超高壓處理對(duì)冷卻牛肉色澤穩(wěn)定性的影響

王　璐，韓衍青，楊伯冰，李興民，徐寶才，戴瑞彤，*（.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京00083；.肉品加工與質(zhì)量控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇雨潤肉類產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇南京004）

超高壓處理對(duì)冷卻牛肉色澤穩(wěn)定性的影響

王璐1，韓衍青2，楊伯冰1，李興民1，徐寶才2，戴瑞彤1，*
（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.肉品加工與質(zhì)量控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇雨潤肉類產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇南京210041）

選取牛肉半腱肌為原料，研究室溫條件下，常壓以及200、400、600MPa超高壓處理10min對(duì)牛肉色澤穩(wěn)定性的影響，測(cè)定色差值、肌紅蛋白含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活性（MRA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量、耗氧率（OCR）等指標(biāo)。結(jié)果表明：高壓處理后牛肉的L*值升高，a*、b*值降低，OCR降低。MRA在400MPa左右達(dá)到最高，削弱高鐵肌紅蛋白（MetMb）的積累，NADH含量與MRA相關(guān)。貯藏期間，各組MRA、NADH含量均降低，但高壓處理組比對(duì)照組MetMb積累速度慢，說明高壓處理雖然可使肉色變淺，但貯藏期間肉色穩(wěn)定性提高。

超高壓，肌紅蛋白含量，高鐵肌紅蛋白還原酶活性，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸含量，耗氧率

超高壓技術(shù)（high pressure processing，HPP）是指將食品原料包裝后，密封于超高壓容器中，以流動(dòng)介質(zhì)作為傳壓媒介，在高靜壓（通常為100～1000MPa）下加工一定時(shí)間，引起生物體高分子成分中的非共價(jià)鍵（氫鍵、離子鍵和疏水鍵等）的破壞或形成，并殺死食品中的微生物，從而達(dá)到食品滅菌、保藏和加工目的的一種方法。

顏色是肉制品最重要的指標(biāo)之一，是消費(fèi)者判斷肉質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。放血充分的肌肉中，肌紅蛋白是色素物質(zhì)的主要成分，肌紅蛋白3種形式脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白之間的轉(zhuǎn)化賦予了肌肉不同的色調(diào)。普遍認(rèn)為肉色的褐變是鮮紅色的氧合肌紅蛋白自動(dòng)氧化生成暗褐色的高鐵肌紅蛋白所造成的，而肌細(xì)胞內(nèi)部的高鐵肌紅蛋白還原酶可以將高鐵肌紅蛋白還原為肌紅蛋白，從而穩(wěn)定肉色。在一定條件下，超高壓處理會(huì)對(duì)肉類顏色產(chǎn)生影響。馬漢軍等［1］研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理壓力升高，牛肉L*增加，a*下降，b*基本不變；壓力高于400MPa時(shí)L*保持穩(wěn)定，a*下降速度減緩；高壓處理使肌紅蛋白總量降低，高鐵肌紅蛋白的比例在400MPa以上顯著增加。Kathrine等［2］也有研究表明，300MPa以上壓力處理豬背最長肌，a*顯著下降，b*顯著增加。鯉魚和金槍魚的研究中也得到類似結(jié)論［3］。超高壓處理對(duì)肉色的影響是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，還有待于進(jìn)一步研究。目前對(duì)肉色的研究大多關(guān)注于色差值和肌紅蛋白含量的變化，而高鐵肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)對(duì)肉色的影響研究并不多。

本文主要研究了超高壓處理后，牛肉色差值、肌紅蛋白含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活力、NADH含量、肌肉呼吸耗氧率等指標(biāo)的變化，以探討超高壓處理對(duì)肉色穩(wěn)定性的影響。尤其從高鐵肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)方面進(jìn)行分析整合，旨為后續(xù)相關(guān)性研究提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉半腱肌北京金五星交易市場(chǎng)；馬心肌紅蛋白美國Sigma公司；NADH、噻脞藍(lán)、N-甲基-吩嗪甲基硫酸鹽、乙醇脫氫酶、Tris北京索萊寶科技有限公司；其他試劑北京藍(lán)弋試劑公司，均為分析純。

HPP/15L/600MPa超高壓設(shè)備包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；CR400色差儀日本柯尼卡—美能達(dá)公司；Evolution 60S紫外可見分光光度計(jì)北京益明德科技有限公司；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；OXYGRAPH液相氧電極英國漢莎（Hansatech）公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肉樣的處理取新鮮牛肉半腱肌，去除可見脂肪和結(jié)締組織，然后切分成厚1cm、約100g的肉塊。將樣品真空包裝后置于壓力處理釜中，設(shè)置200、400、600MPa三組壓力處理，壓力上升到設(shè)定目標(biāo)后保壓10min，施壓環(huán)境為室溫。高壓處理樣品與常壓對(duì)照組均置于4℃冰箱中儲(chǔ)存以備用，并考察其在1～5d貯藏期的變化。

