反相高效液相色譜法測(cè)定川楝子中川楝素含量

李嬋，雷久雨，南葉飛

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證中心，陜西西安710061；2.西安恒生堂制藥有限公司，

陜西西安710061；3.西安石油大學(xué)，陜西西安710061）

反相高效液相色譜法測(cè)定川楝子中川楝素含量

李嬋1，雷久雨2，南葉飛3

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證中心，陜西西安710061；2.西安恒生堂制藥有限公司，

陜西西安710061；3.西安石油大學(xué)，陜西西安710061）

目的建立測(cè)定川楝子藥材中川楝素含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并與高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）法進(jìn)行比較。方法色譜柱為Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為35℃，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果川楝素質(zhì)量濃度在0.036～0.280 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率為102.38%，RSD=3.89%（n=6）。應(yīng)用RP-HPLC和HPLC-MS法檢測(cè)3批次藥材川楝素含量分別為0.17%，0.17%，0.18%和0.18%，0.18%，0.19%。結(jié)論所建立方法使用儀器普及率高，操作簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確度滿足應(yīng)用要求。與HPLC-MS法比較，RP-HPLC法檢測(cè)含量稍高，基層藥品檢驗(yàn)部門(mén)和一般制藥企業(yè)可利用該方法對(duì)川楝素進(jìn)行質(zhì)量控制。

反相高效液相色譜法；川楝素；含量測(cè)定

川楝子是楝科植物川楝Melia toosendan Sieb.et Zucc.的干燥果實(shí)，味苦，性寒［1-2］，有行氣止痛、疏肝泄熱等功效［3］。對(duì)川楝子化學(xué)成分的研究，主要集中于一些三萜類(lèi)化合物［4］，如川楝素［5-6］。川楝素具有驅(qū)蟲(chóng)、抗癌、抗菌、影響神經(jīng)肌肉及細(xì)胞、影響呼吸中樞及消炎等多種生物活性［7-11］，也是川楝子、苦楝皮等藥材含量控制的指標(biāo)成分。2010年版《中國(guó)藥典（一部）》采用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用檢測(cè)的方法對(duì)川楝子和苦楝皮中的川楝素進(jìn)行含量測(cè)定，但儀器昂貴、運(yùn)行成本大、對(duì)儀器操作人員的技術(shù)水平要求也高，故普及性較差。為此，探索對(duì)川楝子中川楝素進(jìn)行定量分析的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以利于基層藥檢部門(mén)及相關(guān)制藥企業(yè)更廣泛、便捷地使用。

1　儀器與試藥

Agilent1100 series型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)；FW200A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；PL203型電子天平（梅特勒-托利多公司）；BT25s型十萬(wàn)分之一天平（賽多利斯公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；UPDR-Ⅱ-10T型超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。川楝素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111842-201102）；川楝子（西安中藥飲片廠，批號(hào)為20140201，20140501，20140801）；甲醇（天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為130603）；乙腈（天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為11037501）為色譜純，水為自制超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按川楝素峰計(jì)算不低于3 000。

2.2溶液制備

取川楝素對(duì)照品0.007 70 g，精密稱(chēng)定，置25mL容量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含川楝素0.308 0mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取川楝子粉末（過(guò)3號(hào)篩）1.006 5 g，精密稱(chēng)定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；重復(fù)提取3次，合并濾液蒸干，甲醇溶解定容至10mL的容量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液（甲醇）各10μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果對(duì)照品中川楝素的保留時(shí)間為35.942，46.227min，供試品中川楝素的保留時(shí)間為35.873，46.073min，空白溶液在對(duì)照品的川楝素保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1，表明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

線性關(guān)系考察：取川楝素對(duì)照品貯備液，稀釋成質(zhì)量濃度為0.287 0，0.143 5，0.107 6，0.071 7，0.035 8 g/L的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，以平均峰面積值和質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=10 019 082.226 X+ 7 652.520，r=0.999 8（n=5）。結(jié)果川楝素質(zhì)量濃度在0.036～0.280 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

耐用性試驗(yàn)：試驗(yàn)所用色譜柱分別為安捷倫色譜柱、菲羅門(mén)色譜柱，流動(dòng)相組成分別為25∶75，28∶72，30∶70的乙腈-水溶液，柱溫分別為33，35，37℃時(shí)，精密吸取對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，依據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定位，其分離度和理論板數(shù)見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，分離度和理論板數(shù)均在標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，符合規(guī)定，確保流動(dòng)相的組成比例、不同廠牌的同類(lèi)型色譜柱、柱溫的變化因素能通過(guò)系統(tǒng)適用性。

