響應面法優(yōu)化超聲提取蘆筍總皂苷

揭　晶，孫桂芝，劉冬琳，張勇鋼

（武漢生物工程學院制藥工程系，湖北武漢430415）

響應面法優(yōu)化超聲提取蘆筍總皂苷

揭晶，孫桂芝，劉冬琳，張勇鋼*

（武漢生物工程學院制藥工程系，湖北武漢430415）

利用響應面法對超聲提取蘆筍總皂苷的工藝進行優(yōu)化。實驗研究了超聲條件下影響蘆筍總皂苷得率的因素，包括乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度，并通過響應面法優(yōu)化提取工藝。根據(jù)中心組合設計原理采用三因素三水平的響應面分析法，得出了超聲提取蘆筍總皂苷的最佳工藝條件為：料液比1∶15（W/V），乙醇濃度74%，超聲時間54min，超聲溫度50℃，此時蘆筍總皂苷得率為13.06%，接近于模型預測值13.18%。

響應面法，超聲提取，蘆筍，總皂苷

蘆筍系百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，是世界十大名菜之一，質(zhì)地鮮嫩，享有“蔬菜之王”的美稱［1-2］?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分為甾體皂苷類，具有較強的生理和藥理活性，包括抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-4］。

目前對蘆筍總皂苷提取進行研究的方法主要有兩種，即溶劑浸提法［5-6］和超聲波輔助提取法［7-9］。溶劑浸提法提取時間長、操作繁瑣。超聲提取技術作為一種中藥提取的新技術，具有省時、高效、能耗低等優(yōu)點，其在中藥提取工藝中的應用越來越受到關注。已有報道［10］采用這兩種方法對蘆筍老莖中皂苷進行提取，結果表明超聲法比浸提法的提取量提高了29.3%。本研究于國內(nèi)首次采用較高超聲功率（600W）對蘆筍總皂苷進行提取，以總皂苷得率為評價指標，采用單因素實驗和Box-Behnken響應面法優(yōu)選蘆筍總皂苷的最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘆筍武漢新辰食品有限公司提供的新鮮蘆筍莖，由武漢生物工程學院制藥工程系生藥教研室殷丹博士鑒定，洗凈切段晾干，于60℃烘干，粉碎過60目篩，備用；菝葜皂苷元對照品國藥集團化學試劑有限公司，純度98%，批號20100710；乙醇、甲醇、高氯酸國產(chǎn)分析純；蒸餾水。

HN22-600C型超聲波清洗機上海汗諾儀器有限公司；HHS4S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海光地儀器設備有限公司；TU-1810型紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；ZBY-26型商用制冰機江蘇白雪電器股份有限公司；BS124S型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的制作采用高氯酸法［7］。蘆筍中的甾體皂苷類化合物是抗癌的主要成分，其水解產(chǎn)物是菝葜皂苷元［11］，所以選擇菝葜皂苷元作為對照品。由于菝葜皂苷元沒有紫外吸收，所以選擇高氯酸作為顯色劑，間接測定蘆筍總皂苷的含量。準確稱取菝葜皂苷元對照品5mg，置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，備用。精密吸取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7m L，置于10m L具塞試管中，水浴揮干溶劑，加高氯酸5m L，搖勻，65℃水浴15min，取出后于冰水浴中冷卻5m in，于311nm處測定吸收度。

1.2.2蘆筍總皂苷的提取及測定精密稱取2g蘆筍粉末，置于250m L錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇適量，控制超聲功率600W，超聲頻率40kHz，在一定的溫度條件下超聲提取。然后將粗提液置于500m L圓底燒瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用甲醇溶解，過濾，所得濾液以甲醇定容至100m L，備用。吸取蘆筍總皂苷提取液0.1m L置于10m L具塞試管中，按標準曲線測定方法，測定其吸收度。根據(jù)標準曲線回歸方程計算總皂苷含量，并代入下列公式求出總皂苷得率。

1.2.3單因素實驗設計以總皂苷得率為評價指標，固定乙醇濃度70%、料液比1∶15（g/m L）、超聲時間50m in、超聲溫度50℃，考察不同的乙醇濃度（40%～90%）、料液比（1∶10～1∶35）、超聲時間（10～60min）、超聲溫度（40～80℃）對蘆筍總皂苷得率的影響。通過單因素實驗選出對蘆筍總皂苷得率具有顯著影響的因素，并確定其實驗水平值。

1.2.4響應面實驗設計根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，選擇影響蘆筍總皂苷得率（Y）的3個主要影響因素：乙醇濃度（X1）、超聲時間（X2）、超聲溫度（X3）進行組合，以-1、0、1代表因素水平，實驗因素及水平編碼見表1。

