牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黃牛組織的表達分析

趙娟花 裴杰 梁春年 郭憲 吳曉云 張良斌 閻萍

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所　甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州　730050）

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黃牛組織的表達分析

趙娟花 裴杰 梁春年 郭憲 吳曉云 張良斌 閻萍

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州730050）

旨在對牦牛CAV-3基因進行克隆、生物信息學分析，并對其在牦牛組織中的表達規(guī)律進行初步研究。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的黃牛CAV-3基因的mRNA序列并設計特異性引物，應用RT-PCR技術(shù)克隆牦牛CAV-3基因的編碼區(qū)。運用生物信息學方法，分析并預測牦牛Caveolin-3蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、蛋白結(jié)構(gòu)域以及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。通過半定量PCR技術(shù)檢測CAV-3基因mRNA在牦牛和黃牛各組織中的表達；利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測牦牛和黃牛肌肉組織中CAV-3基因 mRNA表達水平。牦牛CAV-3的編碼區(qū)全長631 bp，共編碼151個氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾臟、腎臟、肝臟、卵巢組織中均不表達，僅在心臟和肌肉組織中表達，且在心臟組織的表達水平高于肌肉組織，CAV-3基因在黃牛各組織中的表達結(jié)果與牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表達低于黃牛肌肉組織，但差異不顯著（P＞0.05）。

牦牛；Caveolin-3；克?。槐磉_分析

小窩（caveolae），又稱胞膜窖，是細胞膜上直徑為50-100 nm左右的囊泡凹陷結(jié)構(gòu)，廣泛存在于多種類型細胞膜上。在上皮細胞、脂肪細胞和肌肉細胞的質(zhì)膜中含量較為豐富［1，2］。小窩蛋白（Caveolin），又稱窖蛋白，是構(gòu)成小窩基本組分的一類標志蛋白［3，4］，其分子量在21-24 kD之間。目前，已知有4種窖蛋白Caveolin-1（α，β兩種亞型）、Caveolin-2和Caveolin-3分別由哺乳動物的CAV-1，CAV-2，CAV-3基因編碼組成［5］。Caveolin-1可單獨或與Caveolin-2協(xié)作形成穩(wěn)定的寡聚體復合物，并廣泛存在于內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和脂肪細胞等細胞中［6，7］。據(jù)報道，Caveolin-3是整合在 caveola上的肌細胞特異性蛋白，且可能與肌肉的發(fā)生以及功能的維持有關(guān)［8］。該蛋白廣泛存在于多種肌細胞中，如心肌細胞、骨骼肌細胞等［9］。因此，探究CAV-3基因的功能及在肌肉發(fā)生過程中的作用，對更好地開展有關(guān)牦牛肌肉性狀的育種工作具有一定的參考價值。有報道稱，在人類骨骼肌纖維中慢肌的CAV-3表達量遠遠低于快肌中CAV-3的表達量，這表明CAV-3在調(diào)控肌纖維的發(fā)育類型和生長發(fā)育上有重要作用［10，11］。目前，對CAV-3基因的研究僅限于人和小鼠上，尚無該基因在牦牛和黃牛上的研究報道。本研究以甘南牦牛為研究對象，對牦牛CAV-3基因編碼區(qū)序列進行克隆，對通過CAV-3基因編碼區(qū)推斷獲得的CAV-3蛋白序列進行蛋白特征分析，比較該基因的mRNA在牦牛和黃牛肌肉組織中的表達差異，旨在為研究該基因在肌肉發(fā)生和肌肉生理過程中的可能作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗用3歲母牦牛選自甘南藏族自治州，3歲母黃牛選自臨夏回族自治州。待牛屠宰后，采集牛的背最長肌、腎臟、肝臟、心臟、卵巢、脾臟和肺組織，保存于液氮中迅速帶回實驗室。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、pMD19-T克隆載體和DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa）公司；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、Taq酶Mix、質(zhì)粒提取試劑盒、E.coli DH5α、X-gal、IPTG購自北京天根公司；瓊脂粉、胰蛋白胨和酵母浸出粉購自 OXOID 公司。

1.1.3 引物設計與合成 根據(jù) GenBank中黃牛CAV-3基因中的mRNA序列（登錄號：NM_001046558）和GAPDH mRNA序列（登錄號：NM_001034034），利用 Premier 5.0 分別設計牦牛CAV-3 基因全編碼區(qū)的擴增引物、定量 PCR引物及內(nèi)參引物，并由大連寶生物公司合成。引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物長度，見表1。

表1 引物序列及其擴增特性

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 以采集的牦牛和黃牛的背最長肌及其它組織為材料，根據(jù)RNA提取試劑盒的使用說明提取RNA，使用分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測所獲RNA的純度和完整性，并置于-80℃保存。

