復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊抗疲勞增強免疫力作用研究*

鮑蕾蕾，楊帆，陳海飛，卞俊，唐大海

（1.中國人民解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科，上海200434；2.中國人民解放軍總政治部白石橋干管局青年湖干休點，北京100011；3.中國人民解放軍第411醫(yī)院檢驗科，上海200434）

復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊抗疲勞增強免疫力作用研究*

鮑蕾蕾1，楊帆2，陳海飛1，卞俊1，唐大海3

（1.中國人民解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科，上海200434；2.中國人民解放軍總政治部白石橋干管局青年湖干休點，北京100011；3.中國人民解放軍第411醫(yī)院檢驗科，上海200434）

目的研究復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊抗疲勞、增強免疫力的藥理作用。方法將昆明種小鼠隨機分為5組，分別為復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊（FFLZB）低、中、高［385，770，1 540mg/（kg·d）］劑量組、對照藥紅參醇提物組、空白對照組，灌胃給藥14 d后考察各組小鼠爬桿時間及爬桿后血清肌酸激酶（CK）、三磷酸腺苷（ATP）水平，同時采用免疫臟器指數(shù)法、碳粒廓清法、足趾增厚法測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH），考察FFLZB對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果高、中、低劑量FFLZB能不同程度地延長小鼠爬桿時間，高、中劑量能顯著提高小鼠爬桿后血清ATP水平，僅低劑量能使爬桿后的小鼠血清CK酶水平顯著提高；與空白對照組相比，F(xiàn)FLZB高、中、低3個劑量能不同程度地抑制小鼠免疫器官臟器指數(shù)的下降，提高碳粒廓清指數(shù)水平及24，48 h遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。結(jié)論復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊具有抗疲勞及增強免疫力作用，是一種有效的抗疲勞復(fù)方中藥制劑。

抗疲勞；免疫功能；靈芝孢子精油；小鼠

復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊為中藥復(fù)方制劑，由靈芝孢子粉、人參、紅景天、黃芪、刺五加5味中藥組方，方中靈芝孢子粉益精氣、堅筋骨、調(diào)睡眠，人參補五臟、安精神，紅景天補氣強心、活血止血、祛燥火，黃芪助氣、壯筋、長肉，刺五加調(diào)和諸藥。該復(fù)方制劑具有抗運動性疲勞、提高機體免疫力、增強體力、保護臟腑組織的作用。本試驗中通過小鼠爬桿疲勞模型及各種免疫指標的觀察，研究了復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊對運動性疲勞及免疫功能的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1儀器、動物與試藥

MS6002S型分析天平（梅特勒公司）；Multiskan Mk3型酶標儀（Thermo公司）；UV2550型紫外分光光度計（Shimadzu公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HHS-4型恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療機械廠）；離心機（上海離心機廠）。昆明種小鼠210只，雌雄各半，體重（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2007-0005。復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊由靈芝孢子粉經(jīng)超臨界流體萃取技術(shù)得到靈芝孢子精油后與人參、黃芪、紅景天、刺五加等藥材提取物制成的軟膠囊制劑（中國人民解放軍第411醫(yī)院，批號為20111022），規(guī)格為每粒含生藥4 g；陽性對照藥為紅參醇提取物（10倍量75%乙醇，回流提取3次，每次1 h，用蒸餾水加少許吐溫-80配成劑量為400mg/kg的混懸液）；空白對照藥為福臨門大豆油（批號為20110518）；小鼠血清肌酸激酶（CK）、小鼠血清三磷酸腺苷（ATP）檢測試劑盒［均為酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，美國TSZ公司，批號分別為20120310和20120313］；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為12040625）；印度墨汁（南京都萊生物技術(shù)有限公司，批號為20111202）。

1.2試驗方法

劑量設(shè)計及藥液配制：按復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊處方制成給藥組，以人給藥劑量折算為小鼠的低劑量，高、中、低劑量組（A1，A2，A3組）的劑量按4∶2∶1比例折算為1540，770，385mg/（kg·d），以空白對照藥為稀釋劑；陽性對照組（B組）給予紅參醇提取物，劑量為400mg/（kg·d）；空白對照組（C組）給予大豆油。以上各組均為口服灌胃給藥，給藥體積為每20 g體重0.1mL。

