和prtS蛋白酶基因）。這些區(qū)域的特性說明它們是通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式整合到基因組上的，說明基因水平轉(zhuǎn)移在嗜熱鏈球菌基因組進(jìn)化中起到了重要作用。

嗜熱鏈球菌CNRZ 1066和LMG 13811是兩株親緣較近的菌株，然而它們在胞外多糖合成、限制/修飾系統(tǒng)、原噬菌體和CRISPR基因座等基因序列上存在差異［12］。2011年，在荷蘭召開的第10屆乳酸菌專題討論會上，Goh等［9］介紹了將一株性能優(yōu)良的嗜熱鏈球菌LMD-9與兩株菌CNRZ 1066和LMG 13811進(jìn)行基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)菌株LMD-9也擁有一段長度為114 kb的特異性序列，其中包括組氨酸合成、細(xì)胞表面蛋白酶、宿主防御機(jī)制和原噬菌體、假定粘液粘附蛋白、肽類運(yùn)載體以及胞外多糖合成的相關(guān)基因，根據(jù)同源性分析表明這些特異性基因是菌株在特定乳環(huán)境中通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得。事實(shí)上，嗜熱鏈球菌的一些重要特性與基因水平轉(zhuǎn)移是密不可分的，如胞外多糖的合成，細(xì)菌素的產(chǎn)生，限制性修飾系統(tǒng)及耐氧力等［2］。

3 嗜熱鏈球菌發(fā)酵特性

牛乳富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，適合多種微生物生長和繁殖，而嗜熱鏈球菌發(fā)酵牛乳時，具有快速生長產(chǎn)酸的特點(diǎn)，從而創(chuàng)造適合另一部分乳酸菌生長的酸性環(huán)境。嗜熱鏈球菌能夠在眾多微生物中占據(jù)初期生長優(yōu)勢，主要在于其發(fā)酵過程中獨(dú)特的糖代謝和蛋白質(zhì)代謝能力，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為人們對其發(fā)酵特性的研究提供了重要技術(shù)手段。

3.1 嗜熱鏈球菌的基因表達(dá)特征

Derzelle等［21］在2005年首次測定了嗜熱鏈球菌LMG 18311在牛乳和M17中生長的蛋白質(zhì)組，分析了菌株在兩種基質(zhì)中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，重點(diǎn)研究了與氨基酸攝入相關(guān)的酶，如肽酶PepX和一些氨基酸合成酶。研究發(fā)現(xiàn)菌株在兩種基質(zhì)中生長1.5 h后，主要蛋白表達(dá)差異是丙酮酸鹽甲酸鹽裂合酶（Pfl）、參與氨基酸與嘌呤合成的蛋白質(zhì)，推測可能是由于乳中缺少必要的遺傳物質(zhì)，嗜熱鏈球菌在乳中生長時Pfl高表達(dá)，因?yàn)樗鼌⑴c嘌呤的合成過程，而嘌呤是重要的遺傳代謝物質(zhì)。通過Northern blot對pfl基因的mRNA進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在乳中生長時，pfl基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Pfl酶的含量增加，而向乳中添加甲酸和嘌呤堿基后，pfl基因的表達(dá)水平降低，Pfl酶的合成減弱，證明了Pfl酶在以甲酸鹽為底物的合成反應(yīng)中的重要作用，探索了Pfl酶的表達(dá)調(diào)控特性［21，22］。隨后Salzano等［23］測定了嗜熱鏈球菌ATCC 19258的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞膜蛋白，鑒定了對應(yīng)于458個基因的蛋白質(zhì)，包括參與碳源、脂肪酸、氨基酸和核酸代謝的酶類，基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞壁合成的蛋白酶類，以及與乳制品加工性能有關(guān)的重要蛋白質(zhì)（如乳糖的攝入和胞外多糖的合成），實(shí)驗(yàn)結(jié)果有利于進(jìn)一步分析和對比不同菌體的蛋白質(zhì)組，為工業(yè)生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的篩選提供參照。Herve-Jimenez等［22］測定了關(guān)于LMG 18311在乳中生長的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)組圖譜，鑒定了203個不同的蛋白質(zhì)，占理論蛋白質(zhì)組的32%。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了菌株在乳中不同生長階段（2.5 h和5.5 h）的生理狀況，確定了菌株生長后期上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)分別為：（1）肽類與氨基酸的運(yùn)載體，及特定氨基酸尤其是含硫氨基酸的合成；（2）糖類代謝中的相關(guān)蛋白質(zhì)。新技術(shù)的應(yīng)用使人們對嗜熱鏈球菌在牛乳環(huán)境中生長的基因表達(dá)特征有了全局認(rèn)識，為嗜熱鏈球菌代謝特性的研究提供了更為深入的數(shù)據(jù)。

