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    側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因(LIF)的原核表達與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹幼

    2015-10-20 20:55:11葉宗樺等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年9期

    葉宗樺等

    摘要:麻風(fēng)樹(Jatropha curcas L.)的有限分枝是限制麻風(fēng)樹油產(chǎn)量的最主要因素之一,為了奠定基因調(diào)控麻風(fēng)樹分枝的基礎(chǔ),研究并優(yōu)化了側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因LIF(lateral shoot-inducing factor )的原核表達條件,并成功獲得了重組蛋白。通過研究農(nóng)桿菌濃度、抗生素濃度建立了穩(wěn)固高效的麻風(fēng)樹農(nóng)桿菌((LBA4404)高效轉(zhuǎn)化體系;將LIF基因轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組中,通過GUS染色、PCR、Southern blot檢測,確定了LIF基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化入麻風(fēng)樹基因組中,獲得了高達(23.91±5.78)%的轉(zhuǎn)化率。

    關(guān)鍵詞:麻風(fēng)樹;側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因(LIF);幼葉;農(nóng)桿菌

    中圖分類號:Q943.2 文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2015)09-0014-06

    收稿日期:2014-08-28

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:51308464);西南交通大學(xué)科技創(chuàng)新項目(編號:A0920502051405-62)。

    作者簡介:宗樺(1981—),女,江蘇宜興人,博士,講師,主要從事植物學(xué)研究。E-mail:14744632@qq.com。屬于大戟科的麻風(fēng)樹(Jatropha curcas L.)是一類具有極強抗旱性的大灌木或小喬木,其種子中含油豐富,并能較容易地轉(zhuǎn)化成純度能滿足美國和歐洲標準的生物柴油[1]。此外,麻風(fēng)樹油還可應(yīng)用于制造肥皂、化妝品、染料等產(chǎn)品[2-4]。然而,由于麻風(fēng)樹的種子產(chǎn)量較低,極大地限制了麻風(fēng)樹油的推廣應(yīng)用。迄今為止,提高麻風(fēng)樹種子的產(chǎn)量仍是一件十分困難的事情,這是由于麻風(fēng)樹的種子產(chǎn)量受到多種因素影響,如自然環(huán)境[5]、麻風(fēng)樹的分枝形態(tài)[6]、基因型[7]、經(jīng)營管理方法[8]等。在這些因素當(dāng)中,麻風(fēng)樹結(jié)果母枝的分枝形態(tài)被認為是最重要的制約因素之一,因此許多學(xué)者認為增加麻風(fēng)樹結(jié)果母枝的數(shù)量就能有效地提高麻風(fēng)樹種子的產(chǎn)量[8-9]。

    近年來,世界各國都開始關(guān)注植物分枝發(fā)育控制機理的研究,通過采用包括突變體分離、定位、克隆相關(guān)基因和相關(guān)基因分析等分子生物技術(shù)等方法,不斷加深對植物分枝發(fā)育的認識。目前在許多物種,如矮牽牛[10-11]、煙草[12]、番茄、豌豆、玉米、水稻和擬南芥[13]中都開展了突變體作為分枝的變化模式研究。2005年,Nakagawa等從矮牽牛中克隆出了側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因LIF,是目前唯一一個被報道的分枝基因[14]。

    Nakagawa等研究發(fā)現(xiàn),LIF基因在矮牽牛、煙草、擬南芥中過量表達均可以導(dǎo)致植株分枝明顯增多,高度明顯降低,葉片小化[14],由此Nakagawa等推斷,LIF基因在雙子葉植物中能保守地表達,可以調(diào)控雙子葉植物的分枝[14]。進一步研究發(fā)現(xiàn),LIF編碼的蛋白屬于一種TFⅢA型鋅指蛋白,具有這種類型結(jié)構(gòu)域的蛋白一般是結(jié)合DNA作為轉(zhuǎn)錄因子參于多種植物的調(diào)控過程。然而由于LIF被發(fā)現(xiàn)的時間短,因此針對LIF誘導(dǎo)的蛋白的功能研究還未開展。再加上植物分枝的形成是一個受多種因素影響的復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象,因此,針對單個基因開展蛋白純化研究對于了解其在植物形態(tài)構(gòu)成上的功能有一定的難度。而通過重組的方式在大腸桿菌中進行原核表達為LIF基因的功能研究提供了一個良好的途徑。眾所周知,大腸桿菌是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最常用的材料之一,目前除了己經(jīng)掌握了它的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方面的大量資料外,在基因表達方面也有深入研究。大腸桿菌遺傳背景清楚,容易培養(yǎng),能大規(guī)模發(fā)酵,并具有大量可供選擇利用的克隆和高效表達載體[15]。

