低溫脅迫對(duì)木薯組培苗葉片若干代謝生理指標(biāo)的影響

歐文軍　羅秀芹　李開(kāi)綿

摘 要 以木薯SC8和MS5供試材料，研究5 ℃低溫處理0、7、10、12和15 d對(duì)木薯組培苗葉片若干生理代謝指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：木薯種質(zhì)SC8和MS5在5 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖、丙二醛含量呈不斷上升趨勢(shì)，而可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；低溫脅迫下，葉片的相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛含量和可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與超氧化物歧化酶活性和可溶性蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；可溶性蛋白含量與丙二醛含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性呈極顯著正相關(guān)；超氧化物歧化酶活性與可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與過(guò)氧化物酶活性呈極顯著正相關(guān)；主成分分析顯示超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖和相對(duì)電導(dǎo)率在第1主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關(guān)系密切，可作為評(píng)價(jià)木薯耐寒性強(qiáng)弱的主要生理指標(biāo)，其次是可溶性蛋白、丙二醛含量和過(guò)氧化物酶活性。綜合分析生理數(shù)據(jù)認(rèn)為木薯MS5的耐寒性高于SC8，這為下一步從離體保存庫(kù)中直接采用組培苗方式進(jìn)行大規(guī)模篩選耐寒種質(zhì)提供參考方法。

關(guān)鍵詞 木薯；葉片；低溫脅迫；生理指標(biāo)

中圖分類號(hào) S537 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）又名樹(shù)薯、木番薯，系大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot P. Miller）植物，其塊根富含淀粉，有“淀粉之王”之稱，其單位面積食物的能量超過(guò)水稻、小麥、高粱和玉米，是人類（特別是熱帶非洲國(guó)家）主要的食糧，迄今已有4 000 a的栽培歷史[1]。木薯起源于熱帶美洲，喜高溫，不耐霜凍[2]。一年中有8個(gè)月以上無(wú)霜期，年平均溫度18 ℃以上地方均可栽培[3]。木薯發(fā)芽出苗最低溫度為14～16 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為25～29 ℃，在14 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，10 ℃以下停止生長(zhǎng)，光合作用最低極限溫度為14 ℃，最高為40 ℃[4]。當(dāng)溫度為0～4 ℃時(shí)，植株容易受到寒害；當(dāng)溫度<0 ℃時(shí)，植株體內(nèi)細(xì)胞活動(dòng)幾乎停止，生長(zhǎng)點(diǎn)被凍傷[5]。中國(guó)熱帶亞熱帶旱地資源達(dá)200萬(wàn)hm2，可供開(kāi)墾種植木薯的荒地達(dá)100萬(wàn)hm2，隨著氣候變暖、抗寒品種選育和種莖越冬貯藏技術(shù)的逐步改善，中國(guó)木薯植區(qū)從目前北緯26°逐漸北移到27～30°，將現(xiàn)有木薯栽培面積約50萬(wàn)hm2發(fā)展到100～150萬(wàn)hm2[6]，但低溫傷害成為限制中國(guó)木薯北移的主要原因。2008年的低溫雨雪冰凍天氣給廣西木薯產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的災(zāi)害[7-8]。目前，大多數(shù)學(xué)者對(duì)木薯耐寒性的研究采用地栽苗或莖桿盆栽苗等方式進(jìn)行[9-12]，鮮有用組培瓶苗的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，探討木薯組培苗葉片在低溫脅迫下的代謝生理特性，比較耐寒性的強(qiáng)弱，將為直接采用組培苗方式對(duì)離體保存庫(kù)的木薯資源進(jìn)行大規(guī)模篩選耐寒種質(zhì)提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為木薯SC8和MS5，來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所木薯研究中心離體保存實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法 選取培養(yǎng)40 d的組培苗置于恒溫恒濕箱內(nèi)，在（25±1）℃、3 000 lx光照強(qiáng)度、16 h/8 h光照周期條件下將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為按0.03 ℃/min降低至5 ℃，其他條件不變，取低溫處理0、7、10、12和15 d的組培苗葉片（含葉柄），測(cè)定相應(yīng)的生理生化指標(biāo)。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 質(zhì)膜相對(duì)透性測(cè)定采用相對(duì)電導(dǎo)率法（REC）；可溶性蛋白含量（wSP）、游離脯氨酸含量（wPro）測(cè)定按李合生[13]研究的方法，可溶性糖含量（wSS）測(cè)定按朱政[14]研究的方法，丙二醛含量（wMDA）測(cè)定按高俊風(fēng)[15]研究的方法，超氧化物歧化酶活性（ASOD）測(cè)定按康俊梅[16]研究的方法，過(guò)氧化物酶活性（APOD）測(cè)定按孫文權(quán)[17]研究的方法，5項(xiàng)含量、2項(xiàng)活性指標(biāo)均以樣品鮮重（Fresh Weight， FW）為基數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SAS9.0軟件進(jìn)行方差分析、新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)、相關(guān)性分析和SPSS19.0進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗REC的影響

由圖1可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本的膜透性表現(xiàn)出隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而呈增加的趨勢(shì)；處理7 d內(nèi)，2份樣本間REC差異不顯著，且均呈緩慢上升的趨勢(shì)；處理10 d開(kāi)始，SC8的REC則極顯著的高于MS5；處理12 d后，REC均呈急劇上升，且2個(gè)樣本間的REC差距幅度進(jìn)一步擴(kuò)大；處理15 d時(shí)，SC8的膜透性是對(duì)照（0 d）的5.2倍；MS5的膜透性是對(duì)照（0 d）的3.0倍，可見(jiàn)低溫處理后木薯組培苗葉片的膜透性都遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲比率明顯提高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜受傷程度不斷加深，MS5與SC8之間的細(xì)胞膜穩(wěn)定性存在明顯差異，且MS5表現(xiàn)出低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜更好的保護(hù)性。

2.2 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗wSP的影響

由圖2可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本的wSP呈先上升后下降的趨勢(shì)，在5 ℃處理12 d時(shí)，wSP曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，然后明顯由上升轉(zhuǎn)為下降；在低溫處理過(guò)程中，2個(gè)樣本的wSP都先由高于對(duì)照，在出現(xiàn)拐點(diǎn)后慢慢低于對(duì)照；且MS5的wSP在同一處理時(shí)間內(nèi)均高于SC8；在處理12 d時(shí)，SC8和 MS5達(dá)到最大值，分別為42.73 mg/g和45.70 mg/g，是對(duì)照的1.07倍和1.12倍；處理10、12和15 d后，2個(gè)樣本的wSP均達(dá)到極顯著差異，說(shuō)明wSP對(duì)低溫十分敏感；MS5增加wSP的能力顯著高于SC8，表現(xiàn)出對(duì)低溫脅迫更強(qiáng)的適應(yīng)性。

2.3 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗wSS的影響

由圖3可知，在5 ℃低溫脅迫15 d，2個(gè)樣本的wSS曲線整體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)；在0～12 d，葉片的wSS變化不明顯，但呈緩慢上升趨勢(shì)；低溫處理12 d后，wSS均呈急劇上升趨勢(shì)；在低溫處理15 d時(shí)，MS5的wSS 是對(duì)照的1.63倍，SC8的wSS是對(duì)照的1.45倍，此時(shí)MS5的wSS顯著高于SC8。表明低溫誘導(dǎo)了木薯組培苗葉片細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量的增加。在低溫條件下，不同木薯種質(zhì)間可溶性糖累積的速度和量存在差異。

2.4 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗wPro的影響

由圖4可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本的wPro影響呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律；低溫脅迫7 d內(nèi)，葉片的wPro幾乎無(wú)變化；在低溫脅迫7～10 d，葉片的wPro快速上升，低溫脅迫12 d時(shí)，2個(gè)樣本的wPro均達(dá)到峰值，達(dá)極顯著差異，其中MS5的wPro是對(duì)照的10.67倍，SC8的wPro是對(duì)照的3.40倍；低溫脅迫12 d后，2個(gè)樣本的wPro均呈急劇降低趨勢(shì)，但比對(duì)照高。表明低溫提高了木薯組培苗的wPro。在一定時(shí)間內(nèi)，低溫脅迫促進(jìn)了木薯細(xì)胞內(nèi)wPro的升高；超過(guò)一定限度，低溫脅迫對(duì)脯氨酸的累積起負(fù)作用。

2.5 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗wMDA的影響

由圖5可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本的wMDA影響呈現(xiàn)逐步上升的變化趨勢(shì)；低溫脅迫7 d開(kāi)始，SC8的wMDA急劇升高，到10 d后又轉(zhuǎn)而緩慢上升，處理15 d后含量達(dá)到38.17 nmol/g，是對(duì)照的1.61倍；而MS5幼苗葉片的wMDA在低溫脅迫7 d開(kāi)始才緩慢上升，脅迫15 d后wMDA達(dá)到29.70 nmol/g，是對(duì)照的1.26倍；SC8的wMDA均高于MS5，且脅迫7 d開(kāi)始，差異達(dá)極顯著，說(shuō)明wMDA對(duì)低溫十分敏感。表明低溫處理前期（0～7 d）對(duì)木薯組培苗葉片內(nèi)wMDA影響不大，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，wMDA迅速提高，這可能是由于過(guò)度的脅迫導(dǎo)致膜脂嚴(yán)重過(guò)氧化。MS5的wMDA低于SC8，增加也較SC8緩慢，說(shuō)明MS5減慢了膜脂過(guò)氧化作用，對(duì)細(xì)胞膜保護(hù)作用較強(qiáng)。