小鼠爬桿試驗及血清CK及ATP測定［1-2］：取昆明種小鼠50只，隨機分為5組，各10只，分組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥1 h后，置小鼠于長100 cm、直徑0.6 cm的光滑玻璃桿上，玻璃桿末端距離地面40 cm，使小鼠肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記時，觀察小鼠因肌肉疲勞無力從玻璃桿上滑落下來的時間，第2次滑落試驗結(jié)束，累計2次時間作為小鼠爬桿時間。同時，摘取小鼠眼球取血，4℃下靜置1 h后，以3 000 r/min的速率離心10min，取血清，保存于-80℃，按試劑盒要求測定血清CK和ATP。

對免疫抑制小鼠免疫臟器指數(shù)的影響：取昆明種小鼠60只，隨機分為6組，各10只，分組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。試驗第11天，除C組外，各組小鼠分別以50mg/kg腹腔注射環(huán)磷腺胺，連續(xù)3 d，造成動物免疫抑制模型，C組腹腔注射等量生理鹽水［3］。第14天給藥1 h后，脫臼處死小鼠，稱體重，取脾臟、胸腺，稱濕重，并按下列公式計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾指數(shù)=脾重/體重（mg/g），胸腺指數(shù)=胸腺重/體重（mg/g）。

碳粒廓清試驗：取昆明種小鼠50只，隨機分為5組，各10只，分組給藥，連續(xù)14 d。復(fù)制免疫低下模型，方法同“對免疫抑制小鼠免疫臟指數(shù)的影響”項。于末次給藥1 h后尾靜脈注射體積分數(shù)為20%的印度墨汁10 mL/kg，然后分別于1，5 min用定量毛細管于每鼠眼球后靜脈叢取血0.02 mL，立刻吹入2 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的Na2CO3溶液中，吹出數(shù)次以充分洗出吸管壁附著的血液，取血完畢后以2mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%Na2CO3溶液校零，680 nm波長測吸光度（A）［4-5］。處死小鼠，稱體重，取肝臟、脾臟稱濕量。計算廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)（校正吞噬指數(shù)），k值經(jīng)體重及肝脾質(zhì)量換算后得吞噬指數(shù)ɑ。廓清指數(shù)K=（log A1-log A5）/（T5-T1），A1和A5分別為1，5min時的吸光度；吞噬指數(shù)ɑ=體重/（肝重+脾重）×K1/3。

足跖增厚法測定小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）［4-5］：取昆明種小鼠50只，隨機分為5組，各10只，分組給藥，連續(xù)14 d。于給藥后11 d對小鼠進行致敏，每只小鼠腹腔注射2%（v/v）綿羊紅細胞每只0.2mL進行免疫。免疫4 d后，測量左后足跖部厚度，在測量部位皮下注射20%（v/v）綿羊紅細胞每只20μL，于注射后24，48 h時分別測量左右足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1小鼠爬桿試驗

結(jié)果見表1?？梢?，相比C組，A1，A2，A3組可不同程度地增加小鼠爬桿時間，且有顯著性差異，同時小鼠血清ATP及CK值均有不同程度的提高。

2.2對免疫抑制小鼠免疫臟器指數(shù)的影響

結(jié)果見表2?？梢?，腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺能顯著降低小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)；相比模型組（D組），A1組及A2組脾臟、胸腺指數(shù)顯著提高。

2.3小鼠碳粒廓清試驗

結(jié)果見表3?？梢姡啾菴組，A1，A2，A3組小鼠的碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)ɑ均顯著提高，其中A1組和A2組相比C組有顯著性差異。

2.4足跖增厚法測定小鼠DTH結(jié)果

結(jié)果見表4?？梢?，各組小鼠經(jīng)綿羊紅細胞誘導(dǎo)24，48 h，與C組比較，A1組及A2組由綿羊紅細胞引起的DTH反應(yīng)明顯被抑制（P＜0.01及P＜0.05）。