3.2 糖類代謝的研究

嗜熱鏈球菌能夠快速代謝牛乳中乳糖生成乳酸的能力，是其廣泛應(yīng)用于酸奶和奶酪生產(chǎn)的重要特性之一［21］。嗜熱鏈球菌長期生長在牛乳環(huán)境中使其糖類代謝力退化，可利用的糖類較少，主要有乳糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖和果糖等，其中能夠利用半乳糖和果糖的只占少數(shù)［6］。嗜熱鏈球菌糖類代謝類型是同型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物除L-乳酸外，尚有微量的甲酸鹽、乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）、丁二酮、乙醛和醋酸鹽等［6］及與發(fā)酵乳風(fēng)味形成的相關(guān)物質(zhì)。

3.2.1 乳糖代謝系統(tǒng) 牛乳中的糖種類單一，但其中的乳糖含量相對比較豐富，長期的進(jìn)化使嗜熱鏈球菌對乳糖具有較強(qiáng)的偏好性［24］。當(dāng)分別以3種糖（乳糖、蔗糖和葡萄糖）為單一碳源時，嗜熱鏈球菌A147在葡萄糖基質(zhì)中生長時會出現(xiàn)遲滯期延長、生長速率為緩慢的現(xiàn)象。以蔗糖和果糖為代謝底物時，其糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中可以檢測到磷酸烯醇式丙酮酸依賴型磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）代謝活力。而以葡萄糖、乳糖和半乳糖為底物時則沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象，進(jìn)一步研究表明，乳糖和半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過乳糖滲透酶（LacS）二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行的，該菌的糖轉(zhuǎn)運(yùn)特征如表3所示［24］。對于大部分乳酸菌，葡萄糖是典型的PTS碳源，能夠被迅速攝取并利用，而對于嗜熱鏈球菌，葡萄糖卻是一種非PTS碳源，并且其利用率顯著低于另一種非PTS糖類——乳糖［25］。Bolotin等［12］在菌株CNRZ 1066和LMG 13811的基因組中發(fā)現(xiàn)，有7個基因座編碼PTS系統(tǒng)（ptsG、fruA、bglP、treP、manLMN、celB和scrA）、2個基因座編碼糖類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（malEF，stu/str0808-811）、2個編碼糖類轉(zhuǎn)運(yùn)體lacS和stu/str0855，但是這些基因中含有大量的假基因以及無編碼功能基因，說明嗜熱鏈球菌產(chǎn)生了基因丟失性進(jìn)化［6］，因此，結(jié)合嗜熱鏈球菌A147糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究可知，引起上述差異的主要原因在于嗜熱鏈球菌在進(jìn)化過程中丟失了葡萄糖PST轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因，大大降低了葡萄糖攝取能力，而乳糖的代謝基因卻得到保留，包括乳糖滲透酶（LacS）和β-半乳糖苷酶（LacZ），其中LacS是一種轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖的非磷酸系統(tǒng)轉(zhuǎn)移酶［21，25］，而β-半乳糖苷酶是乳糖/半乳糖的反向運(yùn)載體［6］。乳糖進(jìn)入菌體后被β-半乳糖苷酶分解為半乳糖和葡萄糖，其中的葡萄糖可被嗜熱鏈球菌株利用，而半乳糖一般情況下不被利用，經(jīng)LacZ排出體外。

