Clin ProTool結(jié)合質(zhì)譜分析弓形蟲急性感染小鼠血清多肽

郝福星等

摘要：為分析血清差異表達多肽，并尋找具有潛在診斷意義的弓形蟲感染標志物，建立弓形蟲急性感染小鼠模型，采集急性感染組與健康對照組小鼠的血清，采用包被C8基團的磁珠純化試劑盒富集血清多肽，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF Mass Spectrometry）檢測，采用flexanalysis 2.0軟件、Clin ProTools軟件分析檢測圖譜并建立檢測模型。在m/z 800～12 000 區(qū)段，比較急性感染組、健康對照組的小鼠血清，共有8個峰存在顯著性差異，其中m/z 1 788.99、1 971.85、5 004.32、7 500.89、5 817.47區(qū)段的5個多肽峰的表達均顯著上調(diào)，而m/z 1 849.00、8 115.66、4 056.31區(qū)段的3個峰則顯著下調(diào)，應(yīng)用Clin ProTools建模方程建立感染小鼠的檢測模型。MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合Clin ProTools分析可建立弓形蟲感染檢測的新方法，為弓形蟲的診斷提供新思路。

關(guān)鍵詞：弓形蟲；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；磁珠富集

中圖分類號： S855.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0240-02

。弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會性致病原蟲，可導(dǎo)致嚴重的人獸共患寄生蟲病，可在人與牛、羊、豬、雞、貓等多種動物間傳播[1]，嚴重危害人類健康[2]與畜牧業(yè)發(fā)展[3]。部分豬場的流行病學(xué)調(diào)查顯示，弓形蟲感染率較高，最高達96%[3-4]，獸類、鳥類、靈長類等野生動物的弓形蟲抗體總陽性率為22.7%[4-5]，人類尤以孕婦的感染為主[6-7]，可見該病具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，該病的防控主要以控制傳染源、加強疾病診斷為主，尚無理想的藥物和疫苗[8-9]。該病在豬等家畜的發(fā)病率、病死率均很高，其常規(guī)診斷以實驗室檢查為主，包括病原學(xué)和血清學(xué)檢查[9]。病原學(xué)檢查主要以動物內(nèi)臟組織做涂片，或動物接種后檢查腹腔液蟲體，發(fā)現(xiàn)病原體后確診，此方法穩(wěn)定可靠，但費時費力且檢出率低。血清學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接血凝試驗（IHA）、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）、PCR檢測等，血清學(xué)方法操作簡便、快捷，但特異性和敏感性不高，且易產(chǎn)生假陽性[10]。該病的早期診斷對于畜牧生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟與社會意義；因此，在動物活體上建立快速、準確的弓形蟲感染檢測方法，是目前亟待解決的重要課題?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）結(jié)合Clin ProTool軟件分析是血清臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要分析技術(shù)之一[11]，具有高通量、高靈敏度、易操作等優(yōu)點，已被用于包括寄生蟲病等諸多疾病標志物的研究和臨床診斷[12]。本研究以試驗動物小鼠為模型，分析弓形蟲急性感染組、健康對照組小鼠血清多肽圖譜的差異，建立一種弓形蟲感染診斷的新方法，為家畜弓形蟲病的診斷及研究提供新的思路和應(yīng)用價值。

1材料與方法

1.1試驗動物與試劑

試驗動物為40只Balb/c小鼠，5～6周齡，雌雄各半，每只體質(zhì)量18～20 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心（編號：SYXK2007-0003）。將小鼠分為弓形蟲急性感染組、健康對照組，每組各20只。試驗弓形蟲蟲種為弓形蟲國際標準株（RH株），來自揚州大學(xué)寄生蟲教研室。

主要試劑：WB-C8磁珠純化試劑盒（Bruker Daltonics公司）；丙酮、甲醇、異丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等均為色譜純級；基質(zhì)：HCCA（α-氰-4-羥肉桂酸），300 mg/L，溶于乙醇-丙酮（2 ∶1），新鮮配制。

1.2方法

1.2.1弓形蟲感染小鼠模型的建立取弓形蟲國際標準株（RH株）感染72 h的小鼠腹水，用生理鹽水將純化的弓形蟲速殖子調(diào)整為濃度1×104個/mL的懸液。弓形蟲急性感染組每只小鼠腹腔注射懸液0.2 mL，健康對照組每只小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.2 mL。

1.2.2血清樣本采集感染后5 d于小鼠眼眶采血，每只采取全血0.5 mL，并立即置于4 ℃冰箱保存，30 min后以 12 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清并冷凍于-80 ℃冰箱待測。以同樣方法采集健康對照組小鼠血清。

