農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蓖麻轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

李偉 翟羽佳 李鵬程 王昌祿

（天津科技大學(xué) 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300457）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蓖麻轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

李偉 翟羽佳 李鵬程 王昌祿

（天津科技大學(xué) 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

針對影響農(nóng)桿菌侵染效率的主要因素進(jìn)行條件優(yōu)化，確立了以O(shè)D600為0.8的菌液侵染、預(yù)培養(yǎng)5 d后的外植體為最佳侵染條件；侵染外植體經(jīng)過5 d的共培養(yǎng)并除菌后，轉(zhuǎn)到含有250 mg/L Kan的培養(yǎng)基中進(jìn)行再生誘導(dǎo)，獲得了多株具有Kan抗性的再生植株；通過在共培培養(yǎng)基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT，有效地抑制了侵染后外植體的褐化現(xiàn)象，提高了篩選階段抗性芽的成活率；對具有Kan抗性的再生植株進(jìn)行PCR和Southern blot驗(yàn)證，共獲得18株包含外源基因的陽性轉(zhuǎn)化株。

蓖麻；農(nóng)桿菌侵染；轉(zhuǎn)化體系

蓖麻是世界十大油料作物之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的工業(yè)用途，是一種十分重要的工業(yè)油料作物。人們對蓖麻產(chǎn)業(yè)的重視直接導(dǎo)致蓖麻油需求量劇增，使得蓖麻原料供求關(guān)系極不平衡，而傳統(tǒng)的育種方法又無法有效解決這一矛盾，于是越來越多的人開始將分子育種技術(shù)應(yīng)用到蓖麻育種工作中［1］。

早期對蓖麻分子育種的研究主要包括蓖麻再生體系的構(gòu)建，自1998年Sujatha Reddy［2］首次報(bào)道了更為穩(wěn)定的再生體系后，以印度和美國為主的幾家科研機(jī)構(gòu)先后報(bào)道了以不同外植體配以不同的誘導(dǎo)條件構(gòu)建的再生體系，我國也有很多針對國內(nèi)蓖麻品種進(jìn)行的體外再生研究，這些都為蓖麻實(shí)施分子育種奠定了良好的基礎(chǔ)。但對蓖麻的轉(zhuǎn)化體系研究還處于初級階段，相關(guān)報(bào)道較少。2000年，Mckeon等［3］曾申請過蓖麻轉(zhuǎn)化的相關(guān)專利，這是世界上首次成功實(shí)施蓖麻轉(zhuǎn)化的報(bào)道，轉(zhuǎn)化率0.42%；2005年，Sujatha等［4］在以胚軸為外植體，成功構(gòu)建了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蓖麻轉(zhuǎn)化體系，但轉(zhuǎn)化率極低；2008年，Sailaja等［5］構(gòu)建了以萌發(fā)后的胚為外植體的基因槍轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1.4%，這也為蓖麻轉(zhuǎn)化提供了新的思路；隨后Sujatha等［6］分別利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍的轉(zhuǎn)化方法，均成功地將Cry1基因轉(zhuǎn)入了蓖麻組織中，獲得了帶有目的基因的轉(zhuǎn)化株，這也是第一例成功實(shí)施蓖麻分子育種的報(bào)道；我國的劉鵬等［7］也通過對蓖麻子葉節(jié)外植體實(shí)施農(nóng)桿菌侵染，并成功獲得了轉(zhuǎn)化株。

