反相高效液相色譜法測定接骨木籽油中維生素E的含量

劉克海 呂慧 駱蔚燕 董伶 劉克武

摘要 [目的]建立測定接骨木籽油中維生素E 含量的方法。[方法]采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil C18柱，流動相為甲醇-水（98∶2），流速為1.0 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃。[結(jié)果]在上述條件下，維生素E在5～100 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.29%，RSD=1.44% （n=5）。[結(jié)論]該方法操作簡便快捷、結(jié)果可靠、重復(fù)性好，適用于接骨木籽油中維生素E含量的測定。

關(guān)鍵詞 接骨木籽油;維生素E;反相高效液相色譜法;含量

中圖分類號 S567 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-055-02

Determination of the Vitamin E in Sambucus Williamsii Seed Oil by Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography

LIU Kehai¹，LV Hui¹，LUO Weiyan¹，LIU Kewu2* et al

（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306;2.Heilongjiang Forest ByProduct and Speciality Research Institute，Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Nonwood Forest Product Development，Mudanjiang，Heilongjiang 157011）

Abstract ? [Objective] The research aimed to establish a method to determine the vitamin E in Sambucus Williamsii seed oil.[Method] Reversedphase highperformance liquid chromatography with Kromasil C18 column was used.Mobile phase was methanol and water （98：2，v/v） with a flow rate of 1.0 ml/min.UV detection wavelength was 280 nm and the temperature of the column was 25 ℃.[Result] There was a good linear relationship between 5-100 μg/ml of the vitamin E，the average recovery rate was 99.28% with the RSD of 1.44%.[Conclusion] This method was simple and quick，reliable with good reproduction，and suitable for the determination of the content of vitamin E in Sambucus williamsii seed oil.

Key words ? Sambucus Williamsii seed oil; Vitamin E; Reversedphase highperformance liquid chromatography; Content

基金項目 上海市科委工程中心建設(shè)項目（11DZ2280300）;黑龍江省森林工業(yè)總局攻關(guān)項目（sgzjY201402）。

作者簡介 劉克海（1977- ），山東日照人，副教授，在讀博士，從事海洋生物資源利用研究。*通訊作者，副研究員，從事新資源食品研究。

收稿日期 20141211

接骨木生長在我國的東北地區(qū)，是一種鄉(xiāng)土樹種，它幾乎遍及黑、吉、遼等北方各個地區(qū)。接骨木為忍冬科接骨木屬植物^[1]，屬落葉灌木，資源豐富，約有20余種，我國產(chǎn)有5～6種^[2]，主要分布于我國東北、華北及朝鮮、俄羅斯部分地區(qū)的丘陵地帶。接骨木適應(yīng)性強(qiáng)，易于種植，為珍稀的野生木本油料植物。據(jù)文獻(xiàn)記載，接骨木性味甘、苦、平，無毒，具有接骨續(xù)筋、祛風(fēng)利濕、活血止痛之功效^[3]，同時還具有抗炎、鎮(zhèn)痛活性、抗骨質(zhì)疏松活性、抗氧化作用、抗糖尿病作用以及促進(jìn)骨折愈合作用等^[2]，藥用歷史悠久，藥用價值廣泛。

接骨木籽的含油量很高，達(dá)35%～44%^[2]，其中具有抗血脂作用的ɑ亞麻酸含量較高^[4]。從接骨木籽提取的接骨木籽油，是一種呈橙黃色、澄清透明的油狀液體，具有濃郁香味，無異味。維生素E是該油中的天然抗氧化劑，其含量越高，接骨木籽油就越穩(wěn)定。

維生素E，又名生育酚，是脂溶性的維生素，對人體具有重要的生理功能。維生素E不但可以維持人體的肌肉和生殖系統(tǒng)正常代謝，還可以維持中樞神經(jīng)和血管系統(tǒng)的完整。此外，它還具有清除自由基的作用，可作為抗氧化劑使用^[5-6]。維生素E是廣泛存在于各類植物油脂中的，且其對機(jī)體有著重要的生理功效，所以分析接骨木籽油中維生素E的含量是很必要的，同時這也是衡量該油脂營養(yǎng)價值的一個參考標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于測定維生素E的方法主要有薄層層析法、氣相色譜法、比色法^[7]和高效液相色譜法，前3種方法均存在著處理樣品繁瑣、準(zhǔn)確性差、靈敏度低、精密度低等缺點(diǎn);而高效液相色譜法則彌補(bǔ)了上述方法的某些缺點(diǎn)，具有快速、準(zhǔn)確、高靈敏度和高精密度等優(yōu)點(diǎn)。目前，已有學(xué)者對接骨木籽油的理化常數(shù)、重金屬含量以及脂肪酸的組成進(jìn)行了研究，并做了相應(yīng)的含量測定，但還沒有文獻(xiàn)報道關(guān)于測定接骨木籽油中維生素E的含量。

因此，筆者首先采用超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油，然后采用反相高效液相色譜法，以甲醇—水為流動相，采用外標(biāo)法進(jìn)行接骨木籽油中維生素E的含量測定，為其開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