1.2.2 RT-PCR 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行反轉(zhuǎn)錄反應，以所獲RNA為模板合成所需cDNA。在PCR管依次加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase Free H2O 6 μL，總RNA 1 μL，混勻后在42℃ 2 min，85℃ 5 s條件下反應。待上述反應結(jié)束后，在反應液中依次加入5×PrimerSript Buffer 4 μL，RNase Free H2O 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，PrimerSript RT Enzyme Mix 1 μL，混合后42℃25 min，85℃ 5 s條件下繼續(xù)反應，并最終以此反應液為模板進行定量試驗。

1.2.3 RT-PCR擴增牦牛CAV-3基因的CDS區(qū) PCR反 應 體 系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，RNase Free H2O 19 μL，10 mmol/L引物F、R各2 μL，cDNA 2 μL。PCR 反應條件：Lid 105℃；95℃預變性4 min；95℃變性30 s，57.6℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.4 牦牛CAV-3基因CDS區(qū)的克隆 將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T克隆載體連接，在16℃過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài) E.coli DH5α菌中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于37℃、100 r/min培養(yǎng)90 min，均勻涂在含有Amp、X-gal、IPTG 的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h。挑取白色陽性菌落，于含有Amp的LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。PCR擴增鑒定后，將陽性菌落送至上海生工測序公司進行測序。

1.2.5 牦牛CAV-3基因與Caveolin-3蛋白的生物信息學分析 使用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST在線檢索工具對所獲序列進行同源序列比對；用ORF Finder在線程序預測開放閱讀框；運用ExPASy網(wǎng)站的Protparam和ProtScale在線工具預測分析牦牛Caveolin-3的基本理化性質(zhì)和疏水性；采用SignalP3.0、TMHMM Server v.2.0在線分析程序預測Caveolin-3的信號肽位點和跨膜區(qū)域；采用Interpro在線分析軟件預測的Caveolin-3的蛋白結(jié)構(gòu)域，并用SABLE在線預測網(wǎng)站預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.6 半定量 PCR檢測牦牛和黃牛CAV-3基因的表達 定量 PCR反應體系：2×Taq Mix 45 μL，10 mmol/L的上、下游引物各4.5 μL，ddH2O 27 μL，充分混勻后分裝到8個PCR 管中各9 μL，再在各管中分別加入1 μL各組織cDNA模板，充分混勻。反應條件：95.5℃ 5 min；95℃ 30 s，57.6℃ 30 s，72℃20 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物由 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測牦牛CAV-3基因表達量 熒光定量PCR反應體系：2×SYBR?Premix Ex TaqTM5 μL，10 mmol/L的上、下游引物各 0.2 μL，ddH2O 4 μL，cDNA 模板0.6 μL，充分混勻。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，40個循環(huán)。試驗以GAPDH為內(nèi)參，每個樣品做3個重復，運用2-△△ct的方法計算目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 牦牛CAV-3基因的PCR擴增

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條介于500-700 bp之間的DNA片段，與預期DNA片段（631 bp）大小一致（圖1）。

圖1 CAV-3基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳

2.2 牦牛CAV-3基因的序列測定及分析

鑒定的陽性重組質(zhì)粒送至上海生工測序公司測序，通過同源序列比對證明構(gòu)建的重組載體中含有CAV-3基因的全長編碼區(qū)序列。對克隆的CAV-3基因序列進行開放性閱讀框分析，得知CAV-3基因含有一個456 bp的開放性閱讀框，編碼151個氨基酸，起始密為ATG，終止密碼子為TGA（圖2）。

圖2 牦牛CAV-3基因和編碼蛋白的序列

2.3 牦牛Caveolin-3蛋白的生物信息學分析

2.3.1 牦牛Caveolin-3蛋白的理化性質(zhì)和疏水性/親水性預測和分析 通過Protparam工具預測牦牛Caveolin-3蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白的分子量為17.2903 kD，理論等電點（pI）為5.75。分子式是C798H1230N192O214S11，總原子數(shù)2 445個。含有帶負電荷的殘基（Asp+G1u）16個，帶正電荷的殘基（Arg + Lys）13個。該蛋白由常見的20種基本氨基酸組成，其中含量最高的分別是Ile、Leu和Val（均為9.9%），含量最低的分別是Met和Gin（均為2.0%）。運用ProtScale工具分析牦牛Caveolin-3蛋白的親水性和疏水性，根據(jù)氨基酸的分值與親水性成反比的規(guī)律可知：牦牛Caveolin-3蛋白多肽鏈第30位Lys和第31位Asn具有最低的分值-2.556和最強的親水性；第83位Pro具有最高的分值2.556和最強的疏水性；且整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性（圖3）。

