蓼藍中β-谷甾醇的提取及其抗氧化性研究

蔣瓊鳳，袁志輝，李　進，候依容

（1.湖南科技學院生命科學與化學工程系，湖南永州425199；2.湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199）

蓼藍中β-谷甾醇的提取及其抗氧化性研究

蔣瓊鳳1，2，袁志輝1，李進1，候依容1

（1.湖南科技學院生命科學與化學工程系，湖南永州425199；2.湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199）

采用超聲波法從蓼藍中提取出β-谷甾醇并對其含量進行了測定，研究了β-谷甾醇清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力，并與幾種常見抗氧化劑的清除能力進行了比較。研究了β-谷甾醇對豬油和芝麻油的抗氧化作用，以及與檸檬酸、VC等抗氧化劑混合之后對油脂的協同抗氧化效果。結果表明，蓼藍中含有豐富的β-谷甾醇，其含量大約為0.893%。β-谷甾醇對羥自由基和超氧陰離子自由基具有較強的清除能力，清除效果優(yōu)于苯甲酸和甘露醇，在高濃度條件下略低于VC。0.08%的β-谷甾醇對油脂氧化具有最好的抑制效果，且在與VC、檸檬酸合用時，具有協同增效作用。

蓼藍，β-谷甾醇，提取，抗氧化性

近年來，許多與衰老相伴隨的疾病發(fā)生率增加，天然藥物制劑越來越受到人們的關注，各種植物甾醇單體的特殊作用也逐漸被人們認識。β-谷甾醇作為植物甾醇成分之一，能治療結腸癌、乳腺癌［1］、前列腺增生［2］，具有消炎、抗氧化、降血壓、降血脂等多種藥理活性和生理功能［3-4］，已被廣泛應用到醫(yī)藥行業(yè)，但其來源植物僅限于半夏、裸燕麥、白花蛇舌草等。

蓼藍（Polygonum tinctorium Aiton），也稱為藍或靛青，是一種安全無害的植物，具有清熱解毒、涼血消斑、止血、抗炎、抗癌等功效，在我國各地均有分布，資源相當豐富［5］。蓼藍葉含色胺酮、青黛酮、β-谷甾醇等多種成分［6］。但國內外至今對蓼藍的研究甚少，尤其是蓼藍中甾醇的提取及生物活性研究。本研究采用超聲波輔助乙醇法從蓼藍中提取β-谷甾醇，并探討β-谷甾醇對羥自由基與超氧陰離子自由基的清除作用以及對動植物油脂的抗氧化作用，以期為蓼藍資源的開發(fā)提供理論依據，為β-谷甾醇在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域的應用提供生產來源和技術基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蓼藍永州瀟水河畔采集，蒸餾水洗凈后干燥至水分含量在0.5%以下，粉碎過40目篩，備用；β-谷甾醇標準品中國藥品生物制品檢驗所；乙醇（95%、75%）、乙醚、氫氧化鉀、維生素C、甘露醇、苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、鄰苯三酚、鹽酸、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷等均為分析純。

DHG-9070AS型鼓風干燥機寧波江南儀器；HN-CQY型超聲波萃取儀上海漢諾儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀鄭州長城科工貿有限公司；AY220型電子分析天平島津國際貿易公司；電熱恒溫水浴鍋江蘇國勝實驗儀器廠；UV-1800型島津紫外可見分光光度計島津國際貿易公司等。

1.2實驗方法

1.2.1蓼藍中β-谷甾醇的提取與測定

1.2.1.1標準曲線的繪制精確稱取25mgβ-谷甾醇標準品，用氯仿定容至50m L刻度線處（濃度為0.5mg/m L）。將標準品溶液以氯仿為空白，在190～400nm波長范圍內掃描，β-谷甾醇在255nm下有最大吸收，用刻度移液管分別取標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L置于50m L容量瓶中，加氯仿定容，得濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/m L的標準品溶液，搖勻，靜置。以氯仿為空白對照，在255nm處分別測定吸光度。以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線［7］。