圖1　高效液相色譜圖

表1　耐用性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密稱(chēng)取川楝素對(duì)照品，平行制配對(duì)照品溶液6份，在擬訂色譜條件下，1日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，在6日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果日內(nèi)精密度的RSD=1.06%（n=6），日間精密度的RSD=1.15%（n=6），表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，6，12，18，24 h時(shí)測(cè)定。結(jié)果川楝素峰面積分別為970 265.594，968 786.391，953 199.969，996 572.750，962 307.109，RSD為1.70%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取川楝素對(duì)照品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積。結(jié)果的RSD為1.80%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的川楝子樣品6份，每份1.000 0 g，依次分別精密加入川楝素對(duì)照品0.63，0.59，0.84，0.80，1.13，0.99mg，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4樣品含量測(cè)定

采用RP-HPLC法對(duì)3批次川楝子進(jìn)行川楝素含量測(cè)定，并與HPLC-MS法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，考察測(cè)定結(jié)果的系統(tǒng)誤差。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　川楝素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果比較（%）

3　討論

采用HPLC法對(duì)川楝子藥材中川楝素含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，其系統(tǒng)適用性、精密度、重復(fù)性、專(zhuān)屬性、線性范圍及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，所建立川楝素分析方法的分離度和理論板數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，說(shuō)明具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可供制藥企業(yè)或藥檢部門(mén)選擇。同時(shí)，與HPLC-MS法所檢測(cè)的同批川楝子含量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，測(cè)量誤差符合規(guī)定。本研究中建立的RP-HPLC法具有簡(jiǎn)便可行、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，在基層藥檢部門(mén)及藥品企業(yè)可作為2010年版《中國(guó)藥典（一部）》中川楝子藥材川楝素含量測(cè)定的替代方法。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄130-附錄131.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·第一增補(bǔ)本［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2012：84-85.

［3］孫建，周洪雷.中藥川楝子臨床應(yīng)用研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（1）：27-28.

［4］謝帆，張勉，張朝鳳，等.川楝子的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（14）：1 066-1 069.

［5］周英，王慧娟，郭東貴，等.川楝子化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2010，41（9）：1 421-1 423.

［6］白靖文，趙李霞，馮時(shí).植物源農(nóng)藥川楝素UAE方法研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（1）：81-84.

［7］羅剛，全枉珠.川楝素藥理研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，1988，3（3）：154-156.

［8］程蕾，雷勇，梁媛媛，等.川楝子不同提取部位藥效及毒性的比較研究［J］.中藥材，2007，30（10）：1 276-1 279.

［9］王小娟，劉妍如，肖炳坤，等.川楝素抗腫瘤作用機(jī)制研究［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2011，11（2）：281-285.

［10］蔡梅超，周洪雷，孫建，等.川楝子炮制前后揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19（17）：11-12.

［11］沈雅琴，張明發(fā)，朱自平，等.苦楝皮的鎮(zhèn)痛抗炎和抗血栓形成作用［J］.中國(guó)藥業(yè)，1998，7（10）：30-31.

Determ ination of Toosendanin in Melia Toosendan by RP-HPLC

Li Chan1，Lei Jiuyu2，Nan Yefei3
（1.Drug Certification Center，Shaanxi Provincial Administration Bureau of Food and Drug，Xi′an，Shaanxi，China 710061；2.Xi′an Hengshentang
Pharmacutical Co.，Ltd.，Xi′an，Shaanxi，China 710061；3.Xi′an Petroleum University，Xi′an，Shaanxi，China 710061）

Objective To establish a RP-HPLC method for the determination of the toosendanin content in Melia toosendan and to compare it with the HPLC-MS.M ethods The chromatographic conditions were as follows：the Agilent TC-C18column（250 mm× 4.6 mm，5μm），the mobile phase of acetonitrile-water（25∶75）at a flow rate of 1 mL/min，the detection wavelength of 210 nm and the sample size of 10μL.Results The linear range of toosendanin in Melia toosendan was 0.036-0.280 g/L（r=0.999 8）.The average recovery rate was 102.38%，RSD=3.89%（n=6）.The toosendanin contents in 3 batches of medicinal material determined by RP-HPLC and HPLC-MS were 0.17%，0.17%，0.18%and 0.18%，0.18%，0.19%respectively.Conclusion The established method has high popularizing rate for using instrument，is easy to operate，has low cost，its detection precision and accuracy meet the application requirements.Compared with HPLC-MS，the detected content of RP-HPLC is slightly higher.The primary drug inspection department and general pharmaceutical enterprise can use this method to conduct the quality control on toosendanin.

RP-HPLC；toosendanin；content determination

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）16-0087-03

2015-02-05；

2015-03-11）