雙液相系統(tǒng)中分枝桿菌降解植物甾醇為雄烯二酮的工藝優(yōu)化

柏挺

【摘要】雄烯二酮（AD）是制備甾體激素類(lèi)藥物不可替代的中間體。本文在基于15L小試發(fā)酵規(guī)模上，優(yōu)化大豆油/水雙液相系統(tǒng)中分枝桿菌降解植物甾醇為雄烯二酮（AD）的工藝。研究了大豆油在發(fā)酵液中的最佳比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性劑對(duì)提高植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，得到最佳轉(zhuǎn)化工藝條件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐溫-80，轉(zhuǎn)化96h，植物甾醇最終轉(zhuǎn)化率為87.3%。

【關(guān)鍵詞】雙相系統(tǒng)；分枝桿菌；雄烯二酮；植物甾醇；表面活性劑

雄甾-4-烯-3，17-二酮（androst-4-ene-3，17-dione，簡(jiǎn)稱(chēng)AD），是制造甾體激素類(lèi)藥物合成的關(guān)鍵中間物質(zhì)之一，幾乎所有的甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的[1]。目前國(guó)內(nèi)主要從野生中藥材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂苷元后經(jīng)化學(xué)合成而成，工藝十分復(fù)雜，成本很高，而且污染環(huán)境[2]。

微生物降解甾醇的工作開(kāi)始于20世紀(jì)60年代，已發(fā)現(xiàn)多種微生物可將植物甾醇側(cè)鏈選擇性的切除得到AD[3]。微生物法生產(chǎn)AD主要受甾醇在水中溶解度低的限制，甾醇在水中的溶解度低于2mg/L，產(chǎn)物AD在水中的溶解度也不高于50mg/L[4]，甾體化合物的難溶性是限制微生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化最主要的障礙之一。傳統(tǒng)的單水相發(fā)酵多采用添加少量有機(jī)溶劑、表面活性劑的方法來(lái)提高甾醇在發(fā)酵液中的溶解度，效果并不理想，而且有機(jī)溶劑等對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性以及對(duì)安全、環(huán)保等因素影響，從而制約了其在工業(yè)化上的應(yīng)用。采用大豆油/水雙液相發(fā)酵系統(tǒng)，可以有效增加甾醇的溶解度，提高底物投料量，而且減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。本文主要研究了大豆油在發(fā)酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性劑對(duì)植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響。

一、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

分枝桿菌Mycobacterium sp-XHL-501（上海新華聯(lián)制藥有限公司菌種室保藏）。

1.1.2 試劑

甾醇為進(jìn)口甾醇，大豆油購(gòu)于上海良友海獅油脂實(shí)業(yè)有限公司，吐溫80購(gòu)于上海申宇醫(yī)藥化工有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5；胰蛋白胨10；葡萄糖25；瓊脂20，滅菌后pH6.8-7.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 8；玉米漿 65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，滅菌后pH6.8-7.2。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：大豆油200；甾醇15；玉米漿65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，吐溫80 1.5，滅菌后pH6.8-7.2。

1.2 儀器設(shè)備

美國(guó)安捷倫1260高效液相色譜儀；上海國(guó)強(qiáng)生物工程有限公司3L玻璃發(fā)酵罐、15L不銹鋼立式發(fā)酵罐。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將3L發(fā)酵罐內(nèi)裝入2L培養(yǎng)液，121℃滅菌30min，滅菌后pH6.8-7.2。30℃接入斜面種子，攪拌速度200r/min，培養(yǎng)48h左右移種。

1.3.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

將15L發(fā)酵罐內(nèi)裝入10L培養(yǎng)液，121℃滅菌30min，滅菌后pH6.8-7.2。30℃時(shí)以10%接種量接入種子液，初始攪拌速度200r/min，24h后逐漸提高轉(zhuǎn)速至500r/min，用65%磷酸維持pH8.0，發(fā)酵轉(zhuǎn)化96h。