1.2.1.2β-谷甾醇的提取精確稱取一定量干燥至恒重的蓼藍葉粉末2.000g，加入適量75%的乙醇，于超聲波中提取2h，回收乙醇，將燒瓶中殘余的乙醇揮發(fā)完，在烘箱中烘干至恒重，將烘干后的提取物置于三角瓶中，加入10m L 20%的KOH溶液（20g KOH溶于100m L 95%的乙醇）。在90℃水浴上回流加熱1.5h，取下三角瓶加入20m L蒸餾水稀釋，冷卻后移入分液漏斗中加適量乙醚，劇烈振蕩幾分鐘后去除下層乙醚不溶物，合并乙醚萃取液，回收乙醚。將殘余物濃縮得黃色膏狀物，加入適量95%乙醇，加熱溶解后置于0～5℃的冰箱中，最終析出的白色晶體即為β-谷甾醇粗品。

1.2.1.3精密度實驗用氯仿溶解β-谷甾醇，并定容至25m L容量瓶中，得供試樣品液。精密吸取β-谷甾醇標準品2.0m L和供試樣品溶液1.0m L各5份，按照1.2.1.1法測定，計算吸光度值相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

1.2.1.4重現性實驗精確稱取蓼藍干燥樣品5份，按1.2.1.2方法進行提取和標準曲線測定方法操作，計算蓼藍中β-谷甾醇的提取率以及相對標準偏差（RSD）。

1.2.1.5加樣回收率實驗精確稱取已知β-谷甾醇含量的蓼藍干燥樣品2.000g，加入不同量的β-谷甾醇標準品，按1.2.1.2和1.2.1.1方法操作，計算加樣回收率。

1.2.1.6蓼藍中β-谷甾醇的含量計算精確稱取蓼藍干燥樣品3份，按照1.2.1.2方法進行提取，按標準曲線法在255nm處測定吸光值，根據回歸方程及下列公式計算出蓼藍中β-谷甾醇的含量。

式中：C-待測溶液中β-谷甾醇的質量濃度（mg/ m L），V-待測樣品總體積（m L），N-溶液稀釋的倍數，M-蓼藍樣品的質量（g）。

1.2.2β-谷甾醇的抗氧化作用

1.2.2.1β-谷甾醇對羥自由基（·OH）的清除作用利用Fenton反應體系產生羥自由基，取pH為7.4的0.05mol/L PBS緩沖液2m L于試管中，加入2.5mmol/L的鄰菲羅啉1m L，滴加去離子水1.5m L，用棉花塞住管口，置于37℃的恒溫水浴中反應1.5h，在波長536nm處測定吸光值（A0）；取試管加入2m L PBS緩沖液，再加入1.0m L的2.5mmol/L FeSO4和0.5m L的0.02mol/L H2O2，同上述操作（A1）；取試管加入1.0m L PBS緩沖液后，再依次加入1.0m L鄰菲羅啉、1.0m L FeSO4、1.0m L濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/m L的β-谷甾醇樣品溶液和0.5m L H2O2，同上述操作（Ax）。注意加樣時每加一種試劑后要立即搖勻。在此體系下，以苯甲酸、維生素C和甘露醇為對照，考察蓼藍中β-谷甾醇樣品對·OH的清除能力［8］，清除率（S，%）計算公式為：S（%）=［（Ax-A1）/（A0-A1）］×100

1.2.2.2β-谷甾醇對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用利用鄰苯三酚在堿性條件下的自氧化反應生成超氧陰離子自由基［9］，實驗分為三組：A0組（調零組），A1組（空白組），Ax組（樣品組），按表1依次從左至右在10m L試管中加入樣品溶液和試劑。注意在Ax組中加入樣品后，需在25℃保溫10m in，A1、Ax組加入鄰苯三酚后需準確反應4min。上述各組在加樣反應后，用UV-1800紫外分光光度計在波長320nm處測定吸光度值。在此體系下，以苯甲酸、維生素C和甘露醇為對照，考察蓼藍中β-谷甾醇樣品對O2-·的清除能力，清除率（S，%）計算公式為：S（%）=［（A1-Ax）/（A1-A0）］×100

表1　樣品準備及超氧陰離子清除實驗（mL）Table 1　The preparation of sample and superoxide anion radical scavenging test（mL）

1.2.2.3β-谷甾醇對豬油與芝麻油的抗氧化作用采用干燥箱強化貯存法［10］，分別稱取5、10、20、35mg的β-谷甾醇粗品，置于燒杯中，用少量的乙醇充分溶解，再分別加入25g新鮮的豬油、芝麻油，攪拌均勻，在71℃干燥箱中強化保存。以25g豬油、芝麻油加同樣量的乙醇做空白對照，每隔一定的時間攪拌一次，并交換在干燥箱中的位置。每隔24h測定豬油、芝麻油的過氧化值（Peroxide Value，POV值），觀察其POV值變化趨勢，過氧化值的測定按照GB/T5538-2005方法進行。

