水稻抗稻瘟病基因玃i1和Pi2聚合系的獲得及其抗性評價

李進波 夏明元 戚華雄

摘要

[目的] 獲得水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系，并對其進行抗性評價。[方法]

以GD7為稻瘟病抗性基因供體，揚稻6號為受體，通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標記輔助選擇，選育出10個Pi1基因和Pi2基因雙基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系，在湖北省水稻品種區(qū)域試驗的稻瘟病抗性鑒定點恩施和宜昌分別對這些品系的稻瘟病抗性進行了田間鑒定。[結(jié)果]這些品系的抗性綜合指數(shù)在0.8～2.0，抗級為1，表現(xiàn)為抗，而受體親本揚稻6號的抗性綜合指數(shù)分別為8.8和8.5，抗級為9，表現(xiàn)為高感，其中一個品系R587與不育系廣占63S配制的雜交組合的抗性綜合指數(shù)分別為2.5和3.5，抗級為3，表現(xiàn)為中抗，而對照揚兩優(yōu)6號的抗性綜合指數(shù)分別為7.9和8.2，抗級為9，表現(xiàn)為高感。[結(jié)論]通過分子標記輔助選擇聚合Pi1基因和Pi2基因能顯著提高聚合系及其相應(yīng)雜交組合的稻瘟病抗性。

關(guān)鍵詞 水稻；稻瘟?。环肿訕擞涊o助選擇；抗性鑒定

中圖分類號 S511 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）05-012-03

Development and Evaluation of Disease Resistance of Pyramided Lines with Blast Resistance Genes Pi1 and Pi2 in Rice

LI Jinbo，XIA Mingyuan，QI Huaxiong （Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract [Objective] The aim was to develop and evaluate disease resistance of pyramided lines with blast resistance genes Pi1 and Pi2 in rice.[Method] Using GD7 as donors as rice blast resistance genes， and Yangdao 6 as recipient， ten new genepyramided lines with the rice blast resistance genes Pi1 and Pi2 and desirable agronomic traits were developed by bakecross breeding with molecular markerassisted selection （MAS）. The field resistance of these lines and their original parents was identified in Ensi and Yichang of Hubei. The evaluation of these lines was conducted on the resistance to blast. [Result]The results showed that the disease index of these lines were 0.8-2.0 and they were resistant. And the disease index of Yangdao 6 was 8.8 and 8.5 and it was high susceptible. The disease index of Guangzhan63S/R587 was 2.5 and 3.5 and it was moderately resistant. And the disease index of Yangliangyou 6 was 7.9 and 8.2 and it was high susceptible. [Conclusion]The conclusion was drawn that the field resistance of genepyramided lines and their hybrid was significantly increased by MAS.

Key words Rice； Blast； MAS； Evaluation of disease resistance

基金項目 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目（2011620002001）。

作者簡介 李進波（1971- ），男，湖北天門人，副研究員，碩士，從事水稻分子育種研究。

收稿日期 20150114

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種世界性的稻作病害，在世界各個水稻生產(chǎn)國或地區(qū)每年都有不同程度的發(fā)生[1]。在我國每年都有幾個稻作區(qū)中等或偏重流行，且過去20年有增長趨勢[2-3]。據(jù)全國農(nóng)作物重大病蟲害預(yù)警，2012年稻瘟病在我國發(fā)病面積為533萬hm2，較2011年增加20%[4]。實踐證明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經(jīng)濟、安全和有效的方法[5]。然而，由于稻瘟病病原菌生理小種的復(fù)雜性和致病性的多樣性，使得現(xiàn)有抗病品種的抗性易被克服而很快喪失抗性。因此不斷發(fā)現(xiàn)和利用新的抗稻瘟病基因，應(yīng)用分子標記輔助選擇聚合多個抗性基因，是培育具有持久抗性和綜合抗性品種的有效策略。

20世紀60年代中期，日本率先開展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鑒別體系。隨后，國際水稻研究所和我國等產(chǎn)稻國也逐漸開展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究。截至2013年8月，已至少報道了68個抗稻瘟病位點共83個主效基因，23個基因已被成功克隆[6]。其中Pi1和Pi2基因是2個顯性廣譜抗稻瘟病基因，對我國各稻區(qū)菌株表現(xiàn)廣譜抗性，在抗稻瘟病抗性育種中具有重要的應(yīng)用價值[7-9]。