表3 嗜熱鏈球菌A147的糖類轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

嗜熱鏈球菌不能代謝半乳糖的特性也從基因水平上得到了解釋。嗜熱鏈球菌中多數(shù)是不能利用半乳糖的，然而van den Bogaard等［26］發(fā)現(xiàn)在半乳糖代謝陰性菌株中也存在編碼半乳糖代謝（Leloir途徑）的基因（galK-TEM），與陽性突變菌株的基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，限制大多數(shù)嗜熱鏈球菌半乳糖代謝的主要原因并非是缺少相關(guān)的代謝基因，而是其表達(dá)的半乳糖激酶活力較低所致［27，28］（圖1）。該發(fā)現(xiàn)揭示了嗜熱鏈球菌糖代謝的重要機(jī)理，改變了以往人們的觀點(diǎn)，為以后的代謝調(diào)控提供了數(shù)據(jù)參考，指明了正確的研究途徑。

3.2.2 糖代謝調(diào)控因子 嗜熱鏈球菌的乳糖代謝基因簇是高度保守的，包括半乳糖代謝（Leloir途徑）基因和乳糖代謝（轉(zhuǎn)運(yùn)和分解）基因，這些基因連接在一起組成一個基因簇，即galKTEMlacSZ。在galK基因上游有一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控子編碼基因galR，它能對兩個操縱子（galKTEM和lacSZ）的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正調(diào)控［27］。半乳糖代謝陽性菌株CNRZ 302能夠較高水平地表達(dá)galKTE，經(jīng)過分析表明，其galK啟動子區(qū)域出現(xiàn)了特定變異［27］。兩個操縱子除了受galR的正調(diào)控外，其中l(wèi)ac S啟動子還受分解代謝控制蛋白CcpA的調(diào)控。CcpA通過lac S啟動子區(qū)的cre（CcpA感應(yīng)因子）而產(chǎn)生作用，抑制lacSZ表達(dá)，減少乳糖的攝入，同時又能提高糖酵解過程中3種關(guān)鍵酶（乳酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）的表達(dá)，加速胞內(nèi)糖的酵解。CcpA突變菌株的乳糖攝入和分解能力大大增加，但卻將大量半乳糖和葡萄糖排出胞外，從而導(dǎo)致乳酸生成速率和菌株生長速率大大降低，這說明CcpA對lacS啟動子的調(diào)控能力可以使乳糖攝入和分解過程與整個糖酵解過程達(dá)到更好的平衡［25］。通過DNA微陣列實(shí)驗(yàn)對比嗜熱鏈球菌野生菌株和CcpA突變菌株發(fā)現(xiàn)，CcpA的突變影響了大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，其中包括金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一些調(diào)控子，說明CcpA不僅能調(diào)控糖代謝，還參與其他代謝途徑［6］。