稱取5mg的苯甲酸、檸檬酸和VC分別與β-谷甾醇粗品按1∶1比例混合，組成復合抗氧化劑，分別加入到25g豬油、芝麻油中，按上述方法測定過氧化值，并與樣品比較。

1.3數據處理

本文所涉及到的數據處理分析、曲線圖的制作均采用Excel軟件。

2　結果與分析

2.1蓼藍中β-谷甾醇的提取與含量測定

2.1.1標準曲線的繪制按1.2.1.1方法測定吸光值，以濃度C（mg/m L）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1），得回歸方程A=11.618×C-0.0005，R2=0.9969。

圖1　β-谷甾醇標準曲線Fig.1　The standard curve ofβ-sitosterol

2.1.2精密度實驗按1.2.1.3方法，標準品和供試樣品的吸光度值相對標準偏差（RSD）分別為：0.869%、1.270%，表明該測定方法的精密度良好。

2.1.3重現性實驗按1.2.1.4方法，據回歸方程得出蓼藍中β-谷甾醇的平均含量是0.901%，相對標準偏差（RSD）為1.260%（小于2%），表明該提取方法的重現性良好，實驗數據穩(wěn)定可靠。

2.1.4加樣回收率實驗按1.2.1.5方法，得加樣回收率（見表2），回收率均大于95%，表明此方法準確度良好。

表2　加樣回收率實驗Table 2　Results ofβ-sitosterol recovery test

2.1.5蓼藍中β-谷甾醇的含量按1.2.1.2方法、回歸方程及β-谷甾醇含量的計算公式，得到3份干燥樣品中β-谷甾醇的平均含量為0.893%，比異株蕁麻［11］、毛竹筍植物［12］中β-谷甾醇含量略高。

2.2β-谷甾醇的抗氧化作用

2.2.1β-谷甾醇對羥自由基的清除作用由圖2可見，四種抗氧化劑對·OH均有一定的清除能力，且清除率隨著濃度的增大而升高。各氧化劑隨濃度的變化其清除過程不同，其中β-谷甾醇對·OH的清除作用要優(yōu)于甘露醇與苯甲酸。在濃度為2.5mg/m L時，β-谷甾醇對·OH的清除率可達到75.84%，但在此濃度下略低于VC對·OH的清除率；VC在低濃度時對羥自由基清除效果較差，當濃度增加后，對·OH清除效果明顯增加，在濃度為2.5mg/m L時，其清除率達到79.19%。β-谷甾醇對·OH有較好的清除作用，這與劉慧瓊［10］、徐雅琴等［13］研究的甾醇能清除·OH，其清除能力隨甾醇濃度增大而逐漸升高的結果相同，且同等濃度下，蓼藍中β-谷甾醇對·OH清除能力比南瓜籽植物甾醇大，可能與甾醇的來源、純度等有關。

圖2　β-谷甾醇、甘露醇、VC及苯甲酸對羥自由基的清除率Fig.2　The scavenging rate ofβ-sitosterol，mannitol，VCand benzoic acid on hydroxyl radical

圖3　β-谷甾醇、甘露醇、VC及苯甲酸對超氧陰離子自由基的清除率Fig.3　The scavenging rate ofβ-sitosterol，mannitol，VCand benzoic acid on superoxide radical

2.2.2β-谷甾醇對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用由圖3可見，β-谷甾醇能抑制鄰苯三酚自氧化體系產生O2-·，其抑制作用隨濃度的增大而增強，但當濃度增大到一定值后，清除率不再隨濃度的增大而大幅提高。苯甲酸在各濃度梯度下對O2-·的清除效果均低于其他三種抗氧化劑；當樣品濃度在2mg/m L以內時，β-谷甾醇對O2-·的清除率優(yōu)于苯甲酸、VC和甘露醇；當樣品濃度為1.5mg/m L時，VC對O2-·的清除率急劇上升；當樣品濃度為2.5mg/m L時，β-谷甾醇的清除率70.70%，要低于VC的清除率83.70%。β-谷甾醇能有效的清除O2-·自由基，且清除能力較苯甲酸和甘露醇高，可能與其結構有關，β-谷甾醇羥基鄰位沒有官能團。這與趙雁武等［14］的研究結果甾醇對O2-·的清除能力高于VE、BHT一致。

