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    基于抗氧化活性的丹參藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

    2015-10-18 05:58:54趙榮華任小姍夏之寧
    中成藥 2015年3期
    關(guān)鍵詞:化學(xué)發(fā)光抗氧化劑清除率

    賈 巧, 陳 華, 趙榮華, 任小姍, 夏之寧

    (重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400044)

    基于抗氧化活性的丹參藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

    賈 巧, 陳 華*, 趙榮華, 任小姍, 夏之寧

    (重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400044)

    目的 提出從抗氧化能力評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的新觀點(diǎn)。方法 采用Luminol-Fe2+-H2O2流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系評(píng)價(jià)了3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力,以藥物對(duì)羥自由基的清除率對(duì)濃度作多項(xiàng)式四階擬合,由擬合方程計(jì)算出各自IC50值,以IC50值表示自由基清除能力,從而直接反應(yīng)8種丹參藥品的抗氧化能力。結(jié)果 該方法有較好的穩(wěn)定性和精密度,峰面積的RSD分別為2.3%和3.2%??寡趸瘑误w和丹參各種藥品都表現(xiàn)為低濃度下羥自由基清除率與濃度成正比,高濃度則不然。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單,高效,重復(fù)性好,穩(wěn)定性高。可推廣應(yīng)用于各抗氧化型藥物的質(zhì)量的實(shí)際療效的初步評(píng)價(jià)。

    抗氧化能力;質(zhì)量評(píng)價(jià);丹參藥品;羥自由基;化學(xué)發(fā)光

    氧自由基是生物體新陳代謝的中間產(chǎn)物[1],活性比分子態(tài)氧高很多[2]。正常情況下,體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的,但當(dāng)生物體長(zhǎng)期處于各種脅迫狀態(tài)下,氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障,體內(nèi)氧自由基代謝出現(xiàn)失衡[3],過多的活性氧可以引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)的損傷、嘌呤氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和突變[4]等,繼而引起細(xì)胞凋亡、組織壞死甚至機(jī)體死亡[5]。目前已證實(shí)與自由基相關(guān)的疾病有炎癥、心血管疾病、衰老[6]、帕金森氏病[7]、腫瘤、缺血性疾病、中毒和放射性疾?。?]等。

    丹參是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材,其治療心腦血管疾病的作用與其含抗氧化活性成分有關(guān),主要是通過清除已產(chǎn)生的自由基和阻斷自由基鏈反應(yīng)從而保護(hù)心臟免受傷害[9]。大量研究表明丹參在多方面具有較強(qiáng)的抗氧化活性,在治療活性氧誘發(fā)的心腦血管疾病方面具有顯著的療效[10]。

    傳統(tǒng)的藥物質(zhì)量的好壞是采用其中所含的某一種或某一類有效成分的多少進(jìn)行評(píng)價(jià)的[11],該方法的缺點(diǎn)是與藥物的實(shí)際治療效果脫節(jié)。藥物療效與藥效成分含有量固然有關(guān),但不一定是正相關(guān),含有量高不一定療效就好,有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)相反的情況。丹參藥物在治療心腦血管疾病,發(fā)揮療效的過程中受多方面因素的影響,最根本的因素還是與藥物本身清除致病因子或修復(fù)損傷的能力有關(guān)[12]。丹參藥物對(duì)氧自由基的清除能力能直接反應(yīng)對(duì)心腦血管疾病的治療效果。本實(shí)驗(yàn)欲從其抗氧化能力方面對(duì)系列丹參藥品的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),建立抗氧化型藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)的新方法和新思路。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司);KQ-100型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TGC-16B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DELTA 320 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

    1.2藥品與試劑 Luminol、兒茶素、丹參素鈉、綠原酸、楊梅素,均為Sigma公司產(chǎn)品(純度≧98%),無水乙醇、過氧化氫、FeSO4·7H2O、Na2CO3、NaHCO3均為國(guó)產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水都為去離子水。8種丹參藥品采購(gòu)自重慶市某藥店,廠家和生產(chǎn)批次信息列于表1。

    表1 丹參系列藥物信息

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件 光電倍增管負(fù)高壓600 V,增益為1,管路內(nèi)徑0.8 mm,主副泵轉(zhuǎn)速40 r/min相當(dāng)于2.27 mL/min的體積流量,采樣時(shí)間1 s。

    2.2溶液配制 0.025 mmol/L的Luminol用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液(pH 10.50)配制;0.048%的H2O2用去離子水配制;10 mmol/L Fe2+,加入少量鐵粉和稀硫酸,臨用時(shí)用去離子水稀釋到0.02 mmol/L。

    2.3樣品前處理 準(zhǔn)確稱取丹參藥品0.5 g,用50%乙醇溶解,超聲30 min后放置室溫后定容到50 mL量瓶。將樣品溶液在5 000 r/min下高速離心10min取上清液作樣品待測(cè)溶液。

    將藥物溶液稀釋成一系列濃度,分別測(cè)定其·OH清除率,把清除率對(duì)濃度作非線性回歸擬合,得到兩者的量效關(guān)系,求出當(dāng)清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度,即為各自的IC50值。IC50越小說明其抗氧化能力越強(qiáng)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法參數(shù)優(yōu)化