圖3 牦牛Caveolin-3蛋白疏水性分析

2.3.2 牦牛Caveolin-3 蛋白信號肽、跨膜區(qū)分析和結(jié)構(gòu)域預測 使用SignalP3.0預測信號肽的分泌途徑和切割位點，發(fā)現(xiàn)沒有信號肽。用TMHMM2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)此編碼蛋白第1-78個氨基酸位于膜外，第79-101個氨基酸螺旋跨膜，而第102-151個氨基酸位于膜外。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中能折疊成特定三維結(jié)構(gòu)的一段區(qū)域，是蛋白序列結(jié)構(gòu)和進化單元，具有一定生物學功能。用Interpro在線工具對牦牛Caveolin-3蛋白進行結(jié)構(gòu)域預測，結(jié)果（圖4）顯示該序列在第79-101位氨基酸之間具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖4 牦牛CAV-3基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預測

2.3.3 牦牛Caveolin-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測 蛋白質(zhì)的生物學活性和理化性質(zhì)取決于空間結(jié)構(gòu)，因此預測與分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對了解其空間結(jié)構(gòu)有重要意義。用SABLE服務器預測其Caveolin-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白由67.55% α螺旋、13.91%延伸鏈和17.88%無規(guī)則卷曲組成（圖5）?？赏茢酂o規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈是牦牛Caveolin-3蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)元件。

圖5 牦牛Caveolin-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測

2.4 牦牛、黃牛各組織器官中CAV-3基因mRNA表

達水平分析

通過半定量PCR檢測分析，在牦牛肝臟、脾臟、肺、腎臟、卵巢組織中均無CAV-3基因mRNA表達，僅在心臟和肌肉組織中有表達，且心臟組織的表達高于肌肉組織（圖6）。CAV-3基因mRNA在黃牛各組織中的表達情況與其在牦牛組織表達結(jié)果一致（圖7）。

圖6 半定量 PCR分析CAV-3基因mRNA 在牦牛7個組織器官中的表達

2.5 CAV-3基因在牦牛和黃牛肌肉中的mRNA表達分析

通過實時熒光定量PCR對牦牛和黃牛肌肉組織中CAV-3基因表達水平進行檢測。定量結(jié)果用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)牦牛基因mRNA表達水平低于黃牛，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖7 半定量 PCR分析CAV-3基因mRNA 在黃牛7個組織器官中的表達

圖8 CAV-3 mRNA在牦牛和黃牛肌肉組織中的表達水平

3 討論

長久以來窖蛋白（Caveolin）被認為是組成胞膜窖的基本蛋白結(jié)構(gòu)單元，但是在近期的研究中發(fā)現(xiàn)Caveolin-3也是肌纖維橫列小管的重要組成部分，特別在發(fā)育的肌肉中Caveolin-3扮演著非常重要的角色［12］。本研究首次克隆得到了牦牛CAV-3基因的編碼區(qū)全長631 bp，共編碼151個氨基酸?？缒び蛞话闶怯?0個左右的疏水性氨基酸殘基組成，是膜內(nèi)蛋白與膜脂結(jié)合的主要部位。通過對跨膜域的預測與分析，對該蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和分布具有了一定的認識和了解。本試驗通過生物信息學的方法對Caveolin-3蛋白進行分析，結(jié)果表明牦牛Caveolin-3蛋白在第79-101位氨基酸具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。信號肽一般由15-30個氨基酸組成，是疏水性肽片段，位于新合成肽鏈的N末端，在蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體質(zhì)膜的分泌途徑中發(fā)揮重要作用［13］。一般可以通過分析蛋白質(zhì)N端有無存在信號肽，初步判斷該蛋白是否為分泌蛋白。本研究表明，牦牛Caveolin-3蛋白不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。

早期的研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-3僅存在于各種肌細胞中，如心肌細胞、骨骼肌細胞和平滑肌細胞等。余方等［13］在對不同發(fā)育階段的雞的研究中發(fā)現(xiàn)，CAV-3 mRNA僅在橫紋肌特異性表達而在其它組織器官組織中均未見表達，同時在1-10周的不同發(fā)育階段中未表現(xiàn)出明顯的變化，他們認為，CAV-3基因在雞的小窩膜結(jié)構(gòu)形成、肌肉中T-小管系統(tǒng)的發(fā)生和肌肉分化等過程中可能起著非常重要的作用。Song等［14］對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)CAV-3基因特異表達于心肌、骨骼肌以及血管平滑肌細胞中。張營等［15］對鴨CAV-3基因mRNA在不同組織中表達情況進行的研究發(fā)現(xiàn)，CAV-3 mRNA在心肌中表達量最高，在胸肌、腿肌、腎臟中表達量相對較高，在其他組織中痕量表達。本試驗利用半定量RCR技術(shù)對牦牛CAV-3基因mRNA在不同組織中表達情況進行的研究發(fā)現(xiàn)，CAV-3 mRNA在心臟中表達量最高，肌肉組織中表達量次之，其他組織未見表達，這與余方等的研究結(jié)果一致。但與張營等對鴨各組織中CAV-3基因的表達研究略有差異，這可能與牦牛的特殊生理構(gòu)造有關(guān)。