圖1 嗜熱鏈球菌gal-lac基因簇［26］

3.2.3 胞外多糖合成 胞外多糖能夠改善發(fā)酵乳制品組織和流變特性，防止脫水收縮，產(chǎn)生絲滑柔順的組織特性，賦予產(chǎn)品良好的口感和味覺［6］。多種細(xì)菌具有產(chǎn)生胞外多糖的能力，如果胞外多糖結(jié)合于細(xì)胞表面稱為莢膜多糖（Capsular polysaccharides，CPS），如果脫離細(xì)胞而釋放到培養(yǎng)基中則稱為胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）。胞外多糖又可根據(jù)其組成單元是一種單糖還是不同單糖而分為同型多聚糖和雜型多聚糖。首次被測定結(jié)構(gòu)的EPS產(chǎn)自菌株CNCMI 733、734和735，它們產(chǎn)生的胞外多糖中D-半乳糖∶D-葡萄糖∶2-乙酰-氨基-2-脫氧-D-半乳糖的比例為2∶1∶1［29］，大多數(shù)嗜熱鏈球菌產(chǎn)生雜多聚糖的胞外多糖，也有一些菌株產(chǎn)生的是莢膜多糖［6，30］。嗜熱鏈球菌的EPS結(jié)構(gòu)多樣，組成單元主要由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖組成，但也有N-乙?；?半乳糖胺、果糖和乙酰基半乳糖［30］。嗜熱鏈球菌產(chǎn)生胞外多糖的特性具有菌株特異性，與生長速率相關(guān)，而且其合成與分子結(jié)構(gòu)明顯受生長條件，如溫度、pH、碳源種類、濃度及C/N比等影響［31］。

目前有至少12個不同的eps基因簇序列被測定和公布，但通過限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，卻發(fā)現(xiàn)有60多個不同的eps基因簇存在［32］。Eps基因簇主要包括調(diào)控基因（epsA、epsB）、糖鏈長度控制基因（epsC、epsD）、重復(fù)性片段單元的合成基因（epsE、epsF、epsG、epsH和epsI）、單元聚合及多糖釋放控制基因（epsK、epsL和epsM）［30，31］。嗜熱鏈球菌胞外多糖合成途徑相對保守，并與同屬中其他鏈球菌相似［31］，由葡萄糖-6-磷酸開始，生成葡萄糖-1-磷酸，經(jīng)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶形成UDP-葡萄糖參與合成EPS［6］。Rasmussen等［7］基于已公布的2 200個基因設(shè)計(jì)了DNA微陣列，分析了47株鏈球菌的基因組，發(fā)現(xiàn)幾乎所有菌株都含有deoD-epsABCD基因，7株菌沒有epsE（編碼半乳糖-1磷酸或葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶），2個菌株不含epsA（編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控子），但在其他胞外多糖合成基因和整個基因簇組織上存在多種形式，證明eps基因簇結(jié)構(gòu)的高度可變性。比較CNRZ 1066、LMG 18311和LMD-9三株嗜熱鏈球菌的全基因組發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌LMD-9有兩個eps基因簇，分別為eps基因簇和rgp基因簇，3株嗜熱鏈球菌和一株唾液鏈球菌（SK126）的eps基因序列相似度在90%以上，尤其是在5'和3'兩端的區(qū)域，而且兩端的保守區(qū)域分別與deoD（編碼嘌呤核苷磷酸酶）和bglH（編碼β-糖苷酶）毗鄰［9］。嗜熱鏈球菌eps基因簇中一些移動元件也發(fā)現(xiàn)于其他鏈球菌和乳酸乳球菌，說明了eps基因簇的可移動性。嗜熱鏈球菌CNRZ 1066和Sfi6基因組中的eps基因簇的同源［32］，也說明了這個問題。eps基因簇的高變異性可能由于其在水平基因轉(zhuǎn)移或基因重組過程中插入片段或丟失片段等原因［30］。大量關(guān)于嗜熱鏈球菌全基因組的分析都證明eps基因簇與基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)，如JIM 8232［18］，以及在ND03基因組中發(fā)現(xiàn)eps基因簇存在多拷貝的IS元件，而這些元件也導(dǎo)致菌株eps基因具有較高特異性［17］。

許多乳酸菌產(chǎn)EPS的性狀是不穩(wěn)定的，甚至可能會永久性丟失。在乳酸乳球菌中，由于多糖控制基因存在于質(zhì)粒上，因此可以用質(zhì)粒的不穩(wěn)定來解釋EPS的性狀丟失，但嗜熱鏈球菌的eps合成基因全部存于染色體上，其性狀不穩(wěn)定可能是一些插入元件插入在eps基因簇的內(nèi)部或者與其相連所致，也可能是由于整體基因組不穩(wěn)定性導(dǎo)致EPS的產(chǎn)生具有可變性［30］。而從另外一個角度來看，其可變性又為陰性嗜熱鏈球菌獲得產(chǎn)EPS的特性提供了機(jī)會。