1.2.3血清WCX磁珠處理根據(jù)試劑盒標準操作規(guī)程，將10 μL樣本結(jié)合液與10 μL C8磁珠試劑混合，輕輕混勻后，加入10 μL完全融解的血清樣本至200 μL PCR管，混勻并于室溫靜置5 min；將PCR管放入磁珠富集器（MBS），使磁珠貼壁并棄上清；利用沖洗液（WS，wash solution）將磁珠清洗3次，每次100 μL，最后棄上清；加入5 μL洗脫液（ES）與磁珠混勻，室溫靜置5 min后放入磁珠富集器，最后加5 μL穩(wěn)定液（SS）至離心管并混勻；將其取出1 μL與10 μL基質(zhì)完全混合，制成混懸液。

1.2.4點靶取1 μL混懸液點靶，室溫干燥后上機檢測。

1.2.5MALDI-TOF-MS檢測設(shè)置MALDI-TOF-MS儀器參數(shù)，利用flexcontrol軟件，選擇LP-Clinprot.pa方法，靶MTP_polished steel 384，激光能量40%左右，檢測分子量范圍為m/z 800～12 000。應(yīng)用flexanalysis軟件、Clin ProTools軟件對采集圖譜進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1血清多肽指紋圖譜（質(zhì)譜圖）分析

將健康對照組與弓形蟲急性感染時期的血清多肽質(zhì)譜圖進行比較及統(tǒng)計分析（表1），發(fā)現(xiàn)在m/z 800～12 000區(qū)段，與對照組相比，感染組小鼠m/z 1 788.99、1 971.85、5 004.32、7 500.89、5 817.47的5個多肽峰的表達均顯著或極顯著上調(diào)，而m/z 1 849.00、8 115.66、4 056.31的3個峰則顯著下調(diào)。

2.2Clin ProTools建模及驗證

利用Clin ProTools 2.0軟件，根據(jù)m/z 800～12 000區(qū)段內(nèi)8個差異表達峰建立弓形蟲急性感染的診斷模型，并運用該模型驗證急性感染組，結(jié)果顯示均為陽性，表明模型準確率達100%。

3結(jié)論與討論

作為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要感染性疾病，弓形蟲病逐漸受到獸醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)重視。作為一種人獸共患寄生蟲，弓形蟲可感染多種動物，貓感染后可傳染人，孕婦感染后可直接將弓形蟲傳給胎兒，造成胎兒先天性感染等嚴重后果[7，13]。弓形蟲幾乎能夠感染所有哺乳動物和鳥類，且感染率較高，易造成畜牧生產(chǎn)經(jīng)濟損失，阻礙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

常規(guī)的弓形蟲病診斷主要依靠病原學(xué)方法和血清學(xué)方法，但仍存在較多未解決的難題[14]。血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高通量、高敏感性、樣本需求少等優(yōu)點，自動化分析使其具有較好的重復(fù)性與應(yīng)用價值[15-16]。包被基團的磁珠可在特定窄譜的分子量范圍內(nèi)富集血清多肽和蛋白質(zhì)，本研究利用這一特性，考察弓形蟲感染后的小鼠血清多肽與蛋白的變化。與常規(guī)的二維電泳等方法相比，本方法具有更高的分辨率與敏感性，且樣本需求少，更適于獸醫(yī)臨床應(yīng)用。

研究結(jié)果表明，MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合Clin ProTools軟件分析，可根據(jù)質(zhì)荷比大小及表達量差異將小鼠血清多肽或蛋白直觀反映在質(zhì)譜峰上。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，共有8個峰存在顯著性差異，表明弓形蟲感染后小鼠血清多肽或蛋白發(fā)生改變，可能是蟲體在宿主體內(nèi)代謝產(chǎn)生，或機體免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的免疫球蛋白片段，其差異表達的蛋白質(zhì)多肽鑒定有待進一步研究。根據(jù)差異表達峰建立的診斷模型，對健康組、感染組的測試結(jié)果準確率均為100%，表明該方法可靠有效。

有報告顯示，弓形蟲感染小鼠后2～3 d即可在宿主體內(nèi)檢測到循環(huán)抗原[17]，而本試驗以感染后5 d的小鼠作為急性感染組，保證了組內(nèi)血清蛋白質(zhì)組改變的一致性，確保后續(xù)分析的準確性。利用小鼠作為模型動物，可在單一因素下開展弓形蟲感染的機理機制研究，其背景均一，試驗條件易于控制，對于獸醫(yī)臨床診斷具有較好的借鑒價值。本研究篩選了急性感染弓形蟲小鼠的血清多肽與蛋白質(zhì)，確定具有潛在診斷意義的多肽差異峰，建立的Clin ProTool模型為弓形蟲感染的血清學(xué)診斷提供新的檢測方法，也為弓形蟲新型藥物及疫苗的研究提供新的靶標和候選分子。

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