1.2.2色差值的測(cè)定用色差儀直接測(cè)量樣品亮度值L*、紅度值a*、黃度值b*。

1.2.3肌紅蛋白含量的測(cè)定按參考文獻(xiàn)Tang［4］介紹的方法，略有改動(dòng)。取5g肉樣，加入25mL 0.04mol/L，pH6.8的磷酸鹽緩沖液。室溫下，10800r/min均質(zhì)25s。置均質(zhì)液于冰浴中1h，然后在8000r/min，4℃下離心15min，上清液用濾紙過濾。反應(yīng)體系在分光光度計(jì)上掃描，波長分別為：582、557、525、503nm。脫氧肌紅蛋白［DeoMb］、氧合肌紅蛋白［OxyMb］和高鐵肌紅蛋白［MetMb］含量（單位%）的計(jì)算公式如下：

其中，R1=A582/A525，R2=A557/A525，R3=A503/A525；A582、A557、A525、A503分別表示在582、557、525、503nm下的吸光值。

1.2.4高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）測(cè)定

1.2.4.1MetMb及樣品中粗酶液的提取參考Mikkelsen［5］介紹的方法。

1.2.4.2還原性測(cè)定按表1配制標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物，反應(yīng)溫度25℃，空白對(duì)照以水代替NADH，其他組分不變。反應(yīng)由加入NADH起始，記錄580nm下吸光值。MetMb還原酶活力用每毫升提取液在1min內(nèi)在580nm下吸光值變化來表示。

表1　高鐵肌紅蛋白還原酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物Table 1　Reaction substances of metmyoglobin reductase activity

1.2.5煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量測(cè)定參考孫京新［6］的方法，測(cè)定570nm處的吸光度，結(jié)果表示為nmol/g樣品。

1.2.6耗氧率（OCR）測(cè)定依據(jù)Kaplan［7］的方法，使用OXYGRAPH液相氧電極進(jìn)行耗氧率的測(cè)定。

1.2.7數(shù)據(jù)處理與分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)三個(gè)平行，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE）并進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

表2　超高壓處理對(duì)牛肉L*值的影響Table 2　The influence of high pressure process on L*value of beef

2.1超高壓處理對(duì)牛肉色差值的影響

由表2知，隨著壓力增加，牛肉L*值升高，壓力處理組顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。這與大部分學(xué)者的研究結(jié)果一致［8-9］。隨著貯藏天數(shù)增加，各組L*值均呈遞增趨勢(shì)，且隨著壓力增加，貯藏期間上升趨勢(shì)變緩。

L*值增加可能是由于高壓作用下肌紅蛋白中的球蛋白變性或者亞鐵血紅素被取代或失去所造成的。另外，L*值的上升與肉的系水力降低有關(guān)，由于處理壓力升高，肉樣表面纖維結(jié)構(gòu)更加疏松、汁液溶出量增加，水分附著在肉表面使肉的L*值增加［9］。

表3　超高壓處理對(duì)牛肉a*值的影響Table 3　The influence of high pressure process on a*value of beef

由表3知，隨著壓力升高，牛肉的a*呈遞減趨勢(shì)，壓力處理組之間差異顯著（p＜0.05）。貯藏期間，各組a*均隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，這可能是MetMb隨著時(shí)間積累的效果。5d內(nèi)壓力組a*值的降低顯著低于對(duì)照組。

高壓處理后a*的降低可能是由于亞鐵肌紅蛋白氧化而變成MetMb造成的［10］。Choi等［11］認(rèn)為a*下降的原因是肌漿蛋白中的磷酸化酶b、肌酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和一種未知蛋白變性對(duì)肉的a*起到遮掩作用，因此影響了肉的a*和L*。Pinero等［12］研究發(fā)現(xiàn)在牛肉餅中添加適量β-葡聚糖可以抑制顏色變化。

表4為超高壓處理對(duì)牛肉b*值的影響，隨著壓力升高，牛肉的b*值有降低的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在前2d并不明顯，第3d以后，400MPa與600MPa與對(duì)照組相比b*顯著降低（p＜0.05）。貯藏期間，b*的變化是波動(dòng)的，但各組第5d的b*都比第1d要顯著增加。

表4　超高壓處理對(duì)牛肉b*值的影響Table 4　The influence of high pressure process on b*value of beef

現(xiàn)有研究中，也有發(fā)現(xiàn)b*值隨著壓力的作用而呈降低的趨勢(shì)。Beltran等［13］將超高壓作用于剁碎的雞腿肉中觀察到a*和b*值降低。李宗軍等［14］發(fā)現(xiàn)，壓力處理可引起豬肉餅L*、a*和b*值的變化，變化幅度與加壓溫度有關(guān)。

