不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中品質(zhì)的動態(tài)變化

侯曉艷，陳安均，羅　惟，董　維，牛凱莉，彭易濤（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中品質(zhì)的動態(tài)變化

侯曉艷，陳安均*，羅惟，董維，牛凱莉，彭易濤
（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

以白蘿卜為主要原料，利用植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌進行純種發(fā)酵，并以自然發(fā)酵蘿卜為對照，對發(fā)酵過程中泡蘿卜的總酸及氨基態(tài)氮、亞硝酸鹽、脆度4個理化指標進行動態(tài)測定，同時利用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用方法對發(fā)酵成熟的泡蘿卜的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行測定。結果表明，接種發(fā)酵可以明顯的縮短發(fā)酵周期，提升產(chǎn)品品質(zhì)。

乳酸菌，發(fā)酵，品質(zhì)，動態(tài)變化

泡菜是指蔬菜在一定濃度的食鹽溶液中，借助于天然附著在其表面的微生物或人工接種的乳酸菌等，利用蔬菜中的可發(fā)酵糖類等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酸，同時利用食鹽的高滲透壓，共同抑制泡菜中其他有害微生物的生長，另外還伴隨著乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等一系列生化反應而形成的有特殊風味的發(fā)酵制品［1］。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)常食用泡菜可達到防病治病、保?。?］和延年益壽［3］的功效。

20世紀60年代歐洲的C S Pederson和M N Aibury［4］率先將純種發(fā)酵技術應用于泡菜研究。Choi等［5］從韓國泡菜中分離出梓檬色的明串珠菌，將其用于泡菜純種發(fā)酵，可以獲得品質(zhì)良好的泡菜并能延長產(chǎn)品的貨架期。葉淑紅［6］利用從酸菜汁中分離出的植物乳桿菌發(fā)酵黃瓜泡菜，最短發(fā)酵周期只需要36h。趙歷等［7］驗證了植物乳桿菌純種發(fā)酵甘薯泡菜的可行性，經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化后，得到了色澤好、質(zhì)地脆、口感佳、營養(yǎng)豐富的泡菜新產(chǎn)品。陸利霞等［8］以自行分離的植物乳桿菌B2進行單一菌株發(fā)酵劑接種制作蘿卜泡菜，通過比較發(fā)酵周期、發(fā)酵酸度、pH、OD值等，各指標均優(yōu)于自然發(fā)酵泡菜。

本研究通過對幾種乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中的理化指標進行動態(tài)測定，進而揭示其品質(zhì)變化規(guī)律，為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）來自本系微生物實驗室；短乳桿菌（Lactobacillus brevis）SICC1.1161、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SICC1.521購于四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；新鮮白蘿卜購于雅安市農(nóng)貿(mào)市場；泡菜壇（4L） 購于雅安市農(nóng)貿(mào)市場；基礎培養(yǎng)基（MRS） 葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，吐溫80 1.0mL，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）美國Agilent公司；Supleco固相微萃取裝置、65μm DVB/PDMS萃取頭、1μL微量進樣器美國SUPELCO公司；HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海光地儀器設備有限公司；DZTW調(diào)溫電熱套北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHB-III型循環(huán)水多用真空泵菏澤市鑫源儀器儀表有限公司；同時蒸餾萃取裝置北京玻璃儀器廠；RE-52-99旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；TA-XT-Plus質(zhì)構儀英國Stable Micro System公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化凍干菌種活化：用75%酒精棉擦拭裝有菌種的安瓿管，在酒精燈火焰上燒熱安瓿管封口處，并立即在安瓿管封口處滴一滴無菌水，使其前端炸開，用無菌吸管吸取0.3～0.4mL的無菌MRS液體培養(yǎng)基于安瓿管中，使凍干菌體充分溶解成為懸浮狀液體。取0.2mL的菌懸液，轉接到MRS液體培養(yǎng)基里，37℃培養(yǎng)18～24h，重復兩次。

1.2.2發(fā)酵種子液的制備將活化好的凍干菌種轉接于MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h；發(fā)酵種子液經(jīng)離心（8000r/min，15min，4℃）后用生理鹽水制成菌懸液備用。

1.2.3蘿卜汁培養(yǎng)基的制備蘿卜汁培養(yǎng)基：300mL蘿卜汁（100g蘿卜可得到100mL蘿卜汁，10000r/min，10min，4℃），蛋白胨10g，葡萄糖20g，pH6.5～6.8，700mL蒸餾水。