2.6 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗ASOD的影響

由圖6可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本ASOD的影響表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)；處理7 d后，SC8的ASOD極顯著高于MS5；處理10 d后，MS5的ASOD極顯著高于SC8；處理12 d后，SC8的ASOD又反過(guò)來(lái)極顯著高于MS5；處理15 d后，2個(gè)樣品的ASOD差異不顯著。MS5在低溫脅迫10 d時(shí)其ASOD出現(xiàn)拐點(diǎn)，達(dá)到最大值58.62 U/（g·min），低溫脅迫15 d時(shí)降到21.47 U/（g·min）。SC8在低溫脅迫12 d時(shí)，ASOD出現(xiàn)拐點(diǎn)，達(dá)到最大值40.70 U/（g·min），脅迫15 d時(shí)降到21.37 U/（g·min）。低溫脅迫15 d時(shí)，MS5和SC8的ASOD低于對(duì)照，而處理10和12 d時(shí)，2個(gè)樣本的ASOD高于對(duì)照，表明ASOD對(duì)低溫十分敏感，低溫脅迫促使植物保持較高的ASOD來(lái)提高自身的防御力，而過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的脅迫，對(duì)整個(gè)SOD的防御系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致酶活性迅速下降。

2.7 低溫脅迫對(duì)木薯組培苗APOD的影響

由圖7可知，低溫脅迫對(duì)2個(gè)樣本APOD的影響都出現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律；處理7 d時(shí)，2個(gè)樣本的APOD上升均不明顯；處理10 d時(shí)，2個(gè)樣本的APOD均呈急劇上升，且MS5上升速率顯著高于SC8，此時(shí)2個(gè)樣本的APOD均達(dá)到峰值，分別為138.87和242.07 △OD/（g·min），此后2樣本的APOD又開(kāi)始急速下降。處理10和12 d時(shí)，MS5的APOD均極顯著的高于SC8，但處理到15 d時(shí)，SC8的APOD極顯著的高于MS5，說(shuō)明MS5的APOD對(duì)低溫更敏感。2樣本隨低溫脅迫時(shí)間不同，其POD活性均表現(xiàn)出差異極顯著，說(shuō)明木薯的APOD對(duì)低溫十分敏感，一定時(shí)間內(nèi)，低溫脅迫使植物APOD保持較高水平，但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的脅迫將嚴(yán)重抑制APOD。低溫脅迫下，不同木薯種質(zhì)的APOD響應(yīng)速度不一樣，MS5的APOD對(duì)低溫更敏感。

2.8 木薯葉片生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表1可知，wSP與REC、wMDA和wSS呈負(fù)相關(guān)，且與REC呈極顯著負(fù)相關(guān)，與wMDA呈顯著負(fù)相關(guān)，與wPro、ASOD和APOD呈極顯著正相關(guān)。ASOD與wSS呈極顯著負(fù)相關(guān)，與APOD呈極顯著正相關(guān)。REC與wMDA和wSS呈極顯著正相關(guān)，與ASOD和wSP呈極顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明植物在低溫脅迫下，可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)wMDA和wSS或提高ASOD和wSP來(lái)減少低溫對(duì)細(xì)胞膜透性的傷害，從而提高植物的耐寒性。

2.9 低溫脅迫對(duì)木薯葉片生理生化指標(biāo)的主成分分析

由表2可知，前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.97%，基本綜合反映了2個(gè)木薯種質(zhì)耐寒性的絕大多數(shù)信息。因此，選取前3個(gè)主成分為主成分分析的依據(jù)并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。第1主成分的特征值為3.305，貢獻(xiàn)率為47.22%，因子負(fù)荷系數(shù)絕對(duì)值較大的依次為ASOD、wSP、wSS和REC（表3），因此第1主成分由ASOD、wSP、wSS和REC指標(biāo)決定。第2主成分的特征值為1.619，貢獻(xiàn)率為23.12%，以wPro和wMDA的負(fù)荷系數(shù)絕對(duì)值較大，因此第2主成分由wPro和wMDA決定。第3主成分的特征值為1.164，貢獻(xiàn)率為16.63%，其中以APOD的負(fù)荷系數(shù)絕對(duì)值最大，第3主成分由APOD決定。主成分分析結(jié)果（表3）顯示：木薯組培苗隨著低溫脅迫的加劇，細(xì)胞膜最先受到脅迫，膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，膜逐步被破壞，膜透性在不斷增大，丙二醛在細(xì)胞內(nèi)大量累積，植物通過(guò)提高抗氧化酶SOD、POD活性和細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的含量來(lái)降低低溫所造成的傷害，保護(hù)細(xì)胞膜透性從而提高植物的耐寒性。其中，ASOD、wSP、wSS、和REC在第1個(gè)主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關(guān)系密切，可作為評(píng)價(jià)木薯耐寒性的主要測(cè)試指標(biāo)。