2.2超高壓處理對(duì)牛肉肌紅蛋白含量的影響

表5～表7分別是超高壓處理對(duì)牛肉三種肌紅蛋白含量的影響。由表可知，壓力增加，MetMb含量先降低后升高，在400MPa時(shí)轉(zhuǎn)折得到較低值。而OxyMb的變化正好與MetMb相反。DeoxyMb含量隨著壓力變化是波動(dòng)的，無明顯規(guī)律。

表5　超高壓處理對(duì)牛肉MetMb含量的影響（%）Table 5　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表6　超高壓處理對(duì)牛肉OxyMb含量的影響（%）Table 6　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表7　超高壓處理對(duì)牛肉DeoxyMb含量的影響（%）Table 7　The influence of high pressure process on DeoxyMb of beef（%）

MetMb含量隨著時(shí)間逐漸增加，MetMb的積累是由OxyMb不斷氧化和高鐵肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)對(duì)MetMb的還原共同作用的結(jié)果。分析5d內(nèi)MetMb增加量發(fā)現(xiàn)，三個(gè)高壓處理組相比對(duì)照組MetMb積累速度慢，貯藏期間顏色穩(wěn)定性高于對(duì)照組，說明高壓處理可以提高肉色穩(wěn)定性。

適當(dāng)?shù)牡蛪禾幚砜梢约せ罡哞F肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)，還原已經(jīng)形成的MetMb，而當(dāng)壓力過高時(shí)，則會(huì)破壞還原酶系統(tǒng)，還原反應(yīng)也被抑制，從而使MetMb比例增加。Carlez等［15］報(bào)道在200～500MPa壓力下，總的可提取的肌紅蛋白下降，而MetMb在400～500MPa顯著增加。

雖然高壓處理生牛肉色澤有明顯變化，但對(duì)熟牛肉制品色澤影響卻很小，可能由于煮制過程中，肌紅蛋白變成了亞硝基肌紅蛋白，而這種蛋白不受壓力和其他蛋白質(zhì)凝膠的影響［16］，若壓力處理前，采用NaNO2和NaCl對(duì)生肉進(jìn)行腌制，所形成的亞硝基肌紅蛋白對(duì)壓力很穩(wěn)定，就可以對(duì)色澤起到保護(hù)作用。

表8　超高壓處理對(duì)牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響（nmolMMb reduced/min）Table 8　The influence of high pressure process on MRA of beef（nmolMMb reduced/min）

2.3超高壓處理對(duì)牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）的影響

由表8知，隨著壓力升高，牛肉MRA值先升高而后迅速降低，各組之間差異顯著（p＜0.05），且在400MPa左右出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，得到最大值。多數(shù)研究表明，壓力對(duì)酶活的影響主要分兩個(gè)階段：在較低壓力下，酶活性中心凝聚，酶和基質(zhì)的隔離狀態(tài)被打破，酶和基質(zhì)充分接觸，酶活性上升；在較高壓力下，酶蛋白的疏水鍵和離子鍵因體積縮小而斷裂，酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，活性中心喪失，酶活性下降。因此，推測(cè)在400MPa左右存在一個(gè)最適壓力使高鐵肌紅蛋白還原酶活性達(dá)到最高。

貯藏期間，各組MRA都逐漸降低。一方面由于高鐵肌紅蛋白還原反應(yīng)中的電子傳遞體和供體的減少，另一方面由于本實(shí)驗(yàn)測(cè)定MRA時(shí)添加了外源性NADH，MRA的降低很可能是冷藏期間高鐵肌紅蛋白還原酶變性引起的。

高鐵肌紅蛋白還原酶是高鐵肌紅蛋白還原酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，在NADH存在下，它可以有效地將MetMb（Fe3+）還原成二價(jià)（Fe2+）狀態(tài)。高鐵肌紅蛋白還原酶活力是阻止MetMb積累的控制因子，高M(jìn)RA可提高肉色穩(wěn)定性。研究表明，色澤越穩(wěn)定的肌肉，積累的MetMb量越少，這很可能是高鐵肌紅蛋白還原酶作用的結(jié)果。而在本實(shí)驗(yàn)中，MetMb含量和MRA的變化趨勢(shì)剛好相反，體現(xiàn)了很好的負(fù)相關(guān)性，與前人報(bào)道的結(jié)果相符合。

表9　超高壓處理對(duì)牛肉NADH含量的影響（nmol/g樣品）Table 9　The influence of high pressure process on NADH of beef（nmol/g sample）