3.3 蛋白質(zhì)代謝的研究

3.3.1 關(guān)鍵代謝基因prtS 乳中氨基酸和短肽含量雖然相對較少，但卻富含大量蛋白質(zhì)，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白通過鈣離子交聯(lián)以膠束形式存在，因此不能直接被乳酸菌攝入，所以嗜熱鏈球菌通過多種蛋白酶及氨基酸肽類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將乳中酪蛋白水解為二肽、三肽及多肽，攝入至胞內(nèi)參與氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、降解等代謝［22］。與乳酸乳球菌蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)相比，嗜熱鏈球菌對外源氨基酸的攝入能力較弱［21］。乳酸乳球菌主要依靠細(xì)胞壁蛋白酶（PrtP）分解乳中酪蛋白為自身提供所需求的氨基酸，而嗜熱鏈球菌中僅有少數(shù)菌株具有細(xì)胞外蛋白酶（PrtS）。PrtS是枯草桿菌蛋白酶家族的一種絲氨酸蛋白酶，能分解乳蛋白，提供肽類和氨基酸，使嗜熱鏈球菌在乳中快速生長，當(dāng)菌株含有該酶時，菌體密度能夠迅速達(dá)到109CFU/mL，而不含該酶的菌株最多只能達(dá)到108CFU/mL［22，33］。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)和優(yōu)良發(fā)酵劑的評估中，嗜熱鏈球菌的生長速率可由產(chǎn)酸速率來體現(xiàn)，產(chǎn)酸速率越高代表發(fā)酵劑的生長性能越好。因此，PrtS蛋白酶的存在與否將決定嗜熱鏈球菌是快產(chǎn)酸型菌株或是慢產(chǎn)酸型菌株，尤其當(dāng)嗜熱鏈球菌以單菌株作為發(fā)酵劑時，PrtS更能起到關(guān)鍵作用。嗜熱鏈球菌作為生長起始菌株，能快速生長產(chǎn)酸，使pH值迅速降低，因此常選用產(chǎn)酸性能較強(qiáng)的嗜熱鏈球菌作為工業(yè)生產(chǎn)用菌株［10］。而在INRA所收集的135株菌中，僅有21株為細(xì)胞壁蛋白酶陽性菌株，表明了prtS基因在嗜熱鏈球菌中的稀有性。嗜熱鏈球菌中prtS是一個長為15 kb的基因，存在于菌株LMD 9，而不存在于菌株LMG 18311和CNRZ 1066［6，33］，可能通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得。Dandoy等［33］將PrtS陽性菌株的prtS基因轉(zhuǎn)化到3株產(chǎn)酸較慢的PrtS陰性菌株（LMG 18311、DGCC 7666和DGCC 7891）中，使重組菌株產(chǎn)酸速率提高2.4倍，遲滯期縮短，產(chǎn)酸至pH 5.2的時間縮短2-3倍。該實(shí)驗(yàn)的成功為乳品發(fā)酵劑定向改造提供了新思路，即可以將不同的乳品工業(yè)相關(guān)特征（快速產(chǎn)酸、組織結(jié)構(gòu)的影響、細(xì)菌素的產(chǎn)生、抗噬菌體等）組合到單株菌中，使人們在生產(chǎn)中利用單菌株即可達(dá)到產(chǎn)品要求，既簡化了生產(chǎn)步驟，又節(jié)約了成本投入。

