高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷脂質(zhì)體藥物包封率*

李紅燕，薛大權(quán)，洪怡

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷脂質(zhì)體藥物包封率*

李紅燕，薛大權(quán)，洪怡

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

目的建立測(cè)定黃芩苷脂質(zhì)體中藥物包封率的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Fortis XiC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（35∶65），柱溫為25℃，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。結(jié)果黃芩苷質(zhì)量濃度在6～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 8，n=5），平均回收率為99.51%，RSD為2.09%（n=9）。結(jié)論該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于黃芩苷脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。

高效液相色譜法；黃芩苷；脂質(zhì)體；包封率

黃芩苷，別名貝加靈，主要存在于唇形科植物黃芩（根）、并頭草葉和根及紫薇科植物木蝴蝶、車前科植物大車前等植物中，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、保肝利膽、降壓利尿、解熱鎮(zhèn)靜等藥理作用［1-2］。但其脂溶性、水溶性差，體內(nèi)吸收差，生物利用度低，藥效不穩(wěn)定，從而限制了臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體可有效地提高藥物在體內(nèi)的吸收，顯著改善其生物有效性［3］，提高治療靶向性。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定黃芩苷脂質(zhì)體的包封率，可為制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀（AngilentTechnologies1260 infinity）；SK2200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DLSB-5/20型低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；BP211D型十萬分之一天平；PHS-3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（centrifuge5424R）。黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-201016，純度大于94%）；大豆磷脂（SeebioBiotechnology），膽固醇（科瑞生物）；娃哈哈純凈水；甲醇（色譜純，天津市恒試劑有限公司），乙腈（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1脂質(zhì)體制備［4］

采用薄膜超聲法制備黃芩苷脂質(zhì)體。精密稱取豆磷脂、膽固醇（4∶1，W/W），以三氯甲烷-異丙醇（14∶1，V/V）溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，使其在圓底燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜，加入黃芩苷磷酸緩沖液（pH=7.0）；超聲20min，室溫水化30min，即得黃芩苷脂質(zhì)體混懸液。不加黃芩苷，其余操作均相同的黃芩苷脂質(zhì)體制備方法，得空白脂質(zhì)體。

2.2溶液制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，甲醇溶解并定容制得質(zhì)量濃度為200μg/mL的貯備液，準(zhǔn)確移取貯備液配制成質(zhì)量濃度為6，12，24，40，60，80，100μg/mL的系列對(duì)照品溶液，純水定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用［5］，作為對(duì)照品溶液。將黃芩苷脂質(zhì)體混懸液10mL于4℃及10 000 r/min離心15min，取離心后的上清液1mL，純水定容至100mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濾液即為未包封的黃芩苷分離溶液。取空白脂質(zhì)體混懸液，按未包封的黃芩苷分離溶液制備方法制得空白脂質(zhì)體離心溶液，即為陰性對(duì)照品溶液。

2.3黃芩苷含量測(cè)定

2.3.1色譜條件［6］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：FortisXiC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相∶乙腈-0.2%磷酸（35∶65）；柱溫：25℃；流速1.0mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；進(jìn)樣量：20μL。取黃芩苷對(duì)照品溶液、黃芩苷脂質(zhì)體分離溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL，進(jìn)樣分析。色譜圖見圖1?？梢姡軇┘爸|(zhì)體輔料對(duì)黃芩苷測(cè)定無干擾，黃芩苷色譜峰保留時(shí)間約為7.9min，拖尾因子為0.99，理論板數(shù)為33 966，符合要求［4］。

圖1　高效液相色譜圖

2.3.2方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液，配制成6，12，24，40，60，80，100μg/mL的系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μL測(cè)定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=55.247C-63.886，r=0.9998（n=7）。結(jié)果表明，黃芩苷在質(zhì)量濃度6～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)［7］：分別取質(zhì)量濃度為12，60，100μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，于1 d內(nèi)測(cè)定，每2 h測(cè)定1次，共測(cè)5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每日進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)5 d。結(jié)果低、中、高濃度的日內(nèi)精密度的RSD分別為1.50%，0.16%，0.07%（n=5），日間精密度的RSD分別為1.72%，0.25%，0.12%（n=5）。