2.4超高壓處理對(duì)牛肉NADH含量的影響

由表9知，加壓過程中，NADH含量的變化趨勢(shì)大體是先升高后回降，在400MPa左右出現(xiàn)拐點(diǎn)。這與MRA的變化是相對(duì)應(yīng)的。在肌肉環(huán)境中，NADH是高鐵肌紅蛋白還原反應(yīng)中的電子傳遞體和供體，NADH濃度與MRA活性呈極顯著正相關(guān)性［17］。在貯藏過程中，各組的NADH含量隨時(shí)間逐漸降低。

影響肉色的一個(gè)關(guān)鍵因素就是MetMb的還原，這需要NADH的協(xié)助。在一定程度上，它也制約了肉本身色素蛋白的還原能力，因?yàn)镹ADH含量很小而且其再生機(jī)制比較復(fù)雜，Bekhit等［18］研究表明NADH含量在穩(wěn)定牛肉顏色以及高鐵肌紅蛋白酶還原活性上起到了很大作用。高鐵肌紅蛋白還原酶還原MetMb是依賴NADH存在的，然而NADH在宰后肉中含量是逐漸降低的，宰后7d很難再檢測(cè)到NADH，因此宰后肉中MRA仍然保持一定水平，但肉色穩(wěn)定性卻難以維持。此外，一些研究還表明，乳酸脫氫酶與宰后NADH再生、MetMb的還原相關(guān)。這種機(jī)制是通過宰后注射乳酸鹽產(chǎn)生的乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽和NADH，從而提高高鐵肌紅蛋白酶還原能力來實(shí)現(xiàn)的。

2.5超高壓處理對(duì)牛肉耗氧率（OCR）的影響

由表10知，壓力升高，耗氧率降低。這可能是由于在高壓的擠壓作用下，降低了肌肉組織間的氧分壓。隨著貯藏時(shí)間延長，各組耗氧率都呈持續(xù)下降趨勢(shì)。三個(gè)高壓處理組之間在第1d有差異顯著，第2d開始200MPa與400MPa之間已無顯著變化，第4d時(shí)三組均無顯著差異。比較5d內(nèi)耗氧率降低量可知，高壓處理后能適當(dāng)延緩貯藏期間耗氧率的降低。

耗氧率表征呼吸強(qiáng)度，呼吸代謝更強(qiáng)的肌肉耗氧率更高，呼吸強(qiáng)度高的肉顏色穩(wěn)定性越差。耗氧率與MetMb積累速度呈顯著正相關(guān)［19］；線粒體活性高，呼吸耗氧上升，進(jìn)而降低了氧分壓，促使DeoMb生成和積累，DeoMb穩(wěn)定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色變褐。

表10　超高壓處理對(duì)牛肉耗氧率（OCR）的影響（nmol/（g meat·min））Table 10　The influence of high pressure process on OCR of beef（nmol/（g meat·min））

3　結(jié)論

牛肉經(jīng)高壓處理后，顏色淡化并變白，產(chǎn)生不利影響。壓力增加，牛肉L*值升高，a*、b*值、OCR降低。MRA在400MPa左右達(dá)到最高，削弱MetMb積累。貯藏期間，高壓處理組相比對(duì)照組MetMb積累速度慢，說明高壓處理雖然使肉色變淺，但處理后貯藏期間肉色穩(wěn)定性提高。因此后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用中可在200～400MPa之間選取一個(gè)適宜壓力，獲取較高M(jìn)RA，以保持牛肉較好的色澤，并抑制貯藏期間MetMb的積累。

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Effect of high pressure processing treatment on beef color stability

WANG Lu1，HAN Yan-qing2，YANG Bo-bing1，LI Xing-min1，XU Bao-cai2，DAI Rui-tong1，*
（1.College of Science and Nutrition Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China；2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Jiangsu Yurun Meat Group Co.，Ltd.，Nanjing 210041，China）

Beef emitendinous muscle was used as material in this experiment，different pressures of HPP（0，200，400，600MPa）10min on beef color stability were analyzed.The results of beef color，myoglobin，Metmyoglobin reducing activity（MRA），NADH and oxygen consumption rate（OCR）showed as follows：as the pressure increased，L*value of beef increased，a*and b*value decreased，OCR was reduced.400MPa group had the highest MRA and slowest rate of MetMb accumulation comparing with other groups，NADH level was associated with the MRA.During storage，MRA，NADH content were gradually decreased in both control and HPP-treated groups，but the rate of MetMb accumulation in HPP-treated groups were slower than that of the control group，indicating that the HPP treatment could improve color stability.

HPP；myoglobin；MRA；the content of NADH；OCR

TS251.52

A

1002-0306（2015）02-0138-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.022

2014－05－07

王璐（1991-），女，碩士研究生，研究方向：肉制品貯藏保鮮理論與技術(shù)。

戴瑞彤（1966-），女，博士研究生，副教授，研究方向：肉品的貯藏保鮮技術(shù)研究。

科技部十二五科研項(xiàng)目（2012BAD28B02）。