3.3.2 氨基酸合成特性 由上可知，大部分嗜熱鏈球菌不能水解酪蛋白，而依靠自身氨基酸合成和細(xì)胞內(nèi)肽酶的作用來滿足自身氨基酸需求主要。氨基酸的合成對嗜熱鏈球菌的生長具有關(guān)鍵作用，尤其是支鏈氨基酸的合成，是其在天然牛乳環(huán)境中生長的關(guān)鍵途徑之一［22］。雖然一些菌株能夠滿足自身的氨基酸需要，但是也有一部分菌株不能合成特定的氨基酸。對菌株LMD 9與LMG 18311和CNRZ 1066的基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，其基因組缺少谷氨酸合成基因，這一結(jié)果解釋了該菌株不能在谷氨酸和谷氨酰胺都缺少的環(huán)境中生長的現(xiàn)象［6］。盡管氨基酸合成對嗜熱鏈球菌具有重要作用，在基因組序列中氨基酸合成的基因序列也是高度保守的，但其中也含有一定數(shù)量的假基因，如在菌株LMG 18311中，假基因包括參與合成丙氨酸、賴氨酸、支鏈氨基酸和含硫氨基酸的alaD、dapE、ilvD和yhcE基因，另外菌株CNRZ 1066中的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶aspC3也是假基因［6］。生物信息學(xué)預(yù)測嗜熱鏈球菌LMG 18311和CNRZ 1066具有合成除了組氨酸外的其他氨基酸的所有基因，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的只有參與支鏈氨基酸和脯氨酸合成的基因。由于大部分嗜熱鏈球菌都能在混合有谷氨酰胺、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸的底物中生長，因此推測其他氨基酸可以由菌株自身合成［6］。更多關(guān)于CNRZ 1066和LMG 13811的基因組序列的分析研究表明，嗜熱鏈球菌有20多種潛在的胞內(nèi)肽酶［12］。其中一些肽酶的基因序列已被克隆并研究，包括兩個氨肽酶基因（pepN和pepC）、一個內(nèi)肽酶基因（pepO）、一個X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶基因（pepX）和一個氨肽酶（pepS）［34］。一株?duì)I養(yǎng)缺陷嗜熱鏈球菌中，由于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)、支鏈氨基酸和嘌呤的合成基因失活，使得該菌株不能在乳中生長，因此，嗜熱鏈球菌的正常生長需要具有自身轉(zhuǎn)運(yùn)肽類并轉(zhuǎn)化為氨基酸或合成氨基酸的能力［21］。

3.3.3 氮代謝調(diào)控因子 菌株LMG 18311和CNRZ 1066的基因組中發(fā)現(xiàn)了乳酸乳球菌中調(diào)控基因的同系物，如CodY（Stu1635）、ArgR（Stu0048）、GlnR（Stu0177）、AhrC（Stu1214）以及FhuR（Stu0520、Stu0452和Stu0872）。CodY蛋白是存在于革蘭氏陽性細(xì)菌中的一種上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它能調(diào)控蛋白水解系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸）的濃度增大時，CodY 能夠結(jié)合到蛋白水解系統(tǒng)相應(yīng)基因操縱子的上游序列，從而阻止這些基因的表達(dá)。在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時支鏈氨基酸濃度降低，菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，此時蛋白水解系統(tǒng)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，幫助菌體適應(yīng)營養(yǎng)僵乏的環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)已公布的嗜熱鏈球菌CNRZ1066和LMD-9的基因組信息，推斷嗜熱鏈球菌中也應(yīng)含有一個類似的調(diào)控蛋白CodY，并根據(jù)嗜熱鏈球菌基因組序列設(shè)計(jì)了引物Co1和Co2，分別對5株嗜熱鏈球菌的CodY基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證實(shí)了codY基因的存在，嗜熱鏈球菌的codY基因序列具有非常保守的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CodY蛋白在嗜熱鏈球菌蛋白代謝中的調(diào)控作用，為高效酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)［35］。