1.2.4泡蘿卜制作工藝流程［9］新鮮白蘿卜→清洗→殺菌（紫外照射0.5h）→晾干→切分→稱質(zhì)量→加入無菌鹽水（濃度為4%）→接種乳酸菌純培養(yǎng)液（108CFU/mL）→入壇發(fā)酵（25℃）→泡菜成品。

1.2.5發(fā)酵終點的確定由于泡菜發(fā)酵終點的確定沒有相應的國家標準可執(zhí)行，因此本實驗擬采用口感與酸度相結合的方法進行判定。當泡菜總酸含量在0.4%～0.6%范圍時，蘿卜生辣味消失、酸度適宜，質(zhì)地脆嫩時，表明泡菜已經(jīng)基本成熟［9］。

1.2.6單菌種發(fā)酵性能的測定在蘿卜汁培養(yǎng)基中接種已經(jīng)活化的各菌株并在37℃培養(yǎng)每隔8h取樣測定其OD值。

按1.2.4所述工藝泡制蘿卜，以未接種的自然發(fā)酵蘿卜為對照，每天定時取樣測定以下指標：

1.2.6.1脆度用質(zhì)構儀測定；測試條件如下：力量感應元5kg，探頭P/5，測前速率2mm/s，測試中速率2mm/s，測后速率10mm/s，壓縮距離：5mm，數(shù)據(jù)采集率：500pps，觸發(fā)力5g。

1.2.6.2總酸采用GB/T 12456《食品中總酸的測定》［10］的方法進行測定。

1.2.6.3亞硝酸鹽含量采用GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》［11］的方法進行測定。1.2.6.4氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法［12］測定。

1.2.6.5揮發(fā)性風味物質(zhì)采用固相微萃取技術及氣質(zhì)聯(lián)用（SPME/GC-MS）對發(fā)酵成熟的泡蘿卜進行揮發(fā)性風味成分的檢測。

1.2.7揮發(fā)性風味成分的檢測SPME頂空微萃取操作方法：將發(fā)酵成熟的蘿卜勻漿并取5.000g樣品置于15mL樣品瓶中，置于43℃的恒溫水浴鍋中平衡30min，然后將SPME手動進樣柄的針頭插入進樣瓶中，伸出纖維于上空的氣體中萃取30min，縮回纖維，并迅速將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，伸出纖維頭解析5min后縮回，取出萃取頭，進行分析［13］。

色譜條件：色譜柱為 HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；程序升溫：柱箱初始溫度36℃，保持3min，以5℃/min升至65℃，保持1min，以3℃/min升至108℃，保持1min，以2℃/min升至110℃，保持1min，以3℃/min升至155℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，保持3min；不分流進樣；載氣He，流量1.2mL/min；進樣口溫度250℃；輔助加熱器溫度280℃。

質(zhì)譜條件：電子能量70eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～550amu。

定性定量分析：由GC-MS得到的圖譜，經(jīng)計算機在NIST.11譜庫檢索，僅報道匹配度大于80的鑒定結果，并采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。

2　結果與分析

2.1不同乳酸菌在蘿卜汁培養(yǎng)基中的OD值變化情況

圖1顯示了4種乳酸菌在蘿卜汁培養(yǎng)基中OD值的變化情況。顯然，植物乳桿菌的生長速度明顯高于其他3種菌體，短乳桿菌次之，腸膜明串珠菌和戊糖片球菌相當。

圖1　不同乳酸菌在蘿卜汁培養(yǎng)基中OD值變化曲線Fig.1　Dynamic change of OD value by different lactic acid bacteria

2.2不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中總酸含量的動態(tài)變化

圖2顯示了分別接種腸膜明串珠菌、短乳桿菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌發(fā)酵蘿卜以及自然發(fā)酵蘿卜過程中總酸含量的動態(tài)變化。總的來說，自然發(fā)酵和接種乳酸菌發(fā)酵蘿卜總酸含量均是逐漸增多，并且發(fā)酵前期的增加速度高于后期。從產(chǎn)酸總量來說，植物乳桿菌產(chǎn)酸量最大，其次是短乳桿菌，然后是戊糖片球菌和腸膜明串珠菌，自然發(fā)酵產(chǎn)酸量最低，可見接種發(fā)酵能夠加快發(fā)酵速度縮短發(fā)酵周期，這一點對于工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。

2.3不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中氨基態(tài)氮的動態(tài)變化

圖3顯示了不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中氨基態(tài)氮含量的動態(tài)變化。隨著發(fā)酵的進行氨基態(tài)氮的含量在不斷的下降。這可能的原因是蘿卜中的肽、氨基酸等在發(fā)酵過程中不斷的溶入到泡菜汁中被各種微生物利用。