2.2.3β-谷甾醇對油脂的抗氧化作用按1.2.2.3方法，在豬油、芝麻油中添加不同含量的β-谷甾醇，以測定β-谷甾醇對油脂的抗氧化作用，結果見圖4和圖5。將苯甲酸、檸檬酸和VC分別與β-谷甾醇樣品按1∶1比例混合，組成復合抗氧化劑，分別加入到豬油、芝麻油中，測定過氧化值，結果見圖6和圖7。

圖4　不同濃度β-谷甾醇對豬油的抗氧化作用Fig.4　Antioxidation ofβ-sitosterol to lard

圖5　不同濃度β-谷甾醇對芝麻油的抗氧化作用Fig.5　Antioxidation ofβ-sitosterol for sesame oil

由圖4和圖5可知，豬油和芝麻油的過氧化值隨時間的延長而增加，添加β-谷甾醇可明顯減緩過氧化值增加，這表明β-谷甾醇具有一定的抗氧化性，可減緩油脂氧化速率，延長保質期。通過比較，當β-谷甾醇濃度為0.02%時，抗氧化效果不明顯，β-谷甾醇濃度增大，過氧化值相對下降，說明在實驗劑量范圍內β-谷甾醇的添加量與其抗氧化性呈正相關。但當β-谷甾醇濃度增大到0.14%時其抗氧化活性反而降低，β-谷甾醇作為一種抗氧化劑，本身也容易被氧化，當濃度到達一定程度時，生成的氧化產物可能造成了過氧化值的升高。實驗時間為6～7d時，豬油和芝麻油的過氧化值增加明顯，表明時間延長，β-谷甾醇的抗氧化效果會降低，可能是跟β-谷甾醇的穩(wěn)定性質有關。

圖6　β-谷甾醇及復合抗氧化劑對豬油的抗氧化作用Fig.6　Antioxidation ofβ-sitosterol and threemixed antioxidant for lard

圖7　β-谷甾醇及復合抗氧化劑對芝麻油的抗氧化作用Fig.7　Antioxidation ofβ-sitosterol and threemixed antioxidant for sesame oil

由圖6和圖7可知，將檸檬酸和VC分別與β-谷甾醇樣品按1∶1比例混合添加到豬油和芝麻油中，其過氧化值下降更明顯。說明β-谷甾醇與VC、檸檬酸合用，有一定的抗氧化增效作用，其中β-谷甾醇與VC合用抗氧化效果最好。而β-谷甾醇與苯甲酸合用，無明顯協同效應，甚至對豬油表現出助氧化作用。β-谷甾醇與VC、檸檬酸合用，可作用于油脂氧化反應的不同階段，能充分發(fā)揮其協同作用。且檸檬酸本身無抗氧化性，可與油脂中的微量金屬離子形成絡合物，減少自由基的誘發(fā)，從而減慢油脂的過氧化作用，同時產生的氫離子能促使抗氧化劑再生。王川［15］研究葡萄籽單寧的抗氧化性時，VC由于強的還原性，能將豬油中的Fe3+還原成Fe2+，導致助氧化作用。而本研究中將VC添加到β-谷甾醇中，對豬油的抗氧化效果增加，可能要從以下方面解釋：VC除了本身具有一定的抗氧化作用外，它的強還原性可與豬油中的氧反應生成脫氫VC，降低油脂中氧濃度，減緩自動氧化反應的速度；同時VC的強還原性還可使酚類抗氧化劑生成的酚氧自由基還原，使酚類抗氧化劑再生，從而起到增效作用。

3　結論

3.1蓼藍中含有β-谷甾醇，通過超聲波法提取及紫外分光光度法測定，其含量約為0.893%，蓼藍資源豐富、分布廣泛，可為β-谷甾醇的生產提供新的來源，具有廣泛的開發(fā)前景和利用價值。

3.2蓼藍中β-谷甾醇具有較強的體外抗氧化活性，能抑制油脂氧化，當樣品濃度為0.08%時，對油脂呈現出最佳的抗氧化效果，且β-谷甾醇與VC、檸檬酸合用，具有協同增效作用。β-谷甾醇對清除羥自由基、超氧陰離子自由基具有較強的清除作用，各濃度梯度下清除效果均優(yōu)于苯甲酸、甘露醇，但濃度為2.5mg/m L時，β-谷甾醇的清除效果略低于VC。表明蓼藍中β-谷甾醇是一種天然的抗氧化劑及活性氧清除劑，具有增強免疫力、抗疲勞、抗衰老等功效，具有潛在的藥用價值。從蓼藍中提取生產出β-谷甾醇可為蓼藍的進一步開發(fā)及在藥物、食品等領域的應用提供理論依據。

［1］Awad A B，Chinnam M，Fink C S，et al.β-sitosterol activates fas signaling in human breast cancer cells［J］.Phytomedicine，2007，14：747-754.