Pi1基因被定位在第11染色體長臂末端，位于2個RFLP （restriction fragment length polymorphism） 標記RZ536和NPB181之間，遺傳距離分別為7.9和3.5 cM[10-11]，陳志偉等[12]將其進一步定位在SSR標記MGR4766附近，距離僅1.3 cM。Pi2基因被定位在第6染色體的短臂上，位于2個RFLP標記RG64和RZ612之間[13-14]，吳金紅等[15]將其進一步定位在RG64和SSR標記AP22之間，遺傳距離分別為0.9和1.2 cM。這些研究為利用分子標記輔助選擇Pi1和Pi2基因培育抗稻瘟病水稻品種奠定了基礎(chǔ)。目前，利用分子標記輔助選擇技術(shù)聚合Pi1基因和Pi2基因已有許多成功的例子，如柳武革等[16]利用分子標記選擇技術(shù)將Pi1基因和Pi2基因聚合到感病不育系GD7S中，獲得5個Pi1和Pi2基因純合的不育系RGD7S1、RGD7S2、RGD7S3、RGD7S4和RGD7S5，人工接種鑒定表明5個改良株系抗病頻率達94.12%～97.06%，自然病圃葉瘟和穗瘟均為0級，綜合評價達高抗水平。陳紅旗等[17]利用分子標記選擇技術(shù)將3個抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi33聚合到金23B中，導(dǎo)入系W1對稻瘟病的抗病頻率為96.7%，明顯高于攜帶單個基因的C104LAC（Pi1）和C101A51（Pi2）。胡杰等[18]利用分子標記選擇技術(shù)將Pi1和Pi2基因聚合到改良的珍汕97B中，穗頸瘟田間自然發(fā)病結(jié)果表明，雙基因聚合材料的發(fā)病率僅為0.8%，穗頸瘟抗性級別為1級，聚合Pi和Pi基因的雜交稻組合穗頸瘟發(fā)病率約6%，而不帶Pi1和Pi2基因的7個雜交稻組合的發(fā)病率均較高（約90%）。

筆者利用攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的GD7為供體親本，以目前應(yīng)用面積最廣的恢復(fù)系之一揚稻6號為受體親本，通過回交轉(zhuǎn)育和MAS相結(jié)合，旨在培育綜合性狀優(yōu)良、抗稻瘟病的水稻恢復(fù)系和雜交組合。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供體親本GD7引自廣東農(nóng)科院水稻研究所，受體親本揚稻6號引自江蘇里下河農(nóng)科所。

1.2 雜交和選擇程序 以揚稻6號作母本，GD7作父本雜交獲得F1代雜交種，然后以揚稻6號作輪回親本連續(xù)回交2次，再自交4次獲得BC3F5株系。在回交過程中從BC1F1開始用分子標記檢測抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，選擇帶有目標基因且農(nóng)藝性狀偏向揚稻6號的單株作父本。在BC3F3中選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系檢測目標基因，選擇Pi1和Pi2基因均純合的株系。

1.3 分子標記檢測中使用的分子標記 Pi1基因的檢測是利用與其緊密連鎖的SSR標記MRG4766[9]，Pi2基因的檢測是利用與其緊密連鎖的SSR標記AP22[12]，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系總體積為15 μl，包括1.5 μl 10×buffer， 1.2 μl dNTPs （各2.5 mmol），引物各0.3 μl（10 μmol），1 U Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35個循環(huán)； 72 ℃延伸5 min。Taq DNA聚合酶和其他相關(guān)試劑均購自大連寶生物有限公司。PCR擴增產(chǎn)物用0.6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結(jié)合銀染顯色檢測[19]。分子標記的引物信息見表1。