圖2　不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中總酸含量的動態(tài)變化Fig.2　Dynamic change of total acid by different lactic acid bacteria

圖3　不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中氨基態(tài)氮含量的動態(tài)變化Fig.3　Dynamic change of amino nitrogen content by different lactic acid bacteria

2.4不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中亞硝酸鹽含量的動態(tài)變化

泡菜在發(fā)酵過程中，蔬菜本身的硝酸鹽被硝酸還原酶還原成亞硝酸鹽。人體攝入亞硝酸鹽后，亞硝酸與胃中的含氮化合物結合成具有致癌性的亞硝胺［14］，對人體健康造成極大危害。

圖4　不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中亞硝酸鹽含量的動態(tài)變化Fig.4　Dynamic change of nitrite content by different lactic acid bacteria

從圖4可知，接種4種乳酸菌發(fā)酵過程中均沒有出現(xiàn)明顯的亞硝峰，而自然發(fā)酵在第3d出現(xiàn)亞硝峰，最高含量達30.459mg/kg，之后逐漸下降，至第7d時，接種發(fā)酵的蘿卜泡菜中亞硝酸鹽含量均低于自然發(fā)酵。由此可見，接種發(fā)酵可以有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量，保證了泡菜的食用安全性。

圖5　不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中脆度的動態(tài)變化Fig.5　Dynamic change of brittleness by different lactic acid bacteria

2.5不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過程中脆度的動態(tài)變化

脆度值是質(zhì)構儀模仿人咀嚼蘿卜時，蘿卜斷裂時需要的力的大小［15］。力越大說明蘿卜越脆。由圖5可知，自然發(fā)酵和接種發(fā)酵過程中脆度變化是一致的，均是隨著發(fā)酵的進行蘿卜脆度逐漸減小。發(fā)酵成熟時（總酸含量達到0.5%）脆度大小依次為：短乳桿菌＞腸膜明串珠菌＞植物乳桿菌＞戊糖片球菌＞自然發(fā)酵，由此可見接種發(fā)酵的蘿卜脆度優(yōu)于自然發(fā)酵，這與汪立平等［16］的研究結果一致。

2.6不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜揮發(fā)性風味物質(zhì)的比較

運用SPME-GC/MS對酸度達到0.5%［17］（以乳酸計）的植物乳桿菌發(fā)酵蘿卜、短乳桿菌發(fā)酵蘿卜、腸膜明串珠菌發(fā)酵蘿卜、戊糖片球菌發(fā)酵蘿卜的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行檢測，結果如表1所示。檢測出5種泡蘿卜成品中揮發(fā)性風味物質(zhì)達51種，在頂空溫度43℃條件下，烯類、酯類、酮類是泡蘿卜中含量較多的揮發(fā)性成分。一般來說，泡菜中的風味物質(zhì)主要有兩大來源，一是泡菜原料（蔬菜和香辛料）本身的風味物質(zhì)，二是乳酸菌及其他微生物發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)。

據(jù)陳功等［17］的研究表明，醇類和酯類風味閾值較大，故其對泡菜的風味影響較小，而二甲基硫化物、烯類、醛類由于閾值較小，即使含量很少對泡菜的風味也有很大的影響。

此外，由表1可以看出，自然發(fā)酵蘿卜產(chǎn)生的風味物質(zhì)較多但是含量都比較低，主要是因為自然發(fā)酵過程中微生物菌系比較豐富，產(chǎn)生了多種多樣的中間代謝產(chǎn)物，利于多種物質(zhì)的合成。自然發(fā)酵蘿卜中羅勒烯、萜品油烯、沉香醇等蔬菜本身所帶的揮發(fā)性物質(zhì)，相比于接種發(fā)酵蘿卜中此類物質(zhì)，含量大大減少，其原因可能是自然發(fā)酵需要較長的時間才能達到所需要的酸度（0.5%），較長的發(fā)酵周期使得蔬菜本身的揮發(fā)性物質(zhì)減少甚至消失，由此可見，接種發(fā)酵能夠明顯地縮短發(fā)酵周期，從而有效的保存蔬菜本身的香氣成分。