［2］T JWilt，RMacdonald，A Ishant.β-sitosterol for the treatment of benign prostatic hyperplasia：a systematic review［J］.BJU International，1999，83：976-983.

［3］鐘建華，徐方正.植物甾醇的特性、生理功能及應用［J］.食品與藥品，2005，7（2）：20-21.

［4］陸伯益.竹筍中甾醇類化合物的研究-竹筍甾醇化學、工藝學及生物學功能［D］.杭州：浙江大學，2007.

［5］林英，賴書紳，周蓄源，等.江西植物志（第二卷）［M］.北京：中國科學技術出版社，2004.

［6］劉福濤，宋曉靜，魏薔，等.蓼藍揮發(fā)性成分研究［J］.北京師范大學學報，2010，46（5）：586-588.

［7］烏漢其木格，張美莉.裸燕麥麩皮中β-谷甾醇的提?。跩］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（1）：131-133.

［8］王多寧，張小莉，楊穎，等.百合多糖對羥自由基的清除作用［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2006，29（4）：53-55.

［9］曹鵬飛.石榴皮和綠茶中單寧的抗氧化作用研究［J］.安徽農業(yè)科學，2011，39（20）：12136-12137，12140.

［10］劉慧瓊，郭書好，沈英森，等.半夏中β-谷甾醇的抗氧化作用研究［J］.廣東藥學院學報，2004，20（3）：281-283.

［11］何斌，劉勇.異株蕁麻β-谷甾醇提取工藝的優(yōu)化［J］.湖北農業(yè)科學，2012，51（20）：4601-4603.

［12］呂國提，林麗靜，朱冰倩，等.毛竹筍筍頭中β-谷甾醇不同提取方法的比較研究［J］.農業(yè)機械，2012，27（9）：111-113.

［13］徐雅琴，龐麗萍，齊會娟，等.南瓜籽植物甾醇的抗氧化性及抑菌性研究［J］.農產品加工·學刊，2012，280（5）：14-16，26.

［14］趙雁武，王憲偉，黃瀅璋，等.蘋果籽油中植物甾醇抗氧化活性研究［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（9）：221-225.

［15］王川.葡萄籽單寧的抗氧化性研究［J］.食品科技，2009，34（2）：184-187.

Extraction ofβ-sitosterol from Polygonum tinctorium Aiton and study on its antioxidation

JIANG Qiong-feng1，2，YUAN Zhi-hui1，LI Jin1，HOU Yi-rong1
（1.Departmentof Life Sciences and Chemical Engineering，Hunan University of Science and Engineering，
Yongzhou 425199，China；2.Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources of Hunan South，Yongzhou 425199，China）

β-sitosterolwas extracted from Polygonum tinctorium Aiton by ultrasonic wave method and its content in source p lant was also determ ined in this paper.Present study also conducted the research of antioxidant and free rad ical scavenging activities ofβ-sitosterol，as well as comparing w ith the other normal antioxidants，the antioxidative effectofβ-sitosterol in the p reservation of lard and sesame oil，and the synergistic antioxidative effec t ofβ-sitosterolm ixed w ith citric acid or vitam in C.The results showed that the content ofβ-sitosterol in Polygonum tinc torium Aiton was 0.893%.The extrac ts ofβ-sitosterol could effectively scavenge hyd roxyl rad ical and superoxide anion rad ical，better than benzoic acid and mannitol and weak than VCin hyperconcentration.0.08% β-sitosterol could effectively inhibit the lard and sesame oil p reoxidation，and more effec tive when m ixed w ith citric acid or vitam in C.

Polygonum tinctorium Aiton；β-sitosterol；extrac tion；antioxidant

TS201.2

A

1002-0306（2015）06-0108-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.016

2014-07-15

蔣瓊鳳（1982-），女，碩士研究生，實驗師，主要從事天然產物化學方面的研究。

湖南省科技廳2014年第四批科技計劃項目（2014NK3002）；湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室資助項目（XNZW14C05）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助（2012-318）。