盡管蓖麻分子育種研究取得了一定進(jìn)展，但依然存在穩(wěn)定性差、難以重復(fù)等問題。本研究擬在自主構(gòu)建的胚尖外植體再生體系基礎(chǔ)上，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蓖麻轉(zhuǎn)化研究，通過對侵染菌種、侵染時(shí)機(jī)、侵染強(qiáng)度等影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建更為穩(wěn)定的蓖麻轉(zhuǎn)化體系，旨在為高效率進(jìn)行蓖麻分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用蓖麻品種稼祥2號，購于山東稼祥蓖麻有限公司。侵染農(nóng)桿菌采用EHA105和GV3101兩株植物轉(zhuǎn)化常用根癌農(nóng)桿菌，并以pBI121作為侵染質(zhì)粒，實(shí)施農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，制備工程菌種。農(nóng)桿菌及質(zhì)粒均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)作物科學(xué)研究所抗逆室惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 實(shí)驗(yàn)所用MS培養(yǎng)基購于Phytotech公司，6-芐基嘌呤（BA）、吲哚丁酸（IBA）、乙酰丁香酮（AS）、硫代硫酸鈉、二硫基蘇糖醇（DTT）、卡那霉素（Kan）、頭孢霉素（Cef）等植物激素及其他生化制劑均購于天津藍(lán)碧橙生物科技有限公司。

1.1.3 引物合成 試驗(yàn)根據(jù)pBI121中的nptII基因序列設(shè)計(jì)了檢測引物，委托天津鼎國公司進(jìn)行合成。引物序列：KanF：5'-TCGTCACCCTTTCTCGGTC-3'；KanR：5'-CTGGCGGAGAATCATACGCA-3'。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)所用基本培養(yǎng)基為Murashige & Skoog（MS）培養(yǎng)基，配以30 g/L蔗糖和6.4 g/L瓊脂粉，pH（5.8±0.1）。萌發(fā)培養(yǎng)基：MS +0.3 mg/L BA；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L BA；共培培養(yǎng)基：MS+0.35 mg/L BA+20 mg/L AS+ 124 mg/L Na2S2O3+152.4 mg/L DTT；恢復(fù)培養(yǎng)基：MS+ 0.35 mg/L BA+350 mg/L Cef，；篩選芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.35 mg/L BA+0.25 mg/L IBA+350 mg/L Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）；篩選根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MS+0.5 mg/L IBA+350 mg/L Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）。以上培養(yǎng)基滅菌條件為：121℃，20 min.

植物組培培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 Lx，光照周期16/8，28℃培養(yǎng)。

1.2.1 外植體的獲取 取完整飽滿的蓖麻種子去殼；用0.1%的KMnO4浸泡10 min消毒；用無菌水反復(fù)沖洗3-4次；將滅菌的種子胚乳撥開，用鑷子小心取出蓖麻胚，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，28℃，暗培養(yǎng)5 d。

去除萌發(fā)胚頂端芽結(jié)構(gòu)，取形態(tài)學(xué)上端3-5 mm的胚尖部位為外植體，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃，光照培養(yǎng)3-7 d。

1.2.2 侵染菌種的活化 挑取轉(zhuǎn)入pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105和GV3101單菌落，分別接種于含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，黑暗培養(yǎng)過夜；取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌液1-2 mL，重新接種于有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，培養(yǎng)4-6 h，進(jìn)行二次活化；將活化好的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行5 000 r/min離心，收集菌體，用無菌水稀釋成特定濃度，備用。