3　結論

對4種乳酸菌（植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌）發(fā)酵蘿卜以及自然發(fā)酵蘿卜過程進行動態(tài)監(jiān)測，由測得數(shù)據(jù)分析可知，發(fā)酵過程中總酸含量呈不斷上升的趨勢，第6、7d趨于平緩，產(chǎn)酸速率最大的為植物乳桿菌，其次是短乳桿菌，腸膜明串珠菌和戊糖片球菌相當，自然發(fā)酵產(chǎn)酸速率最小；發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮、脆度均呈下降趨勢，且發(fā)酵成熟時脆度大小依次為：短乳桿菌＞腸膜明串珠菌＞植物乳桿菌＞戊糖片球菌＞自然發(fā)酵；整個發(fā)酵過程中，只有自然發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量在第3d出現(xiàn)亞硝峰，接種發(fā)酵均未出現(xiàn)亞硝峰；泡蘿卜中揮發(fā)性風味物質(zhì)主要是烯類、酯類和酮類，自然發(fā)酵蘿卜產(chǎn)生的風味物質(zhì)相比接種發(fā)酵稍多，但是由于自然發(fā)酵周期較長，蔬菜本身的一些對風味影響較大的揮發(fā)性物質(zhì)含量大大減少，由此可見，接種發(fā)酵可以大大縮短發(fā)酵周期，最大程度的保持蔬菜原有的風味成分。

表1　不同乳酸菌發(fā)酵蘿卜主要揮發(fā)性成分及相對含量Table 1　Main volatile composition and relative content by different lactic acid bacteria

續(xù)表

［1］何淑玲，李博，籍保平.泡菜中亞硝酸鹽問題的研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，31（11）：85-87.

［2］李書華，蒲彪，陳封政.泡菜的功能及防腐研究進展［J］.中國釀造，2005（4）：6-8.

［3］Heui D.Antimutagenic activity of lactobacillus plantarum KLAB21 is isolated from kimchi Korean fermented vegetables［J］. Biotechnology Letters，2001，23（19）：1583-1589.

［4］PERDERSON S C.The effect of pure culture inoculation on fermentation of cucumbers［J］.Food Technology，1961，15：351-354.

［5］Choi I K，Jung S H，Kim B J，et al.Novel Leuconostoc citreum starter culture system for the fermentation of kimchi，a fermented cabbage product［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2003，84（4）：247-253.

［6］葉淑紅.植物乳桿菌的篩選及其在泡菜中的應用［J］.中國釀造，2004（7）：19-21.

［7］趙歷.植物乳桿菌發(fā)酵甘薯泡菜的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010（14）：7516-7517，7524.

［8］陸利霞，王曉飛，熊曉輝，等.植物乳桿菌b2純種發(fā)酵蘿卜泡菜的研究［J］.食品工業(yè)科技，2005，26（7）：59-61.

［9］敖曉琳.四川泡菜中兩株優(yōu)良乳酸菌的鑒定及不同發(fā)酵條件對其發(fā)酵泡菜品質(zhì)的影響［J］．食品科學，2011，32（11）：152-156．

［10］GB/T 12456-2008食品中總酸的測定［S］.

［11］GB 5009.33-2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定［S］.

［12］楊瑞，李博，籍保平.泡菜中亞硝酸鹽問題的研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，31（11）：85-87.

［13］張金鳳，蒲彪，陳安均.SDE和HS-SPME結合GC-MS分析傳統(tǒng)四川泡蘿卜的揮發(fā)性成分［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（15）：297-303.

［14］張少穎.不同處理方法對泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響［J］.中國食品學報，2011，11（1）：132-134.

［15］樂毅，劉學文.白蘿卜泡菜保脆工藝研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2011，47（2）：78-80.

［16］汪立平，汪欣，艾連中.純種植物乳桿菌發(fā)酵低鹽蘿卜泡菜的研究［J］.食品科學，2013，34（17）：182-186.

［17］陳功，張其圣，余文華，等.四川泡菜揮發(fā)性成分及主體風味的研究（二）［J］.中國釀造，2012，12：21-23

Dynamic changes of quality of pickles fermented by different lactic acid bacteria

HOU Xiao-yan，CHEN An-jun*，LUO Wei，DONG Wei，NIU Kai-li，PENG Yi-tao
（College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Using carrots as the main material to preserve pickles by Lactobacillus plantarum，Lactobacillus brevis，Leuconostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus，at the same time，the natural fermentation radish for comparison.Total acid and amino nitrogen，nitrite，brittleness four physical and chemical indicators were determined and the volatile flavor substances were determined by solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-CC/MS）.The results showed that the breed fermentation could significantly shorten the fermentation period and improve product quality.

lactic acid bacteria；fermentation；quality；dynamic changes

TS255.54

A

1002-0306（2015）02-0181-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.030

2014－05－22

侯曉艷（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

陳安均（1970-），男，博士，副教授，研究方向：園藝產(chǎn)品加工與貯藏。

國家自然科學基金項目（31171726）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B04）。