4 嗜熱鏈球的防御體系

生產(chǎn)環(huán)境較為安全、雜菌污染較少的乳制品生產(chǎn)發(fā)酵過程中，嗜熱鏈球菌遭受噬菌體污染也成為了一個難以避免的難題。

嗜熱鏈球菌對于噬菌體存在一定的防御機(jī)制。其中成簇的短間隔回文重復(fù)序列以及其相關(guān)核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)（CRISPR-Cas），是人們研究最多的噬菌體防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)的Cas（CRISPR-associated）核酸內(nèi)切酶通過CRISPR序列相關(guān)RNA（crRNA）的定向誘導(dǎo)對外源DNA片段進(jìn)行特異性切割，達(dá)到使噬菌體侵染流產(chǎn)的目的。另外，切割后產(chǎn)生的外源DNA碎片會整合到CRISPR序列中，加強(qiáng)crRNA的定向誘導(dǎo)作用。因此，該系統(tǒng)是一個天然的分子免疫系統(tǒng)。

通過比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌中存在多種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，而且?guī)缀醵己?-4個不同的CRISPR序列。本實(shí)驗(yàn)室鄧凱波等［36］研究實(shí)驗(yàn)室菌種庫中8株嗜熱鏈球菌的CRISPR序列，分別檢測了菌株中的CRISPR序列的存在，并分析了序列同源性，結(jié)果表明除1株菌含有1個CRISPR結(jié)構(gòu)外，其余7株菌均含有3個結(jié)構(gòu)，序列長度最長為2 853 bp，最短僅為101 bp。通過同源性比對發(fā)現(xiàn)，CRISPR序列中的重復(fù)序列與遠(yuǎn)緣菌種具有較高同源性，表明CRISPR序列可能通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得。該研究對我國野生嗜熱鏈球菌抗噬菌體性能的研究提供參考，有利于高品質(zhì)自主發(fā)酵劑研究的進(jìn)展。

5 與保加利亞乳桿菌的共生作用機(jī)制

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在發(fā)酵牛乳的過程中，能夠相互提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，使生長和產(chǎn)酸速度得到很大提升，被稱為共生作用。這種共生作用體現(xiàn)在多方面，其中最為明顯的是保加利亞乳桿菌利用細(xì)胞壁蛋白酶水解乳蛋白，產(chǎn)生肽類和游離氨基酸，為蛋白水解力相對較差的嗜熱鏈球菌提供氮源需求［21］；同時嗜熱鏈球菌為保加利亞乳桿菌提供葉酸、甲酸和CO2，作為合成嘌呤的前體或輔助因子，促進(jìn)保加利亞乳桿菌快速生長［37，38］。

Herve-Jimenez等［22］在嗜熱鏈球菌LMG 18311與保加利亞乳桿菌共同培養(yǎng)，研究對嗜熱鏈球菌表達(dá)特性的影響，結(jié)果表明嗜熱鏈球菌生長后期的糖代謝基因、肽類和氨基酸運(yùn)載體基因上調(diào)表達(dá)未受影響，說明保加利亞乳桿菌了對嗜熱鏈球菌生長的無抑制作用。劉夢晉等（Liu）［39］通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)分析嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的全基因組序列，預(yù)測了兩者之間的水平基因轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明，在酸奶生產(chǎn)歷史中，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌由于長期在同一環(huán)境中共存，導(dǎo)致兩者之間更容易發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，使菌株在基因水平上產(chǎn)生優(yōu)化，有利于更好地相互作用和生長，其中EPS合成基因從嗜熱鏈球菌轉(zhuǎn)移到保加利亞乳桿菌，而含硫氨基酸代謝的cbs-cblB（cglB）-cysE基因簇（或稱為cysM2-metB2-cysE2）則從保加利亞乳桿菌轉(zhuǎn)移到嗜熱鏈球菌。