1.3.4 轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法

發(fā)酵完成后，取2ml發(fā)酵液以體積比1：1加入乙酸乙酯萃取，取上清液稀釋100倍，進(jìn)高效液相色譜儀。色譜條件：柱，流動(dòng)相甲醇：水=65：35，流速1.0ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，進(jìn)樣量20μL。

二、結(jié)果與分析

2.1不同比例的大豆油對(duì)甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

大豆油對(duì)甾醇及AD均有較好的溶解性，在增加底物濃度的同時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒性又較小，而單純的提高大豆油比例也會(huì)破壞油/水雙相平衡，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)也會(huì)造成生產(chǎn)上的浪費(fèi)生產(chǎn)成本的增加。根據(jù)文獻(xiàn)及相關(guān)試驗(yàn)摸索，如表1所示，大豆油含量20%左右，甾醇轉(zhuǎn)化率較高。

2.2不同投料量對(duì)甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

甾醇是一種疏水性化合物，難溶于水，過(guò)量底物難以被大豆油溶解分散，且會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，不利于轉(zhuǎn)化率的提高，從而對(duì)原料造成浪費(fèi)。在大豆油/水雙相發(fā)酵系統(tǒng)中，隨著甾醇投料量的增加，轉(zhuǎn)化率上升到一定水平后呈下降趨勢(shì)。當(dāng)投料濃度達(dá)到1.5%時(shí)轉(zhuǎn)化率可達(dá)到85%左右，繼續(xù)提高甾醇投量至2%轉(zhuǎn)化率下降至80%以下。

2.3不同比例吐溫-80對(duì)甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相似，在微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，它可以增加底物的溶解度，同時(shí)改變細(xì)胞膜的通透性。吐溫80是一種常見(jiàn)的水包油型表面活性劑，試驗(yàn)證明在大豆油/水雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吐溫80可有效提高甾醇轉(zhuǎn)化率，投量為0.2%時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到85%左右。低于該濃度，其對(duì)甾醇的溶解能力及對(duì)細(xì)胞膜通透性影響較小，而高于該濃度，則破壞細(xì)胞膜通透性，轉(zhuǎn)化率均不能達(dá)到理想水平。

2.4正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇大豆油投料濃度，底物甾醇投料濃度和吐溫80投料濃度3因素，以AD轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（3）4正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

正交試驗(yàn)分析表明，各因素影響從主到次分別為A（大豆油濃度）、B（甾醇濃度）、C（吐溫80濃度）。最優(yōu)方案為A2B2C3，即大豆油20%，甾醇投量1.5%，吐溫80濃度0.2%，此方案最高轉(zhuǎn)化率87.27%。

方差分析結(jié)果可以看出，三因素對(duì)轉(zhuǎn)化率均有影響，都不顯著。但是與其他發(fā)酵系統(tǒng)相比，甾醇的轉(zhuǎn)化率有較大提高，優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)大規(guī)?；a(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

三、結(jié)論

（1）構(gòu)建大豆油/水雙液相發(fā)酵系統(tǒng)，可以有效解決甾醇難以溶解乳化的問(wèn)題，與傳統(tǒng)單水相發(fā)酵相比，不僅產(chǎn)率有大幅提高，且更安全、環(huán)保。

（2）在大豆油/水雙液相發(fā)酵系統(tǒng)中，研究了大豆油在發(fā)酵液中所占比例、甾醇投料濃度以及添加表面活性劑如吐溫80等因素對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響，對(duì)AD的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

（3）通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了甾醇生物降解的最佳工藝條件。最佳工藝條件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐溫-80，轉(zhuǎn)化96h，植物甾醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到87.3%。

參考文獻(xiàn)

[1]楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（6）：142145.

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[3]陳陶生.近代工業(yè)微生物學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982，53

[4]Wang Z.，Zhao F.，et a1.Microbial transformation hydrophobic compound in cloud point system[J].Mol Catal BEnzyma，2004（27）：147～153.