表1　Box-Behnken設計因素水平及編碼Table 1　Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合二次多項式方程。

2　結果與分析

2.1標準曲線的繪制

以菝葜皂苷元質(zhì)量（μg）為橫坐標，吸收度A為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1，得回歸方程y=0.0022x+ 0.0277，R2=0.9982，結果表明在102～357μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2單因素實驗結果

2.2.1乙醇濃度的影響由圖2可知，蘆筍總皂苷得率在乙醇濃度為70%時最高。乙醇濃度小于70%時總皂苷得率隨濃度的升高而升高，在60%后上升較快，這是因為高濃度乙醇有利于醇溶性的皂苷類物質(zhì)溶出。乙醇濃度超過70%后總皂苷得率隨乙醇濃度的升高反而降低，這是因為甾體皂苷易溶于稀醇，過高濃度的乙醇不利于甾體皂苷類物質(zhì)溶出。因此乙醇濃度選取70%為宜。

圖1　菝葜皂苷元標準曲線Fig.1　Standard curve of Sarsasapogenin

圖2　乙醇濃度對總皂苷得率的影響Fig.2　Influence of ethanol concentration on the extraction yield

2.2.2料液比的影響由圖3可知，料液比1∶15之前，總皂苷得率隨著料液比的增加而增加，這是因為溶劑量增大使得總皂苷溶出量增加。料液比超過1∶15后，總皂苷得率略有下降，可能是其他雜質(zhì)成分競爭性溶出不利于皂苷提取?？傮w趨勢變化不大，由此可知料液比在1∶10～1∶35范圍內(nèi)對蘆筍總皂苷得率影響不顯著。因此料液比選取1∶15為宜。

圖3　料液比對總皂苷得率的影響Fig.3　Influence of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.2.3超聲時間的影響由圖4可以看出在10～50m in范圍內(nèi)，總皂苷得率隨著時間延長而不斷增加，50m in后呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為50m in時，蘆筍總皂苷提取液達到平衡，此時總皂苷得率最高。提取時間繼續(xù)延長會增加雜質(zhì)成分的溶出，得率反而降低。因此超聲時間選取50m in為宜。

圖4　超聲時間對總皂苷得率的影響Fig.4　Influence of ultrasonic time on the extraction yield

2.2.4超聲溫度的影響由圖5可以看出在低溫下，蘆筍總皂苷溶出較慢，當溫度逐漸增大時，總皂苷隨之溶出加快；當溫度超過50℃后，總皂苷的含量反而減少，可能是由于高溫促使皂苷成分分解，使得皂苷成分被破壞，含量下降。因此超聲溫度選取50℃為宜。

圖5　超聲溫度對總皂苷得率的影響Fig.5　Influence ofultrasonic temperature on the extraction yield

2.3響應面法優(yōu)化蘆筍總皂苷提取工藝

2.3.1響應面分析實驗方案與結果根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，考慮到料液比在1∶10～1∶35范圍內(nèi)對蘆筍總皂苷得率影響不顯著，所以選取乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度3個因素，實驗方案及結果見表2。

表2　響應面實驗方案及結果Table 2　Projects and results of response surface experiments

2.3.2擬合回歸方程的建立采用Design Expert 8.0軟件對各因素進行多元線性回歸擬合，得二次多項回歸模型方程：Y=12.78-0.98X1+0.51X2-0.015X3-0.17X1X2+0.10X1X3-0.08X2X3-0.82X12-0.86X22-1.23X32?；貧w方程的方差分析結果見表3。

表3　回歸方程的方差分析結果Table 3　Analysis results of response surface experiments

從表3可以看出整體模型達到極顯著水平（p＜0.01），一次項X1、X2和二次項X12、X22、X32均達到極顯著水平（p＜0.01），表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系。由表3知失擬項不顯著（p＞0.05），表明該方程對實驗擬合情況好，實驗誤差小?；貧w方程的相關系數(shù)R2=0.9860，表明模型擬合程度良好，可用該模型對未知條件下總皂苷得率進行預測。該模型的變異系數(shù)（C.V.%）為1.92%，在可接受范圍內(nèi)，其值越小，重復性越好。由F值的大小可以推斷，在所選擇的實驗范圍內(nèi)，3個因素對總皂苷得率的影響程度大小順序依次為：乙醇濃度（X1）＞超聲時間（X2）＞超聲溫度（X3）。

2.3.3響應曲面分析響應面圖形是響應值對各實驗因素所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。采用Design Expert 8.0軟件處理后的三維響應面圖見圖6～圖8。