    本研究構(gòu)建了LIF原核表達載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,將轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達,獲得重組蛋白,摸索表達的最優(yōu)條件,為進一步探討LIF的功能奠定基礎(chǔ)。同時,將LIF基因轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組,了解LIF基因在麻風(fēng)樹中的表達方式,為基因調(diào)控麻風(fēng)樹的分枝做好準備工作。

    1材料與方法

    1.1植物材料和菌株

    試驗所用矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)種苗種植在溫室(14 h光照/10 h黑暗,室溫22 ℃)中。成熟麻風(fēng)樹種子來源于攀枝花市。種苗種植于盛滿沙和營養(yǎng)土的塑料盆缽中,于溫室中生長2個月(16 h光照/8 h黑暗,室溫28 ℃)后,取第1~3節(jié)上的葉片用作試驗。滅菌后的麻風(fēng)樹幼葉切成為 1 cm2 的小塊,接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2 d。

    Escherichia coli菌株BL21、農(nóng)桿菌菌株LBA4404均為筆者所在實驗室保存。

    1.2矮牽牛LIF基因開放閱讀框獲得和原核表達載體構(gòu)建

    1.2.1LIF基因ORF的擴增提取矮牽牛的RNA,用Oligo (dT)18為引物進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,設(shè)計引物lof33、lof52進行PCR擴增ORF序列。酶切位點(下劃線部分)分別為BamHⅠ、HindⅢ。引物序列如下:lof33:5′-CCCAAGCTTTCATAAGAACTTTCTTGTGCCTAAACC-3′;lof52:5 ′-CGCGGATCCATGGAAACTAGTAAAAATCAGCCGTC-3′;反轉(zhuǎn)錄引物:Oligo (dT)18:5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18-3′。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 40 s,62 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳后進行回收,回收按照DNA膠回收試劑盒的說明步驟進行。

    1.2.2原核表達載體的構(gòu)建原核表達所用質(zhì)粒載體選用pET32[16],含有T7啟動子、6個His標簽,具有Amp抗性。將膠回收的片段連接到pMD19-T載體上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)獲得轉(zhuǎn)化子pMD19-T-LIF,搖菌1 h后涂LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng)。于第2天挑菌,搖菌后送樣測序。經(jīng)測序檢測獲得LIF的ORF片段后,搖菌提質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ雙酶切載體pET32,膠回收線性載體。用T4連接酶連接目的片段與線性載體(均帶有BamHⅠ、HindⅢ黏性末端)。16 ℃連接過夜,獲得重組子pET-LIF (簡稱PL)。隨后將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞獲得轉(zhuǎn)化子PLB,搖菌后提取質(zhì)粒,采用酶切、菌落PCR和測序等手段檢驗?zāi)康钠问欠裾_。同時也將空載pET32用同樣的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21以獲得空白對照轉(zhuǎn)化子pET32-Empty (簡稱PE)。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

    1.3PLB的誘導(dǎo)表達

    挑取重組菌PLB、PE分別接種到15 mL的AMP-LB液體培養(yǎng)基中,放置于37 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h。再從過夜培養(yǎng)物種各取500 μL菌液接種于新鮮的10 mL AMP-LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃下振蕩培養(yǎng)直到菌液的D600 nm= 0.6~0.7。隨后將PLB菌液均分后放置于不同的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和添加不同濃度的IPTG中進行誘導(dǎo)(表1)。