1.2.3 侵染農(nóng)桿菌的篩選及侵染強(qiáng)度的優(yōu)化 將活化好的農(nóng)桿菌用無菌水稀釋成OD600值為0.6、0.8和1.0三個(gè)濃度的侵染液；將準(zhǔn)備好的外植體用手術(shù)刀輕輕在形態(tài)學(xué)上端制造數(shù)到劃痕，置于稀釋好的侵染液中，黑暗條件下，28℃侵染15 min；將侵染后的外植體取出，轉(zhuǎn)移到鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸去多余的菌液，接種于鋪有一張濾紙的共培培養(yǎng)基上，黑暗條件下，28℃進(jìn)行共培培養(yǎng)3、5和7 d；共培后的外植體經(jīng)多次沖洗除菌后，接種于篩選芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d；通過統(tǒng)計(jì)篩選過程中誘導(dǎo)出的抗性外植體數(shù)目，確定最佳的侵染濃度及共培時(shí)間。根據(jù)侵染菌種、侵染濃度以及共培時(shí)間的不同設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)批次，每組實(shí)驗(yàn)100個(gè)外植體，重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.4 侵染時(shí)機(jī)的選擇 分別選取在含有0.2 mg/L BA的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、5和7 d后的外植體，以O(shè)D600值為0.6、0.8和1.0三個(gè)濃度EHA105菌液實(shí)施侵染，經(jīng)共培5 d后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基觀察外植體生長情況。每組實(shí)驗(yàn)100個(gè)外植體，重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.5 共培條件的優(yōu)化 選取侵染后的外植體，分別接種于含有0、20、30和40 mg/L AS的共培培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過統(tǒng)計(jì)篩選過程中外植體的抗性芽數(shù)目，確認(rèn)最佳AS濃度，同時(shí)對比添加124 mg/L Na2S2O3或152.4 mg/L DTT等還原劑對后期外植體生長狀況的影響，確立最佳的共培階段培養(yǎng)基配方。

1.2.6 植株再生 共培后的外植體，經(jīng)除菌步驟后，轉(zhuǎn)接到不含篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基中，28℃，光照培養(yǎng)5 d；選取正常生長的外植體，轉(zhuǎn)入到篩選芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；待抗性芽伸長至3-5 cm時(shí)由基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；將正常生根的再生植株經(jīng)煉苗后移入土壤中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.7 抗性再生植株的PCR驗(yàn)證 取抗性再生植株的新鮮葉片200 mg進(jìn)行DNA提取。采用康維試劑生產(chǎn)的PlantGen DNA試劑盒。以抗性植株DNA為待測模板，以KanF、KanR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。PCR檢測以pBI121質(zhì)粒為陽性對照模板，以野生型蓖麻DNA為陰性對照模板。

1.2.8 Southern blot檢測 為進(jìn)一步驗(yàn)證抗性再生植株轉(zhuǎn)化成功與否，對PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了Southern blot檢測。采用Roche公司生產(chǎn)的地高辛標(biāo)記和檢測試劑盒II。檢測樣品為待測植物DNA的BamH I和Hind III酶切產(chǎn)物；以pBI121中nptII基因片段合成探針標(biāo)記；具體雜交步驟參照該試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 菌種的選擇與侵染強(qiáng)度

使用兩種農(nóng)桿菌配制不同濃度的侵染菌液進(jìn)行了侵染，結(jié)果如表1所示。從篩選培養(yǎng)21 d外植體的成活數(shù)目來看，兩種根癌農(nóng)桿菌的侵染效果相差不大，以EHA105效果較好。侵染菌液濃度對侵染效果有一定影響，以O(shè)D600為0.8侵染獲得的抗性外植體數(shù)較多。相比之下，共培時(shí)間對篩選過程中轉(zhuǎn)化效率影響較大，共培時(shí)間過長還會(huì)引起較為嚴(yán)重的外植體褐變現(xiàn)象，這說明共培時(shí)期是農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染的主要階段。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，共培培養(yǎng)5 d時(shí)，抗性外植體的成活率最高。