1.4 稻瘟病抗性鑒定 在湖北省水稻品種區(qū)域試驗的稻瘟病抗性鑒定點恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院對稻瘟病進行自然誘發(fā)鑒定，2013年對10個BC3F4代株系進行鑒定，陽性對照為供體親本GD7，陰性對照為受體親本揚稻6號，2014年對雜交組合廣占63S/R587進行鑒定，陰性對照為揚兩優(yōu)6號（廣占63S/揚稻6號）。每份材料種植20穴，2次重復(fù)，周圍種植高感品種C039誘發(fā)發(fā)病。稻瘟病抗性評價標準參照楊仕華等[20]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標記輔助選擇及Pi1和Pi2基因純合系的獲得 利用與Pi1和Pi2基因緊密連鎖的SSR標記MRG4766和AP22對抗性基因供體親本GD7和受體親本揚稻6號進行多態(tài)性分析。MRG4766在供體親本中擴增產(chǎn)物片段較大，在揚稻6號中擴增產(chǎn)物片段較?。▓D1）；AP22在供體親本中擴增產(chǎn)物片段較小，在揚稻6號中擴增產(chǎn)物片段較大（圖2），MRG4766和AP22在供體親本GD7和受體親本揚稻6號之間都具有多態(tài)性。

回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標記輔助選擇按以下程序進行：供體親本GD7與輪回親本揚稻6號雜交，在F1中去除假雜種后與揚稻6號回交。在BC1F1群體中，經(jīng)分子標記檢測選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株（圖1、2）與揚稻6號回交得到BC2F1。在BC1F2群體中，經(jīng)分子標記檢測獲得帶有Pi1和Pi2基因的單株，選擇農(nóng)藝性狀偏向揚稻6號的單株作父本，取混合花粉繼續(xù)與揚稻6號回交得到BC3F1。在BC3F1群體中，經(jīng)分子標記檢測獲得帶有Pi1和Pi2基因的單株，分單株收種后種植成BC3F2株系，成熟后選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株。種植BC3F3株系后苗期取混樣檢測Pi1和Pi2基因，獲得Pi1和Pi2基因均純合的株系。再根據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，從基本整齊的株系中選擇到10個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的Pi1和Pi2基因聚合系。

2.2 Pi1和Pi2基因聚合系和雜交組合的抗性鑒定 2013年分別在湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和湖北省宜昌農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻瘟病抗性鑒定點對這10個基因聚合系進行稻瘟病抗性鑒定。鑒定結(jié)果表明10個株系的抗性綜合指數(shù)在0.8～2.0，表現(xiàn)為抗，其抗性與供體親本GD7的抗性在同一個水平，而受體親本揚稻6號的抗性綜合指數(shù)分別為8.8和8.5，抗級為9，表現(xiàn)為高感（表2、3）。說明通過分子標記輔助選擇技術(shù)導(dǎo)入Pi1和Pi2基因能顯著提高受體親本的稻瘟病抗性。

根據(jù)BC3F4株系田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，綜合性狀優(yōu)良的株系13C587入選，暫定名為R587。2014年春季在海南利用不育系廣占63S與R587配制雜交組合，同年正季分別在恩施和宜昌進行抗性鑒定，鑒定結(jié)果表明廣占63S/R587的抗性綜合指數(shù)分別為2.5和3.5，抗級為3，表現(xiàn)為中抗，而對照品種揚兩優(yōu)6號的抗性綜合指數(shù)為7.9和8.2，抗級為9，表現(xiàn)為高感。說明Pi1和Pi2基因聚合系與不育系配制的雜交組合的稻瘟病抗性也明顯增強。

3 結(jié)論與討論

目前生產(chǎn)上應(yīng)用的骨干不育系和恢復(fù)系及其配制的組合稻瘟病抗性不強，限制了其推廣應(yīng)用。筆者對參加2013年湖北省中稻區(qū)試和2014年湖北省中稻區(qū)試的組合進行了統(tǒng)計，在2013年湖北省中稻區(qū)試中可以確定以廣占63S為母本配制的雜交組合13個（包括對照品種揚兩優(yōu)6號），區(qū)試稻瘟病抗性鑒定結(jié)果2個組合的抗級為3級，2個組合的抗級為5級，1個組合的抗級為7級，其余8個組合的抗級為9級，少數(shù)組合的稻瘟病抗性較好，很可能是其恢復(fù)系的稻瘟病抗性得到了改良。在2014年湖北省中稻區(qū)試中可以確定以廣占63S為母本配制的雜交組合18個，區(qū)試稻瘟病抗性鑒定結(jié)果除1個組合抗級為3級外，其余17個組合（包括對照品種揚兩優(yōu)6號）的抗級都為9級，其中有13個組合的抗性綜合指數(shù)在7.0以上，未達到湖北省水稻品種審定委員會規(guī)定的稻瘟病抗性綜合指數(shù)≤7.0的標準，也就意味著在湖北省中稻區(qū)試中，以廣占63S為母本配制的雜交組合大多數(shù)會因其稻瘟病抗性差而不能通過品種審定。在該研究中以廣占63S為母本與Pi1和Pi2基因聚合系R587配制的雜交組合，在湖北省水稻品種區(qū)試稻瘟病抗性鑒定點抗級能達到3級，抗性綜合指數(shù)在3.5以下，與對照品種揚兩優(yōu)6號相比其稻瘟病抗性得到了明顯的改良。目前正在安排廣占63S/ R587的試制種和品種比較試驗，如果廣占63S/ R587能保持揚兩優(yōu)6號的產(chǎn)量優(yōu)勢和品質(zhì)性狀，在湖北省水稻生產(chǎn)中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻

[1]

DEAN R A， TALBOT N J， EBBOLE D J， et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J].Nature，2005，434： 980-986.

[2] MOYTRI R，賈育林，RICHARD D C. 水稻抗稻瘟病基因的結(jié)構(gòu)、功能和共同進化[J]. 作物學(xué)報，2012，38（3）：381-393.

[3] 孫國昌，杜新法，陶榮祥，等. 水稻稻瘟病防治研究進展和21世紀初研究設(shè)想[J]. 植物保護學(xué)報，2000，26（1）：33-35.

[4] 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心. 2012年全國農(nóng)作物重大病蟲害呈重發(fā)態(tài)勢[J]. 農(nóng)藥市場信息，2012（5）：49.

[5] ZHANG Y X， YANG J Y， SHAN Z L， et al. Substitution mapping of QTLs for blast resistance with SSSLs in rice （Oryza sativa L.）[J]. Euphytica， 2012， 184（1）：141-150.

[6] 國家水稻數(shù)據(jù)中心[DB/OL].http：//www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.

[7] CHEN H， CHEN B， ZHANG D， et al. Pathotypes of Pyricularia grisea in rice fields of central and southern China[J]. Plant Disease， 2001，85（8）：843-850.

[8] 劉士平，李信，汪朝陽，等. 基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響[J]. 分子植物育種，2003，1（1）：22-26.

[9] 周江鴻，王久林，蔣琬如，等. 我國稻瘟病菌毒力基因的組成及其地理分布[J]. 作物學(xué)報，2003， 29（5）：646-651.

[10] YU Z H， MACKILL D J， BONMAN J M， et al. Molecular mapping of genes for resistance to blast rice （Pyricularia grisea Sacc.） [J]. Theor Appl Genet，1996， 93： 859-863.

[11]

HITTALMANI S， PARCO A， MEW TV， et al. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice[J]. Theor Appl Genet， 2000，100：1121-1128.

[12]陳志偉，官華忠，吳為人，等. 稻瘟病抗性基因Pi-1連鎖SSR標記的篩選和應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2005，34（1）： 74-77.

[13] YU Z H， MACKILL D J， BONMAN J M， et al. Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers[J]. Theor Appl Genet， 1991，81： 471-476.

[14] MEW TV， PARCOARCO A S， HITTALMANI S， et al. Finemapping of major for blast resistance in rice[J]. Rice Genet Newsl， 1994，11：126-128.

[15] 吳金紅，蔣江松，王石平，等. 水稻稻瘟病抗性基因Pi2（t）的精細定位[J]. 作物學(xué)報，2002，28（4）：505-509.

[16] 柳武革，王豐，金素娟，等. 利用分子標記輔助選擇聚合Pi1和Pi2基因改良兩系不育系稻瘟病抗性[J]. 作物學(xué)報，2008，34（7）：1128-1136.

[17] 陳紅旗，陳宗祥，倪深，等.利用分子標記技術(shù)聚合3個稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J].中國水稻科學(xué)，2008，22（1）：23-27.

[18] 胡杰，李信，吳昌軍，等. 利用分子標記輔助選擇改良雜交水稻的褐飛虱和稻瘟病抗性[J].分子植物育種，2010，6（8）：1180-1187.

[19] 李進波，夏明元，戚華雄，等. 水稻抗褐飛虱基因Bph14和Bph15的分子標記輔助選擇[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（10）：2132-2137.

[20] 楊仕華，廖琴. 中國水稻品種試驗與審定[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2005：32-35.

責(zé)任編輯 喬利利 責(zé)任校對 李巖