    1.3矮牽牛LIF基因蛋白編碼序列 (coding sequence,CDS)和植物表達載體的構(gòu)建

    1.3.1CDS的擴增首先在GenBank搜索出矮牽牛LIF基因的編碼蛋白(accession number:AB035093),根據(jù)其蛋白序列設(shè)計出C1、C2引物序列用于擴增矮牽牛CDS,酶切位點分別為XbaⅠ、SmaⅠ酶切位點(酶切位點見下劃線)。引物序

    1.3.2植物表達載體的構(gòu)建將LIF基因的CDS插入表達載體pBI121[17]中,LIF基因的插入位置見圖1,獲得重組載體pBI121-LIF。pBI121載體含有Npt Ⅱ基因,抗卡拉霉素(Kan);含GUS基因作為報告基因;含CaMV35S啟動子(筆者所在實驗室保存)。提取重組子pBI121-LIF質(zhì)粒后,用反復(fù)凍融法[18]將其轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404[19]感受態(tài)細胞中,同時也將空載pBI121以同樣的方法轉(zhuǎn)入2種農(nóng)桿菌感受態(tài)中以獲得空白對照,獲得轉(zhuǎn)化子pBI121-Empty (簡稱PBE)。檢驗后的含有LIF基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到1 mL YEB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中加入50 μg/mL鏈霉素(Str )、100 μg/mL 利福平(Rif)、100 μg/mL Kan,于恒溫搖床上 27 ℃、200 r/min搖培過夜。取出500 μL培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)入新配制的有同樣抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)直到D600 nm=1.0時,用新鮮的MS液體培養(yǎng)基(pH值5.4~5.8)分別稀釋為D600 nm=0.1~0.5用于轉(zhuǎn)化。

    1.4培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件

    試驗中外植體培養(yǎng)均選用MS培養(yǎng)基[20]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其中蔗糖質(zhì)量濃度為3%,瓊脂質(zhì)量濃度為0.8%,pH值為58。外植體的培養(yǎng)均在28 ℃的溫室中進行,并保持16 h光照、8 h黑暗交替。具體培養(yǎng)基配方如下[21]:愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CI):MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L 2,4-D;愈傷組織再生培養(yǎng)基(PR):MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L GA3;生根培養(yǎng)基(RM):MS+02 mg/L IBA;大腸桿菌LB培養(yǎng)基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L NaCl,pH值7.0。固體LB培養(yǎng)基在以上成分中添加15 g/L瓊脂粉。

    1.5外植體的轉(zhuǎn)化和選擇培養(yǎng)

    預(yù)培養(yǎng)之后的幼葉外植體浸入30 mL含LIF基因的農(nóng)桿菌菌液體中,在28 ℃、200 r/min的搖床上侵染10 min。用干燥的無菌濾紙吸去多余菌液后將外植體轉(zhuǎn)移到CI培養(yǎng)基中,在全暗的溫室(28 ℃)中共培養(yǎng)2~7 d。隨后,將外植體轉(zhuǎn)入加入了300 mg/L頭孢霉素(Cef)的新鮮CI培養(yǎng)基中,繼續(xù)暗培養(yǎng)3周。待愈傷組織產(chǎn)生后,馬上轉(zhuǎn)入加入了Kan(0、10、20、30、40 mg/L)、150 mg/L Cef的新鮮PR培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性叢生芽。經(jīng)過4周的篩選后,將抗Kan(KanR)的麻風(fēng)樹再生單芽切下并轉(zhuǎn)入加入Kan的RM生根培養(yǎng)基中。經(jīng)3~4周誘導(dǎo)后,將生根的植株移入放置于溫室中的培養(yǎng)缽中,培養(yǎng)缽中加入珍珠巖 ∶沙 ∶土=1 ∶1 ∶1(體積比)的混合基質(zhì)中練苗2周后移入大田。

    1.6轉(zhuǎn)基因植株的鑒別

    GUS染色:將共培養(yǎng)后的葉盤、愈傷組織和抗Kan的叢生苗切成小塊后放在1.5 mL的離心管中,加入GUS染液,37 ℃ 水浴16 h[22]。植株材料用70%的乙醇脫色2~3次,在解剖鏡和顯微鏡下進行觀察和拍照。