CAV-3對哺乳動物和鳥類的肌肉生理功能的維持都起著非常重要的作用。Galbiati等［16］發(fā)現(xiàn)敲除CAV-3的小鼠會出現(xiàn)肌纖維中的胞膜窖消失現(xiàn)象，同時發(fā)生骨骼肌細胞病理性改變。Galbiati等還發(fā)現(xiàn)正常骨骼肌細胞中的肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白的復合體被定位在胞膜窖中，當Caveolin-3缺失后這種定位被打亂，從而并發(fā)許多相關(guān)疾病。Caveolin-3的缺陷使得肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白的復合體異常定位，從而引起了人類的肢帶型進行性肌肉萎縮癥［1］，同時還發(fā)現(xiàn)T-小管的異常排列［17，18］，這些缺失后的表型說明了Caveolin-3在肌肉組織發(fā)育過程中的重要作用。楊淵等［19］通過熒光定量PCR技術(shù)檢測了脂肪型的榮昌豬和瘦肉型長白豬的脂肪和肌肉組織中CAV-3基因在7月齡的表達變化，并分析品種間、不同性別間和不同組織間基因表達的差異。結(jié)果表明，長白母豬板油中CAV-3基因表達量極顯著高于榮昌母豬板油中CAV-3基因表達量（P＜0.01）［20］。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測CAV-3 mRNA在牦牛和黃牛背最長肌組織的表達，發(fā)現(xiàn)CAV-3基因在牦牛肌肉組織表達低于黃牛肌肉組織，但是差異不顯著，這也驗證了CAV-3在骨骼肌中的表達。本研究克隆了牦牛CAV-3基因的編碼區(qū)序列并分析了其組織表達規(guī)律，為進一步研究其功能及在肌肉發(fā)生和肌肉生理過程中的作用提供參考。

4 結(jié)論

牦牛CAV-3的編碼區(qū)的序列長度為631 bp，編碼151個氨基酸，不含信號肽，其蛋白在第79-101位氨基酸之間具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。CAV-3 mRNA在心臟和肌肉組織中能夠特異性表達，且CAV-3 基因mRNA在牦牛肌肉組織的表達水平低于黃牛肌肉組織的表達水平。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning of CAV-3 in Yak and Analysis Its Expression in Yak and Cattle

Zhao Juanhua Pei Jie Liang Chunnian Guo Xian Wu Xiaoyun Zhang Liangbin Yan Ping
（Key Laboratory of Yak Breeding Engineering，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou730050）

This study aims to clone， analyze bioinformatics and determine the expression pattern of CAV-3 gene in yak. A pair of special primers were designed according to released mRNA sequence of bovine CAV-3 in GenBank. A coding region sequence of yak CAV-3 was amplified by RT-PCR； the general physical and chemical properties， hydrophobicity， protein domains and protein secondary structures were systemically analyzed and predicted by bioinformatics techniques. The expression levels of CAV-3 mRNA in some organs of yak and cattle were detected by semi-quantitative PCR. Real-time PCR was employed to examine the expression levels of CAV-3 mRNA in yak and cattle muscles. The coding region sequence of CAV-3 gene in yak contains a complete ORF（631 bp）which encoded 151 amino acids. CAV-3 mRNA expression in the heart and muscle was detected， but not in any other examined tissues， and its expression level in the heart was higher than in the muscle. The result in yak was consistent with that in cattle. Expression of CAV-3 gene in the yak muscle was less than in the cattle muscle，but not significantly（P＞0.05）. The cloning and analysis of CAV-3 provided scientific basis for further study the function of CAV-3 gene in muscle development and muscle physiological process in the future.

yak； Caveolin-3； cloning； expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.030

2014-10-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-38），甘肅甘南牧區(qū)“生產(chǎn)生態(tài)生活”保障技術(shù)集成與示范（2012AD13B05）

趙娟花，女，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種；E-mail：zjh326303202@163.com

閻萍，女，研究員，博士生導師，研究方向；動物遺傳育種；E-mail：pingyanlz@163.com