Herve-Jimenez等［40］及Sieuwerts等［38］通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的相互作用涉及到嘌呤、含硫氨基酸和短鏈脂肪酸的代謝，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能基因組學(xué)方法分析嗜熱鏈球菌LMD-9雙組份系統(tǒng)，測定出6個具有HK和RR的完整TCS（TCS 2、4、5、6、7和9），以及兩個不完整的HK系統(tǒng)（RR01和08）。在對數(shù)生長期時（pH 5.5）的嗜熱鏈球菌添加保加利亞乳桿菌，并以單菌株嗜熱鏈球菌作對照發(fā)現(xiàn)，由于保加利亞乳桿菌的加入，嗜熱鏈球菌的4個RR表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致嗜熱鏈球菌的調(diào)控產(chǎn)生變化［41］，表明在酸奶生產(chǎn)中，嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的共生作用，就是通過雙組份系統(tǒng)感應(yīng)并調(diào)控自身代謝。

Sieuwerts等［38］通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對兩株菌（CNRZ 1066、ATCC BAA-365）進(jìn)行深層次研究發(fā)現(xiàn)，共生過程中保加利亞乳桿菌只存在一個對數(shù)生長期，而嗜熱鏈球菌則出現(xiàn)了不同的生長曲線，分別為延遲期、第一個對數(shù)期、過渡期、第二個對數(shù)期和穩(wěn)定期4個生長步驟；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在共同培養(yǎng)過程中，支鏈氨基酸和含硫氨基酸合成基因發(fā)生上調(diào)，說明兩種菌株難以得到足夠的此類氨基酸，兩個菌種雖然相互提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)，但是由于酪蛋白中僅能釋放出較低含量的支鏈氨基酸（6%-7%）、精氨酸（4%）和半胱氨酸殘基（0.35），所以只依靠桿菌的蛋白質(zhì)水解作用不能為兩個菌種提供足夠的含硫氨基酸和支鏈氨基酸。共生過程中上調(diào)表達(dá)的還有eps基因，EPS主要在嗜熱鏈球菌的發(fā)酵后期產(chǎn)生，可能是培養(yǎng)基低pH值誘導(dǎo)產(chǎn)生EPS，基因epsA-M在第二個對數(shù)期及穩(wěn)定期時才產(chǎn)生高表達(dá)，且EPS產(chǎn)量也相應(yīng)增加。

6 展望

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用使嗜熱鏈球菌的遺傳和生長代謝特性研究得到了豐碩成果，為嗜熱鏈球菌發(fā)酵開發(fā)過程中的關(guān)鍵基因和代謝途徑的發(fā)掘提供了大量信息。在不斷發(fā)展更新的生物技術(shù)的促進(jìn)下，以基因組學(xué)為核心，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)等共同組成了能夠全面理解生物本質(zhì)和特性的系統(tǒng)生物學(xué)。而系統(tǒng)生物學(xué)將依靠互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，逐漸地整合生物學(xué)理論、數(shù)學(xué)模型和應(yīng)用計(jì)算機(jī)等，形成生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的整體分析模式，為嗜熱鏈球菌的研究引入新的階段。不久的將來，圍繞嗜熱鏈球菌如何提高產(chǎn)胞外多糖、風(fēng)味、共生機(jī)制、抗噬菌體等性能，利用最新的生物技術(shù)和多學(xué)科交叉，會出現(xiàn)越來越多的高新成果，為發(fā)酵乳制品的發(fā)展注入新活力。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Property and App lication of Streptococcus thermophilus

Tian Hui Liang Hongzhang Huo Guicheng Evivie Smich Ecareri
（Key Lab of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

Streptococcus thermophilus is one of the most important species of lactic acid bacteria in industry， and it is widely used in the process of producing fermented milk. This review discusses researches on the qualification and application of S. thermophilus， the properties of genome and fermentation， phage defense system， and symbiotic mechanism. In the end， the potential application of modern biological technologies in the study of S. thermophilus properties is prospected.

Streptococcus thermophilus；property；genome；fermentaion；phage；protocooperation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.006

2014-11-14

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100902，2012AA022108）

田輝，男，博士研究生，研究方向：乳品科學(xué)與工程；E-mail：qingdaoyun08@163.com

霍貴成，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品科學(xué)；E-mail：gchuo58@126.com