    PCR檢測:采用CTAB法[23]提取轉(zhuǎn)基因麻風(fēng)樹的DNA,設(shè)計引物擴增檢驗是否獲得轉(zhuǎn)基因植株。首先設(shè)計了2條引物:qc1:5′-ACCGTCGGGCAAAGACAGATT-3′;qc2:5′-GACCGCATCGAAACGCAGCAC-3′,預(yù)期擴增的長度為 538 bp。擴增序列中包含LIF基因中246 bp的序列和GUS基因中長度為292 bp的序列,PCR反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s,62 ℃40 s,72 ℃ 1 min,34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    Southern blot檢測:為了進一步確定LIF基因已經(jīng)插入麻風(fēng)樹基因組,先從PCR檢測呈陽性 (PCR+)的植株中提出DNA(20 μg),隨后用EcoRⅠ、HindⅢ于37 ℃酶切過夜。EcoRⅠ、HindⅢ在質(zhì)粒pBI121上各僅有1個酶切位點。以重組質(zhì)粒pBI121-LIF為模板用引物qc1、qc2擴增LIF基因的ORF,按照PCR Digoxigenin (DIG) Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)說明制作探針。雜交的具體操作按照Raffeiner的報道[24]進行,3 d后進行拍照(Kodak 8-10 X-Omat AR,Rochester)。

    1.7數(shù)據(jù)分析

    研究中用到的相關(guān)計算公式如下:

    存活率=有分化能力的幼葉外植體數(shù)量/外植體總數(shù)×100%;

    GUS的瞬時表達率=GUS顯陽性(GUS+)的存活外植體數(shù)量/外植體總數(shù)×100%。

    所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計軟件(ver.11.0)進行Duncans多重分析比較。

    2結(jié)果與分析

    2.1原核表達載體的獲得

    以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用引物lof33、lof52進行PCR擴增LIF基因的ORF序列,獲得了1條650 bp的片段(圖2-A),膠回收后與載體pMD19-T相連接,并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)獲得轉(zhuǎn)化子pMD19-T-LIF;提取pMD19-T-LIF轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒雙酶切后的片段(650 bp),與BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后的pET32載體連接,獲得重組子pET-LIF;將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài),經(jīng)過菌落PCR、雙酶切(圖2-B)和測序驗證,證明獲得了轉(zhuǎn)化子PLB,原核表達載體PLB構(gòu)建成功。

    2.2PLB誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化研究

    通過圖3的SDS-PAGE分析,比較得出了在不同的誘導(dǎo)條件下重組菌的最佳表達條件,并成功誘導(dǎo)重組蛋白的表達。在不同的誘導(dǎo)溫度梯度下,PLB均比對照多出1條約為43 ku的目的條帶;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為設(shè)置為37 ℃時,目的條帶十分明顯;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時,也能看到目的條帶,但比37 ℃稍弱;20 ℃下誘導(dǎo)的PLB表達最弱。在不同的誘導(dǎo)時間梯度下,PLB都比對照多出1條約為43 ku的目的條帶,說明在2、4、6 h 3個處理時間內(nèi),PLB均有表達。但3個處理時間下的誘導(dǎo)表達量有所不同,誘導(dǎo)2 h的條帶最弱;而誘導(dǎo)4、6 h的條帶都很亮,說明這2個時間內(nèi)的融合蛋白誘導(dǎo)表達最強;隨著時間從4 h延長到6 h,表達量沒有隨之增加,表明誘導(dǎo)4 h為最佳收獲時間。如果菌體過度培養(yǎng),一方面由于Amp逐漸失活,失去選擇壓后質(zhì)??焖賮G失,不能增加表達產(chǎn)量; 另一

    方面由于菌體老化和代謝產(chǎn)物的影響,菌體不但不繼續(xù)生長,反而會死亡、分解,使目的蛋白丟失[25]。由圖3-C可以看出,只要加入了IPTG,PLB就能產(chǎn)生大小約為43 ku的重組蛋白。不同濃度的IPTG對PLB的誘導(dǎo)效果有差異,其中IPTG為0.120 g/L時誘導(dǎo)的重組蛋白量最大,其次是0.240 g/L,0.024 g/L誘導(dǎo)PLB表達的量最少,無IPTG時無重組蛋白產(chǎn)生。根據(jù)表達載體pET32的分子量、LIF基因ORF成熟肽分子量的估算,融合蛋白的總分子量應(yīng)為43 ku。

