朗伯—比爾定律在血紅蛋白濃度檢測(cè)中的應(yīng)用研究

陳婷 孟建昇 謝華相

摘 要：該文從朗伯-比爾定律的基本原理入手，分析了定律在血液細(xì)胞分析儀血紅蛋白濃度檢測(cè)中的具體應(yīng)用，為HGB測(cè)量單元的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：朗伯—比爾定律 比色 血紅蛋白

中圖分類號(hào)：TM741.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2015）08（c）-0032-02

朗伯—比爾定律是比色分析的基本原理，描述了有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液濃度和光通過(guò)的溶液厚度之間的定量關(guān)系。朗伯—比爾定律在許多醫(yī)療儀器中都有應(yīng)用，如血液細(xì)胞分析儀、生化分析儀、監(jiān)護(hù)儀等，它的應(yīng)用包含了機(jī)械、光學(xué)、化學(xué)、電子學(xué)等諸多學(xué)科方方面面的內(nèi)容。

1 朗伯—比爾定律

當(dāng)一束平行單色光通過(guò)含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度和液層厚度的乘積成正比，即：

A

式中，為吸光系數(shù)，它與吸光物質(zhì)、入射光波長(zhǎng)、溶液溫度等因素有關(guān)；C為吸光物質(zhì)的濃度；L為透光液層厚度；透射光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度I之比稱為透光度或透光率。

朗伯—比爾定律又稱光的吸收定律，它是比色法分析溶液濃度及吸光物質(zhì)含量的理論基礎(chǔ)。

2 血紅蛋白的檢測(cè)方法

在血液細(xì)胞分析儀中，血紅蛋白濃度的檢測(cè)原理基本都是相同的。被稀釋的血液加入溶血?jiǎng)┖螅t細(xì)胞溶解，釋放出血紅蛋白，后者與溶血?jiǎng)┙Y(jié)合形成血紅蛋白衍生物，進(jìn)入血紅蛋白濃度測(cè)定系統(tǒng)。在特定波長(zhǎng)（一般在530～550 nm）照射下，吸光度的變化與液體中HGB（Hemoglobin血紅蛋白）含量成比例。血紅蛋白濃度可以通過(guò)朗伯—比爾定律，利用比色法進(jìn)行測(cè)定。

采用比色法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，稀釋液必須能使血中所有的血紅蛋白都轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N穩(wěn)定的血紅蛋白衍生物。氰化高鐵血紅蛋白法能使除正常人體中很少含有的硫化血紅蛋白外所有的血紅蛋白都轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白，所測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。因此，氰化高鐵血紅蛋白法已經(jīng)成為ICSH（International Council for Standardization in Haematology）規(guī)定的測(cè)定血紅蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)方法。圖1為ICSH推薦的氰化高鐵血紅蛋白溶液的吸收曲線圖。HICN（hemiglobincyanide）最大吸收峰在540 nm。血液細(xì)胞分析儀HGB檢測(cè)的校正必須以HICN值為標(biāo)準(zhǔn)。

不同系列血液分析儀配套溶血?jiǎng)┡浞讲煌?，形成的血紅蛋白衍生物亦不同，吸光度各異，但最大吸收峰均接近540 nm。為了減少溶血?jiǎng)┑亩拘?，避免含氰化的血紅蛋白衍生物檢測(cè)后的污物處理，近年來(lái)，一些血液分析儀溶血?jiǎng)┦褂脽o(wú)氰試劑。實(shí)驗(yàn)證明，其形成的衍生物與HICN吸收光譜相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性達(dá)到含有氰化物溶血?jiǎng)┑耐瑯铀?，既保證了實(shí)驗(yàn)質(zhì)量又避免了試劑對(duì)分析人員的毒性和環(huán)境污染。

3 血液細(xì)胞分析儀的HGB測(cè)量組件

在血液細(xì)胞分析儀中，采用比色法對(duì)HGB進(jìn)行測(cè)定。因此，HGB測(cè)量組件也就必須具備類似于分光光度計(jì)的各組件。

如圖2所示，HGB測(cè)量組件大致可分為單色光源、比色皿、光電傳感器和信號(hào)檢測(cè)處理單元4部分。其中，前3個(gè)部分在機(jī)械加工、裝配結(jié)構(gòu)上要求具有良好的同軸度，保證光源發(fā)出的光線能夠盡可能的垂直平行入射到比色皿的測(cè)量面上，且透射后的光線也應(yīng)盡可能的垂直平行入射到接收端光電傳感器的接收面上。保證朗伯—比爾定律應(yīng)用對(duì)入射光特性的要求和檢測(cè)靈敏度。

4 信號(hào)檢測(cè)