表1 侵染步驟的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2 侵染時(shí)機(jī)的選擇

實(shí)施轉(zhuǎn)化過程中，首先需要將外源基因整合到植物細(xì)胞中表達(dá)，此外，還需要將帶有外源基因的細(xì)胞培育成完整的植株。但由于轉(zhuǎn)化針對的外植體是一個(gè)多細(xì)胞組織，其中真正具有發(fā)育成完整植株潛力的細(xì)胞畢竟只是少數(shù)，因此，需要對侵染時(shí)間進(jìn)行研究，盡量選擇胚性細(xì)胞開始或已經(jīng)形成的階段實(shí)施侵染，以此來提高侵染具有胚性細(xì)胞的可能性。試驗(yàn)選擇預(yù)培養(yǎng)3-7 d后的外植體作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行侵染試驗(yàn)，通過統(tǒng)計(jì)不同侵染時(shí)間對抗性芽生成數(shù)目的影響，確定最佳侵染時(shí)機(jī)。結(jié)果（表2）顯示，經(jīng)過一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)后，外植體的成活率有所提高，外植體的褐化現(xiàn)象也得到一定的抑制，而侵染菌液濃度影響不大?？剐匝繑?shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，預(yù)培養(yǎng)5 d后的外植體，在侵染后抗性芽的生成數(shù)目最多。原因可能是由于這個(gè)時(shí)間胚細(xì)胞的活躍程度與農(nóng)桿菌的侵染效力最為匹配，使得通過侵染轉(zhuǎn)入外源基因并且具有再生潛力細(xì)胞數(shù)目更多。預(yù)培養(yǎng)7 d后的外植體生成的抗性芽數(shù)目明顯減少，這可能是由于錯(cuò)過了最佳侵染時(shí)機(jī)所致。最終實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)培養(yǎng)5 d后的外植體作為侵染外植體。

表2 預(yù)培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化效果的影響

2.3 共培培養(yǎng)基的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在共培培養(yǎng)基中添加具有強(qiáng)還原作用的物質(zhì)，以期緩解和抑制侵染后的褐化現(xiàn)象。通過統(tǒng)計(jì)共培后恢復(fù)培養(yǎng)過程中的褐化率和抗性外植體生長情況（表3），發(fā)現(xiàn)適量的AS確實(shí)能提高抗性芽的生成數(shù)目，同時(shí)添加Na2S2O3、DTT也能明顯降低外植體褐化的幾率。最后，選擇在共培培養(yǎng)基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT作為最佳共培條件。

表3 共培培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

圖1 抗性植株P(guān)CR檢測電泳

2.4 抗性苗的PCR結(jié)果

通過Kan抗性篩選及再生誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)最終獲得了29株再生植株。對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中的nptII基因進(jìn)行PCR檢測，在18株再生植株中檢測到了外源基因，確定成功整合轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)化陽性株。部分轉(zhuǎn)化株P(guān)CR檢測電泳結(jié)果如圖1所示。陽性對照及陰性對照顯示正常，證明檢測結(jié)果可靠。

2.5 Southern blot檢測結(jié)果

將PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)化株，提取其基因組DNA，進(jìn)行Southern blot檢測。分別提取待測植株葉片組織DNA經(jīng)Hind III和BamH I消化酶切后，進(jìn)行Southern blot檢測實(shí)驗(yàn)，雜交結(jié)果如圖2所示。不同的轉(zhuǎn)化株，其外源基因插入的位點(diǎn)及拷貝數(shù)有一定的差異，但基本都具有外源基因的結(jié)合信號，證明轉(zhuǎn)化載體pBI121已經(jīng)成功的整合到了蓖麻基因組中，但各轉(zhuǎn)化株中外源基因的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)可能有較大差異。

圖2 Southern blot檢測結(jié)果

2.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化全過程

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化主要步驟如圖3所示，轉(zhuǎn)化周期約為3-5個(gè)月，平均轉(zhuǎn)化率為0.85%。

圖3 胚尖外植體轉(zhuǎn)化過程

3 討論

農(nóng)桿菌的侵染是指農(nóng)桿菌通過感染植物創(chuàng)傷部位的細(xì)胞而改變其表達(dá)基因的過程，是對植物細(xì)胞造成損害的過程。侵染強(qiáng)度主要由侵染時(shí)間和侵染菌液濃度兩個(gè)因素決定。侵染強(qiáng)度過大則可能會(huì)使本就造成創(chuàng)傷的細(xì)胞受到更大的損害，導(dǎo)致組織壞死；而侵染強(qiáng)度過小則可能會(huì)影響侵染效率。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，共培后的外植體即使發(fā)芽后也很容易出現(xiàn)組織褐變壞死的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化植株的獲得，這可能與侵染強(qiáng)度過大有關(guān)。因此，選擇適宜的侵染強(qiáng)度對于防止組織在后續(xù)組培過程中壞死有重要意義，同時(shí)也是提高抗性芽誘導(dǎo)效率的重要因素。