    2.3農(nóng)桿菌侵染最佳濃度

    本研究發(fā)現(xiàn),菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。由表2可見,當(dāng)用D600 nm=0.1的LBA4404菌液侵染后,愈傷組織產(chǎn)生了數(shù)量最多的藍斑(GUS+);隨著濃度的升高(D600 nm>0.1),多余的菌體改變了培養(yǎng)基的pH值,并抑制了愈傷組織的產(chǎn)生,嚴重制約轉(zhuǎn)化效率。這一現(xiàn)象與Yong等的研究結(jié)論相一致,他們認為高濃度的農(nóng)桿菌液反而會產(chǎn)生較低的轉(zhuǎn)化效率[26-27]。因此,本研究結(jié)果表明,D600 nm=0.1的農(nóng)桿菌LBA4404最適于麻風(fēng)樹幼葉轉(zhuǎn)化。

    2.4Kan的篩選效果

    在許多木本植物的轉(zhuǎn)化過程中,Kan都被用于篩選轉(zhuǎn)基因植株[28-31],Kan的敏感性取決于植物種類、外植體類型[32]。本研究表明,不同的濃度梯度(20、30、40 mg/L)的Kan均能篩選出PCR檢驗呈陽性(PCR+)的植株(表3)。雖然40 mg/L Kan對愈傷組織再生有一定抑制作用,但只有高濃度的Kan才能完全抑制未轉(zhuǎn)化叢生芽的再生。相比之下,在加入20、30 mg/L Kan的培養(yǎng)基中會有部分未轉(zhuǎn)化的叢生芽產(chǎn)生,稱之為“逃離”。因此,本研究表明40 mg/L是Kan用于篩選的最佳濃度。Kan能有效地篩選出麻風(fēng)樹轉(zhuǎn)基因植株,與Li等提出的Kan不適于用于麻風(fēng)樹的篩選的結(jié)論相悖[33]。培養(yǎng)4周后,待抗Kan的叢生芽(圖4-C)長至2~3 cm 高時,轉(zhuǎn)入加入40 mg/L Kan的RM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(圖4-D)。用Kan持續(xù)篩選能有效抑制未轉(zhuǎn)化植株的逃離,持續(xù)篩選非常必要[34]。培養(yǎng)1個月后,生根的植株移入培養(yǎng)缽中進行2周的煉苗(圖4-E)。

    2.5GUS 染色分析

    為了確認轉(zhuǎn)化子,誘導(dǎo)出的愈傷組織和KanR再生植株都需要進行GUS染色。經(jīng)GUS染色后,發(fā)現(xiàn)有68%的愈傷組織出現(xiàn)藍斑,表明呈現(xiàn)GUS+(表2)。愈傷培養(yǎng)4周后, 有35%的GUS+愈傷組織分化出KanR叢生芽。用40 mg/L Kan篩選出的所有植株都呈現(xiàn)GUS+(表3)。此外,筆者發(fā)現(xiàn)KanR植株的藍斑都沿著莖節(jié)和葉柄分布(圖5-e至圖5-h),在愈傷組織上則是隨機分布(圖5-b),在根系中無活性。這一現(xiàn)象與Nakagawa等在LIF基因超表達的矮牽牛中GUS藍斑的分布趨勢一致[14]。Nakagawa等推斷,LIF基因可能參與了矮牽牛葉腋處的細胞分裂素的產(chǎn)生過程。此外,本研究在對照植株中未觀察到GUS藍斑(圖5-c、圖5-d)。