表1　FFLBZ對小鼠爬桿試驗及血清ATP，CK值的影響（±s，n=10）

表1　FFLBZ對小鼠爬桿試驗及血清ATP，CK值的影響（±s，n=10）

注：與C組比較，*P＜0.05，△P＜0.01。表3和表4同。

組別A1組A2組A3組B組C組CK（U/L）116.45±4.51 118.54±5.80 119.02±5.13*118.46±6.59 115.55±4.88劑量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 -爬桿時間（min）9.88±3.29△7.60±2.72*6.73±1.91*7.61±1.64*5.95±1.69 ATP（nmol/L）219.83±8.03△207.30±7.59*206.06±10.96 218.89±11.79△198.11±8.54

表2　FFLBZ對免疫抑制小鼠免疫臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

表2　FFLBZ對免疫抑制小鼠免疫臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與D組比較，*P＜0.05，△P＜0.01。

組別A1組A2組A3組B組C組D組劑量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 --脾臟（mg）70.7±18.8 65.7±11.9 51.9±8.3 46.0±8.7 145.2±23.6 53.8±11.8胸腺（mg）42.4±8.1 41.5±5.2 31.7±9.1 31.4±5.2 97.9±18.9 32.8±4.2脾臟指數(shù)（mg/g）2.1±0.7*1.9±0.4 1.8±0.3 1.6±0.3 5.3±0.5 1.8±0.2胸腺指數(shù)（mg/g）1.4±0.3△1.3±0.2*1.1±0.3 1.1±0.3 3.9±0.4 1.1±0.2

表3　小鼠碳粒廓清試驗測定結(jié)果（±s，n=10）

表3　小鼠碳粒廓清試驗測定結(jié)果（±s，n=10）

組別A1組A2組A3組B組C組K ɑ 5.871±0.399 6.899±1.047△6.513±1.146*6.057±0.750 5.697±0.873劑量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 -0.035±0.010 0.059±0.022 0.042±0.021 0.036±0.009 0.0248±0.023

表4　小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測定結(jié)果（±s，n=10）

表4　小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測定結(jié)果（±s，n=10）

組別劑量［mg/（kg·d）］足跖部厚度（mm）A1組A2組A3組B組C組1 540 770 385 400 -24 h 0.45±0.09△0.46±0.07△0.35±0.08 0.33±0.06*0.31±0.08 48 h 0.41±0.07△0.40±0.05*0.33±0.06 0.32±0.06*0.29±0.07

3　討論

運動性疲勞是指機體生理過程不能持續(xù)其機能在一特定水平上和（或）不能維持預(yù)定的運動強度［6］的現(xiàn)象。也就是說，運動疲勞的發(fā)生最直接和最客觀的表現(xiàn)是機體運動耐力的下降。本研究中，小鼠爬桿時間可作為判斷其體力強壯程度、抗疲勞能力的客觀指標。由試驗結(jié)果可見，復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊的不同劑量組小鼠的爬桿時間均有一定程度延長，其中以中劑量組最明顯。

CK是骨骼肌能量代謝的關(guān)鍵酶之一，其作用是催化ATP和磷酸肌酸之間高能磷酸鍵可逆轉(zhuǎn)移。它是短時間激烈運動時能量供應(yīng)和運動后ATP恢復(fù)反應(yīng)的主要催化酶，與運動時、運動后能量平衡及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。運動負荷的大小、肌肉酸痛與血清中CK水平高度相關(guān)［7-8］。正常情況下，肌細胞膜結(jié)構(gòu)完整、功能正常，使CK極少滲出細胞膜而進入血液；但在劇烈運動時，無論是大強度還是低強度的訓(xùn)練都會促使細胞內(nèi)CK釋放，使血清中CK水平升高。因此，血清CK活性的變化可作為評定機體疲勞和了解骨骼肌微細結(jié)構(gòu)損傷及其適應(yīng)與恢復(fù)的重要敏感生化指標［9］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊僅低劑量組小鼠血清CK水平比對照組顯著提高，高、中劑量組小鼠爬桿時間雖較空白對照組有顯著延長，但血清CK水平無明顯變化。同時，小鼠血清ATP水平與爬桿時間呈正相關(guān)，提示復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊能抑制小鼠因爬桿運動而造成的血清CK水平的上升和增加血清ATP水平的作用。