除侵染強(qiáng)度之外，植物細(xì)胞的生長狀態(tài)也是影響其被侵染后成活效率的因素之一。截取外植體的過程是對植物細(xì)胞進(jìn)行物理傷害的過程，這些細(xì)胞在被侵染后相當(dāng)于受到雙重傷害，使其更容易產(chǎn)生嚴(yán)重的褐化反應(yīng)［10］。將外植體先進(jìn)行一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)后再實(shí)施侵染，可緩解這些植物細(xì)胞因物理傷害對其正常生長的影響，不至于因連續(xù)受到損傷壞死。剛截取的外植體也需要一定時(shí)間的誘導(dǎo)才能開始形成具有胚性的細(xì)胞，這也可以最大限度的保證侵染后的細(xì)胞能夠發(fā)育成完整的植株。最終實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)培養(yǎng)5 d后的外植體作為侵染對象，同時(shí)優(yōu)化了共培培養(yǎng)基成分，提高了獲得轉(zhuǎn)化植株的效率。

目前，大多數(shù)農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化體系都是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)，對于蓖麻的轉(zhuǎn)化研究，目前成功獲得轉(zhuǎn)化植株的幾篇報(bào)道也多是通過農(nóng)桿菌侵染實(shí)現(xiàn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化法，效果穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，但也存在一系列問題。由于基因轉(zhuǎn)入步驟完全依靠農(nóng)桿菌本身的侵染能力，很多因素?zé)o法控制，如插入位點(diǎn)的不確定性、轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)不確定性等［11］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也出現(xiàn)了類似的情況。這說明在農(nóng)桿菌侵染的過程中，還有很多值得繼續(xù)探索的內(nèi)容，如具體整合作用基因、插入位點(diǎn)影響因素等，這些工作雖然基礎(chǔ)，但對于其更好的生產(chǎn)應(yīng)用意義重大，值得科研工作者們進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

本研究通過對影響農(nóng)桿菌侵染效率的關(guān)鍵因素進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蓖麻轉(zhuǎn)化體系，確定了以最佳侵染條件為以O(shè)D600為0.8的菌液侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)5 d后的外植體；最佳共培時(shí)間為5 d；共培培養(yǎng)基中添加20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3，和152.4 mg/L DTT可有效地提高轉(zhuǎn)化效率并緩解外植體的褐化現(xiàn)象；經(jīng)分子驗(yàn)證確認(rèn)獲得了18株陽性轉(zhuǎn)化株，平均轉(zhuǎn)化率為0.85%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation in Castor（Ricinus communis L.）

Li Wei Zhai Yujia Li Pengcheng Wang Changlu
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457）

The main factors affecting the efficiency of Agrobacterium infection were optimized， and the optimal infection conditions were 5-day-old pre-cultured explants cultured in bacteria solution with OD6000. 8. Infected explants after 5 d of co-culture were transferred to medium with 250 mg/L Kan for bud induction and many strains with Kan resistance ability were obtained. By adding 20 mg/L AS， 124mg/L Na2S2O3and 152. 4 mg/L DTT in the common culture medium， browning phenomenon was effectively inhibited and survival rate of resistant shoots was enhanced. Regenerated plants with resistance to Kan were verified by PCR and Southern blot test. Total 18 positive transformants were obtained.

Castor（Ricinus comunis L.）；Agrobacterium infection；transformation system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.022

2014-09-23

李偉，男，博士，研究方向：植物分子育種；E-mail：skyinmyhear@126.com

王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品生物技術(shù)；E-mail：clw123@tust.edu.cn