    2.6PCR和Southern檢測

    GUS+再生苗首先采用PCR法一步驗證基因轉(zhuǎn)入的真實性。PCR檢測提取了轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板,所以消除了殘留菌株的干擾,比GUS染色更可靠。由圖6-A可以看出,隨機抽取的GUS+再生苗均擴增出了預(yù)期0.54 kb大小片段,未轉(zhuǎn)基因的對照植株無任何條帶出現(xiàn)。通過PCR檢測證明,201個葉盤在經(jīng)過3個月的轉(zhuǎn)化后,有48個產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植株,所占比例達到(23.91±5.78)%(表3),轉(zhuǎn)化效率明顯高于Li等報道的13%的轉(zhuǎn)化率[34]。隨后,根據(jù)PCR的檢測結(jié)果,進一步使用Southern Blot最終檢測轉(zhuǎn)基因植株。本研究隨機抽取了12個PCR+植株以GUS基因的部分片段為探針進行Southern雜交,預(yù)期的雜交片段約為3.6 kb, 圖6-B顯

    示了3株P(guān)CR+植株的雜交結(jié)果,均獲得了預(yù)期雜交帶。未轉(zhuǎn)基因的對照無任何條帶產(chǎn)生,說明載體c重組載體pBI121-LIF已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化入麻風(fēng)樹基因組DNA中。植株1產(chǎn)生了7條雜交帶,說明基因組中插入了多個拷貝,其中有2個條帶的長度明顯>3.6 kb,推測可能有完整的T-DNA拷貝插入;同時觀察到有4條雜交帶<3.6 kb,說明T-DNA有部分插入的拷貝存在,T-DNA的部分插入是轉(zhuǎn)基因過程中的常見現(xiàn)象。植株2、植株3均只有1條3.6 kb的雜交帶,說明轉(zhuǎn)化為單拷貝,T-DNA也是部分插入。不同數(shù)目的拷貝證明植株為獨立個體。

    3結(jié)論與討論

    植物分枝發(fā)育在植物形態(tài)建成中具有非常重要的地位,植物的分枝是控制作物結(jié)實并進而影響最終產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一,分枝多的植株結(jié)實部位多,但影響群體通風(fēng)透光狀況,分枝與主莖的夾角直接影響群體透光性和對光能的利用。然而,由于分枝的基因調(diào)控影響因素眾多,且機理復(fù)雜,因此目前僅處于探索階段。LIF基因由于發(fā)現(xiàn)時間較晚,其具體功能和作用機理仍未明確。目前只有1例進行LIF類鋅指蛋白的功能研究,即通過洋蔥表皮細胞的瞬時表達GFP-LIF-GUS蛋白的研究表明LIF基因被轉(zhuǎn)運到細胞核中,為證實LIF是1種轉(zhuǎn)錄因子提供了有力的證據(jù)[14]。本試驗采用pET32為表達載體,構(gòu)建了LIF基因原核表達載體,并將轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達獲得了重組蛋白,分析得出了LIF所對應(yīng)蛋白表達的最佳條件,為進一步探討LIF的功能奠定了基礎(chǔ)。

    麻風(fēng)樹作為一種能源植物,已經(jīng)引起了世界各國的高度關(guān)注。但由于其為木本植物,目前大部分的研究成果都集中在麻風(fēng)樹再生體系的研究上。本研究以麻風(fēng)樹為幼葉研究對象,通過摸索Kan濃度成功建立了高效穩(wěn)固的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。與前人的報道(針對麻風(fēng)樹子葉的轉(zhuǎn)化體系)相比,本體系不僅轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性強,而且在植物材料的選擇上更經(jīng)濟、節(jié)約,本轉(zhuǎn)化體系的成功建立為研究者大規(guī)模的開展麻風(fēng)樹各類基因的研究創(chuàng)造便利。在此基礎(chǔ)上,本研究將LIF基因順利轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組中,由于LIF基因能在雙子葉植物中保守表達,因此具有很強的應(yīng)用范圍。將LIF轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹中不僅有助于進一步了解LIF基因的作用原理和表達方式,還能為今后開展麻風(fēng)樹分枝的基因調(diào)控工作奠定堅實的基礎(chǔ)。在今后的研究中,將在田間持續(xù)觀察轉(zhuǎn)基因苗的分枝能力并計算種子產(chǎn)量。

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