光電傳感器轉(zhuǎn)換輸出為一微弱電流信號(hào)。某光電二極管照度-電流轉(zhuǎn)換圖如圖3所示。最大入射光強(qiáng)下光電二極管輸出電流不足1 mA。信號(hào)檢測(cè)的第一步就是把這個(gè)微弱的電流信號(hào)通過(guò)I/V變換轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)。

由于血紅蛋白衍生物吸光特性穩(wěn)定，故在進(jìn)行HGB溶液透射光強(qiáng)測(cè)定時(shí)，該測(cè)定值可視為直流信號(hào)。因此，在I/V變換后可根據(jù)電路系統(tǒng)對(duì)A/D轉(zhuǎn)換模擬信號(hào)輸入范圍增加一級(jí)直流放大電路，滿足電路設(shè)計(jì)需求。

5 HGB測(cè)定

由于血液細(xì)胞分析儀的結(jié)構(gòu)與分光光度計(jì)有較大差異，光源照射到比色皿表面的入射光強(qiáng)難以直接獲得。因此，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中通常以入射光透過(guò)稀釋液的透射光強(qiáng)來(lái)代替入射光強(qiáng)。在這里稀釋液就是檢測(cè)過(guò)程中的參比溶液。

（1）參比溶液。

測(cè)定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及比色皿和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來(lái)的測(cè)定誤差。由于血液細(xì)胞分析儀所用的稀釋液和溶血?jiǎng)┚鶠闊o(wú)色透明，因此，參比溶液選擇稀釋液，以消除比色皿和溶劑對(duì)光的反射、吸收帶來(lái)的誤差。

設(shè)入射光強(qiáng)為I，通過(guò)參比溶液后的透射光強(qiáng)為I，吸光度為A，通過(guò)樣本溶液的透射光強(qiáng)為I，吸光度為A，參比溶液下吸光度為A。

則：

；比色皿介質(zhì)吸收及溶劑、器皿反射造成的消光。

A；

吸光度

令，參比溶液下的吸光度A，消除由于比色皿和試劑造成的消光影響。

有：AA。

（2）單組分測(cè)量方法。

單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無(wú)重疊。在特定試劑作用下，我們可以認(rèn)為HGB檢測(cè)是一種單組分測(cè)定。其定量方法包括標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法和吸收系數(shù)法。

設(shè)溶液厚度為L(zhǎng)，吸光物質(zhì)濃度為C，介質(zhì)吸收系數(shù)為k，入射光波長(zhǎng)為，入射光強(qiáng)為，通過(guò)參比溶液后的透射光強(qiáng)為，通過(guò)樣本溶液的透射光強(qiáng)為，參比溶液下吸光度為A。

由朗伯—比爾定律有

A為樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度

k為摩爾吸收系數(shù)，單位：升/厘米·摩爾；

L為樣品池厚度，單位：厘米或毫米；

C為樣品濃度，單位：摩爾/升。

對(duì)特定溶液而言，上式中只有溶液濃度C是未知量，因此，根據(jù)測(cè)得的光強(qiáng)值即可算出相應(yīng)溶液的濃度。

（3）校準(zhǔn)曲線法。

配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，作A-C曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可用最小二乘數(shù)處理，得線性回歸方程。

在相同條件下測(cè)定未知試樣的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以找到與之對(duì)應(yīng)的未知試樣的濃度。

（4）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法。

即將待測(cè)溶液與某一標(biāo)樣溶液，在相同的條件下，測(cè)定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。

在HGB檢測(cè)系統(tǒng)中，由于光源、比色皿、光電傳感器等都不是理想器件，且由于制造、裝配等因素，使HGB檢測(cè)系統(tǒng)不可避免的存在個(gè)體差異。因此，在進(jìn)行測(cè)定時(shí)，必須進(jìn)行系統(tǒng)校正。這里面主要是指對(duì)樣本溶液消光系數(shù)的校正。通常，通過(guò)標(biāo)定等手段較易解決。

6 結(jié)語(yǔ)

該文從朗伯-比爾定律的基本原理入手，分析了定律在血液細(xì)胞分析儀血紅蛋白濃度檢測(cè)中的具體應(yīng)用，為HGB測(cè)量單元的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)和參考。

朗伯—比爾定律在生化分析儀和監(jiān)護(hù)儀中的應(yīng)用與其在HGB檢測(cè)中的應(yīng)用大同小異，但由于具體應(yīng)用場(chǎng)合的不同又各有特色。比如監(jiān)護(hù)儀中采用雙波長(zhǎng)光源來(lái)檢測(cè)血氧飽和度；而生化分析儀在檢測(cè)時(shí)機(jī)上根據(jù)試劑反應(yīng)特性采取終點(diǎn)法、固定時(shí)間法、動(dòng)力學(xué)法等手段進(jìn)行檢測(cè)。定律在不同場(chǎng)合下的應(yīng)用必然帶來(lái)不同的設(shè)計(jì)需求，這些都有待我們?nèi)パ芯靠偨Y(jié)。

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