從圖6可以看出，固定乙醇濃度不變，隨著超聲時間的延長總皂苷得率增大，超聲時間為53m in時，總皂苷得率達到最大值，繼續(xù)延長時間則得率反而降低。固定超聲時間不變，隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因可能是因為高濃度乙醇和長時間超聲使得樣品中的雜質(zhì)競爭性溶出，導致皂苷的溶出量降低。乙醇濃度對響應值的影響大于提取時間。

圖6　乙醇濃度和超聲時間交互作用響應曲面圖Fig.6　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of total saponins

由圖7可以看出，固定乙醇濃度不變，隨著超聲溫度的升高，總皂苷得率先增加后降低，當超聲溫度為50℃，總皂苷得率達到最大值。固定超聲溫度不變，隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢。乙醇濃度對響應值的影響大于超聲溫度。

圖7　乙醇濃度和超聲溫度交互作用響應曲面圖Fig.7　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

由圖8可知，超聲時間和超聲溫度之間交互作用不顯著。隨著超聲時間的延長，總皂苷得率先增加后降低，當超聲時間為53m in時，總皂苷得率達到最大值。隨著超聲溫度的升高，總皂苷得率先增加后降低，當超聲溫度為50℃時，總皂苷得率達到最大值。這是因為超聲時間適當延長、超聲溫度適當升高是有利于皂苷成分溶出，但超聲時間過長、超聲溫度過高，雜質(zhì)成分大量溶出導致總皂苷得率反而降低。

圖8　超聲時間和超聲溫度交互作用響應曲面圖Fig.8　Response surface of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

2.3.4皂苷最佳提取條件的確定和驗證通過軟件對回歸方程進行分析處理，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇濃度73.69%，超聲時間53.63min，超聲溫度49.56℃。為了驗證響應面法的可靠性，在優(yōu)化條件下重復實驗3次?？紤]到實際操作的可行性，實際操作中取值為乙醇濃度74%，超聲時間54min，超聲溫度50℃。三組總皂苷得率分別為12.89%、13.12%、13.17%，平均值為13.06%（RSD=1.49%），實驗值與預測值（13.18%）非常接近，表明所建立的模型具有良好的預測性，優(yōu)選的工藝條件重復性良好。

3　結論

在單因素實驗的基礎上，通過Design Expert軟件采用Box-Behnken響應面分析法對蘆筍總皂苷提取工藝進行設計并優(yōu)化。研究結果表明乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度對蘆筍總皂苷得率的影響不是簡單的線性關系。在超聲功率600W，超聲頻率40kHz，料液比為1∶15的條件下，本實驗確定了超聲法提取蘆筍總皂苷最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度74%，超聲時間54m in，超聲溫度50℃，蘆筍總皂苷得率為13.06%。說明該模型可以較好的預測蘆筍總皂苷提取條件與得率之間的關系，同時也證明了響應面法優(yōu)化蘆筍總皂苷的提取工藝參數(shù)的可行性。

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Optim ization ultrasonic extraction process of totalsaponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology

JIE Jing，SUN Gui-zhi，LIU Dong-lin，ZHANG Yong-gang*
（Departmentof Pharmaceutical Engineering，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）

To op tim ize the ultrasonic extraction technique for the total saponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology.The effect fac tors on the yield of total saponins from Asparagus officinalis L. were stud ied w ith ultrasonic cond ition，inc lud ing ethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic time，ultrasonictem perature.Theop tim izedextractionp rocesswasfoundthroughtheresponsesurface methodology.Accord ing to the p rincip le of central composite design w ith the response surface methodology of three factors and three levels，the op timum ultrasound extraction technology was as follow ing：solid-liquid ratio 1∶15（W/V），74%ethanol，ultrasonic time 54m in，ultrasonic tem perature 50℃.Under the conditions，the extraction yield of the total saponins of Asparagus officinalis L.was 13.06%，which was wellmatched w ith the p red ictive extraction yield 13.18%.

response surface methodology；ultrasound extraction；Asparagus officinalis L.；totalsaponins

TS255.1

B

1002-0306（2015）06-0309-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.059

2013-11-25

揭晶（1980-），女，碩士研究生，講師，研究方向：中藥提取和中藥制劑。

張勇鋼（1979-），男，碩士，講師，研究方向：中藥制劑研究。

2013國家自然科學基金資助項目（31302144）；湖北省自然科學基金項目（2012FFB05201）；2012年度湖北省高等學校青年教師深入企業(yè)行動計劃項目（XD2012501）。