回收率試驗(yàn)［8］：取1mL空白脂質(zhì)體溶液，純水定容至100mL，取9份3 mL該稀釋溶液，分別置10 mL容量瓶中，平均分成3組，分別準(zhǔn)確加入質(zhì)量濃度為50μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液2，3，4mL，純水定容至10mL，依法測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1　黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4黃芩苷脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

按照黃芩苷脂質(zhì)體制備方法制備3批脂質(zhì)體，制得分離黃芩苷脂質(zhì)體與游離黃芩苷，計(jì)算公式如下［9］：包封率（EE）=100%×（W總-W測(cè)）/W總，其中W總指黃芩苷總藥量濃度，W測(cè)指測(cè)得的黃芩苷濃度。結(jié)果3批次的黃芩苷脂質(zhì)體包封率分別為34.73%，36.05%和37.82%。

3　討論

參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》中黃芩苷項(xiàng)下高效液相色譜流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將甲醇換成乙腈能有效減低峰前沿，峰形良好且出峰穩(wěn)定。故采用流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（35∶65），色譜條件靈敏度高，輔料峰不干擾藥物峰，可用于產(chǎn)品質(zhì)量控制。

測(cè)定脂質(zhì)體包封率的難點(diǎn)是分離脂質(zhì)體和游離藥物，相對(duì)常用的方法包括葡聚糖微柱離心法、超速離心法、透析法［10］。低溫高速離心法分離脂質(zhì)體分離效率高，保護(hù)藥物穩(wěn)定性，快速簡(jiǎn)便。

本試驗(yàn)中所測(cè)得黃芩苷脂質(zhì)體包封率較低，究其原因，黃芩苷的脂溶性和水溶性都較差，在后期試驗(yàn)中將繼續(xù)探索如何提高黃芩苷脂質(zhì)體的包封率。

［1］姬小婷，李鳳，魏虹，等.黃芩苷和牛血清白蛋白雙緩釋制劑的制備及釋藥性能檢測(cè)［J］.口腔生物醫(yī)學(xué)，2012，3（2）：57-60.

［2］中國(guó)藥學(xué)會(huì)《藥學(xué)大辭典》編輯委員會(huì).藥學(xué)大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：409.

［3］陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：289-292.

［4］洪怡，何偉，李丹，等.黃芩苷脂質(zhì)體的制備及體外抗腫瘤作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（3）：29-31.

［5］郗艷麗，馬穎哲，牛鳳蘭.HPLC測(cè)定3，4，5-三羥基苯甲酸脂質(zhì)體藥物含量及包封率［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45（15）：1 176-1 178.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：188-189.

［7］白銘，張恒術(shù)，黃崇本.辣椒素脂質(zhì)體的制備及其穩(wěn)定性考察［J］.中國(guó)藥房，2006，17（8）：588-590

［8］劉利萍，胡六江，周曉芬.HPLC法測(cè)定阿達(dá)帕林脂質(zhì)體中藥物含量及包封率［J］.藥物分析雜志，2007，27（9）：1 462-1 465.

［9］席枝俠，仵文英，薛紅安，等.黃芩苷脂質(zhì)體的制備和穩(wěn)定性考察［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25（1）：75-76.

［10］崔福德.藥劑學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：410-411.

Determ ination of Drug Encapsulation Efficiency of Baicalin Liposomes by HPLC

Li Hongyan，Xue Daquan，Hong Yi
（College of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan，Hubei，China 430065）

Objective To establish an HPLC method for the determination of drug encapsulation efficiency of baicalin liposomes. M ethods The chromatographic column was Fortis Xi C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution（35∶65），the column temperature was 25℃，the flow rate was 1.0 mL/min，the UV detection wavelength was 278 nm.Results The baicalin concentration showed a good linear relationship in the range of 6-100μg/mL（r=0.999 8，n=5）. The average recovery rate was 99.51%，RSD was 2.09%（n=9）.Conclusion This method is accurate，simple，rapid and can be used for the determination of baicalin liposomes encapsulation efficiency.

HPLC；baicalin；liposomes；encapsulation efficiency

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）18-0072-02

李紅燕（1989-）女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c新技術(shù)，（電子信箱）350155673@qq.com；洪怡，女，副教授，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c新技術(shù)，本文通訊作者，（電子信箱）hongyiwh@sina.com。

2015-03-04）

*湖北省教育廳優(yōu)秀中青年科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：Q20101804。