大強度運動造成的疲勞可降低巨噬細胞分泌免疫細胞因子的能力，降低機體免疫力［10］，使機體不可避免地出現(xiàn)明顯的應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)引起某些應(yīng)激激素增加，從而抑制免疫球蛋白的作用，導(dǎo)致機體的免疫機能下降。另外，物質(zhì)代謝紊亂和免疫系統(tǒng)物質(zhì)供應(yīng)不足也是免疫機能下降的重要因素。胸腺為初級淋巴器官，游走的造血干細胞進入胸腺原基，分化增殖成T淋巴細胞，與細胞免疫有關(guān)。免疫抑制模型的臟器指數(shù)測定試驗結(jié)果表明，復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊高、中劑量組能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)。碳粒廓清試驗考察單核巨噬細胞的吞噬功能，印度墨汁是一種較強的抗原性異物，單核巨噬細胞具有吞噬體內(nèi)抗原性異物的功能，是體內(nèi)一種重要的非特異性免疫細胞。試驗結(jié)果表明，復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊中、低劑量組能顯著提高小鼠的廓清指數(shù)，提示復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊具有提高單核巨噬細胞吞噬異物的能力。同時，該制劑的高、中劑量組能顯著提高小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)引起的足跖增厚。

綜上所述，復(fù)方靈芝孢子精油軟膠囊可通過抑制大強度運動小鼠細胞內(nèi)CK的積聚、增加血清ATP的含量而延長小鼠爬桿時間，還具有提高免疫力低下小鼠免疫臟器指數(shù)，提高細胞吞噬功能，抑制遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用，這種增強免疫力的功能可能與其抗運動性疲勞作用有一定相關(guān)性。

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Effect of Compound Ganoderma Lucidum Spore Oil Soft Capsule on Antifatigue and Immunopotentiation

Bao Leilei1，Yang Fan2，Chen Haifei1，Bian Jun1，Tang Dahai3
（1.Department of Pharmacy，411 Hospital of PLA，Shanghai，China 200434；2.Qingnian Lake Cadre′s Sanitarium，Baishiqiao Cardres Administration Bureau，
General Political Department of PLA，Beijing，China 100011；3.Department of Clinical Laboratory，411 Hospital of PLA，Shanghai，China 200434）

Objective To research the pharmacological effect of antifatigue and immunopotentiation of Compound Ganoderma Lucidum Spore Oil Soft Capsule.M ethods Kunming mice were radomly devided into five groups：the low，middle and high FFLZB doses groups［385，770，1 540 mg/（kg·d）］，control red gingseng ethanol extract group and blank control group.The pole-climbing time，serum creatinine kinase（CK）and adenosine triphosphate（ATP）contents on 14 d after medication gavage were detected.At the same time the immune organ index method，cleaning carbon particle method and digits thickening method were adopted to detect delayed type hepersensitivity（DTH）for investigating the influence of CGOC on mice′s immune function.Results The high，middle and low doses FFLZB groups could prolong the pole-climbing time in different degrees，the middle and high doses groups could significantly increase the serum ATP level after pole-climbing，only the low dose group could significantly increase serum CK level after pole-climbing；compared with the blank control group，the high，middle and low FFLZB doses groups could inhibit the decrease of mice immune organ index in different degrees，increased the level of leaning carbon particles and 24，48 h DTH degree.Conclusion FFLZB has the antifatigue and immunopotentiation effect and is a compound Chinese medicine preparation for effective antifatigue.

antifatigue；immune function；FFLZB；mice

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）16-0014-03

鮑蕾蕾（1979-），女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為中藥藥理活性成分研究，（電話）021-65283984-15（電子信箱）annabao212@qq.com。

2015-03-18）

*全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十二五”面上課題，項目編號：CWS11J178；上海市衛(wèi)生局青年基金項目，項目編號：2009Y118。