日立 L2000高效液相色譜儀（日本），日立L2400紫外檢測器，日立L2130高通量泵;Kromasil C18柱（250×4.6 mm）;RE52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠）;Speed SFE2 超臨界二氧化碳萃取裝置（美國Applied Separations 公司）。

1.2 試劑 接骨木籽;維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）;甲醇為色譜純;正己烷、乙醚均為分析純;水為超純水，流動相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜減壓過濾。

1.3 超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油

稱取10 g粉碎后的接骨木籽置于超臨界裝置的萃取釜里，然后在萃取壓力為40 Mpa、萃取溫度為40 ℃的條件下靜態(tài)萃取15 min后，再動態(tài)萃取3.5 h，得到接骨木籽油^[8-9]。

1.4 色譜條件

日本日立高效液相色譜儀（L2000）;色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Kromasil C18柱（直徑4.6 mm，高250 mm）;賽多利斯十萬分之一電子天平CPA225D;流動相為甲醇—水（98∶2）;流速為1.5 ml/min;檢測波長280 nm;柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取維生素E標(biāo)準(zhǔn)品適量，加正己烷制成每1 ml含維生素E標(biāo)品1 mg的溶液，即得維生素E標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液;然后分別取維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、250、750、1 000 μl，用正己烷稀釋定容至10 ml的棕色容量瓶內(nèi)，制得5、10、25、75、100 μg/ml的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。在上述的色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄對應(yīng)的維生素E的峰面積;最后以不同濃度的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和對應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 精密度試驗 精密吸取維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，求得維生素E標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的RSD。

1.7 重復(fù)性試驗

取同一批接骨木油樣品5份，按樣品測試條件進(jìn)樣測定，求得維生素E含量的RSD。

1.8 樣品測定

超臨界CO₂萃取制得接骨木籽油，在避光條件下，取油樣約2 g，精密稱定，置50 ml分液漏斗中，用乙醚提取3次，每次10 ml，然后合并乙醚液，置于水浴上蒸干乙醚，殘渣用正己烷溶解，移至10 ml棕色容量瓶中，再用正己烷定容至刻度并搖勻。進(jìn)樣前，將溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后再進(jìn)樣。以上述色譜條件測定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用外標(biāo)峰面積法計算接骨木籽油中維生素E的含量^[10]。

1.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知維生素E含量的接骨木籽油，約1.0 g，共取5份，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液（25 μg/ml）10 ml，置于20 ml棕色容量瓶中，加正己烷溶解至刻度，搖勻，然后精確移取2 ml溶液至10 ml的棕色容量瓶中，加正己烷定容刻度，密塞，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，分別在上述色譜條件測定維生素E的含量，計算回收率，回收率的計算公式為回收率=[（加標(biāo)樣品的測定值-樣品測定值）/加標(biāo)溶液的理論值]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油

在萃取壓力為40 Mpa、萃取溫度為40 ℃的條件下靜態(tài)萃取15 min后，再動態(tài)

萃取3.5 h，得到接骨木籽油的產(chǎn)率為29.64%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維生素E的峰面積對相應(yīng)的濃度作圖繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。結(jié)果表明，維生素E在濃度為5～100 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。此外，得到峰面積（y）與濃度（x）的回歸方程為y=2 440.4x-1 351.4（R²=0.999 9）。

圖1 維生素E標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗

精密吸取維生素E標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，求得標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的RSD為0.43%。

2.4 重復(fù)性試驗

取同一批接骨木油樣品5份，按樣品測試條件進(jìn)行測定，求得維生素E含量的RSD為1.17%。

2.5 樣品測定

取同一批接骨木籽油5份，按照“1.8”中的方法處理后，在“1.4”色譜條件下進(jìn)行測定，并計算。用外標(biāo)峰面積法計算接骨木籽油中維生素E的含量。從維生素E標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖譜（圖2）可以看出，樣品中維生素E的保留時間tR =29.29 min，與標(biāo)準(zhǔn)品tR基本相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，得出這5份接骨木籽油中的維生素E含量

圖2 維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（a）和接骨木籽油中維生素E（b）的HPLC圖譜

平均為25.92 mg/kg，RSD為0.43%。

2.6 加樣回收率

在已知含量的樣品中分別加入不同量的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，配制成加標(biāo)樣品液。將加標(biāo)樣品液分別在“1.4”色譜條件下測定維生素E的含量，并計算，結(jié)果得出（表1），平均的加樣回收率為99.29%，RSD為1.44%（n=5）。

3 討論

（1）該試驗結(jié)果表明，用反相高效液相色譜法測定接骨

從前后期產(chǎn)量分析來看，水肥一體化施肥方式可以有效地提高草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)，特別是處理③即水肥一體化采用10 d 1次20-10-20加菌肥^[4]配方的施肥方式增產(chǎn)效果最佳，增產(chǎn)達(dá)46.0%，尤其是對后期的增產(chǎn)效果更明顯。這可能是因為普通施肥方式后期易造成脫肥，肥量不足，導(dǎo)致后期采收的產(chǎn)量明顯減少;而處理③有效彌補(bǔ)了這一缺陷，有效滿足大棚草莓生長發(fā)育的需肥規(guī)律，從而更有效地激發(fā)出大棚草莓的生產(chǎn)潛力。

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