    3.1.1流路的選擇 考察了兩種流路對(duì)抗氧化劑抗氧化能力評(píng)價(jià)的影響(圖1)。流路A可從譜圖上直接反應(yīng)出抗氧化劑清除·OH的程度,但溶劑空白亦可使發(fā)光降低50%左右,會(huì)掩蓋抗氧化劑的信號(hào)峰,使抗氧化劑的自由基清除率為負(fù)值,表觀顯示為促氧化作用,與實(shí)際相矛盾。Katerina等[14]對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)研究,但未能解決溶劑倒峰的現(xiàn)象。流路B則可避免這種現(xiàn)象,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇流路B的混合模式。

    圖1 化學(xué)發(fā)光流路圖

    3.1.2Luminol濃度的選擇 用單因素變量法,考察了Luminol濃度在0.001~0.030 mmol/L之間對(duì)發(fā)光強(qiáng)度、峰形、峰面積的影響。結(jié)果顯示發(fā)光強(qiáng)度隨濃度的增大而增大,但噪聲亦同時(shí)增大,發(fā)光試劑殘留也增多,峰對(duì)稱性也變差。綜合考慮各種因素,最終確定Luminol濃度為0.025 mmol/L。

    3.1.3H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 同樣又考察了H2O2在0.030%~0.060%之間的發(fā)光情況。結(jié)果顯示隨H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,發(fā)光強(qiáng)度先增加后減小,在H2O2為0.048%時(shí)峰形好,峰面積最大,且噪聲也小。因此選擇H2O2的使用液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.048%。

    3.1.4Fe2+濃度的選擇 Fe2+是Fenten反應(yīng)中的催化劑,一般催化劑具有用量少,高效率的特點(diǎn)。但Fe2+在堿性條件下不能穩(wěn)定存在,容易被水中溶解氧化生成氫氧化鐵紅色沉淀,附著在管道內(nèi)壁,堵塞管道。因而鐵濃度不能過高??疾炝藵舛仍?.020~0.100 mmol/L之間的Fe2+對(duì)發(fā)光情況的影響。結(jié)果顯示Fe2+濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度影響很小,因此本實(shí)驗(yàn)選用0.02 mmol/L Fe2+作為使用液。

    3.1.5pH的選擇 Luminol須在堿性條件下發(fā)光,但Fe2+在堿性條件下不穩(wěn)定,因此考察了不同pH緩沖溶液的發(fā)光情況。結(jié)果發(fā)光強(qiáng)度隨著pH的增大先增大后減小。在pH為10.50時(shí)達(dá)到最大值,故本實(shí)驗(yàn)選用緩沖溶液pH 10.50。

    3.1.6體積流量的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了泵轉(zhuǎn)速在10~70 r/min相當(dāng)于體積流量0.57~3.99 mL/min下的化學(xué)發(fā)光情況。結(jié)果顯示:低體積流量時(shí)由于縱向擴(kuò)散導(dǎo)致峰展寬。高體積流量下反應(yīng)量加大,峰高增高,峰形變好,如圖2。但反應(yīng)體系流過檢測(cè)窗口的速度過快,反應(yīng)不充分,在發(fā)光強(qiáng)度還未達(dá)到峰值時(shí),液流已經(jīng)流過檢測(cè)窗,因而峰寬變窄,峰面積減小。綜合考慮峰形、峰寬、峰面積,本實(shí)驗(yàn)選擇主副泵同步轉(zhuǎn)速40 r/min,體積流量為2.28 mL/min。

    圖2 不同體積流量的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

    3.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 在選定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件和最佳儀器參數(shù)后對(duì)發(fā)光體系的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。每隔2 h測(cè)定1次,共測(cè)定1 d內(nèi)5個(gè)時(shí)間段內(nèi)的空白發(fā)光強(qiáng)度,每次平行測(cè)5次。計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,峰高的RSD為1.5%,峰面積的RSD為2.3%,結(jié)果表明在1 d內(nèi)該發(fā)光體系穩(wěn)定。為了考察所建立體系的重復(fù)性,重復(fù)11次測(cè)定空白發(fā)光強(qiáng)度,計(jì)算其峰高、峰面積的RSD分別為3.4%和3.2%。結(jié)果表明測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性良好。

    3.2抗氧化劑單體的抗氧化能力評(píng)價(jià) 為考察方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,實(shí)驗(yàn)選擇了丹參素鈉、兒茶素、綠原酸3種抗氧化劑單體的不同質(zhì)量濃度對(duì)·OH的清除作用,以清除率y對(duì)質(zhì)量濃度x作多項(xiàng)式4階擬合,結(jié)果如表2所示。

    表2 抗氧化劑單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

    結(jié)果表明,抗氧化劑的抗氧化能力與其含有量并非呈正比。根據(jù)擬合曲線,計(jì)算獲得了各自的IC50值,IC50值越小表示其抗氧化能力越強(qiáng),3種抗氧化劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素>丹參素鈉>綠原酸。酚類化合物抗氧化活性大小通常與分子中羥基的個(gè)數(shù)和位置相關(guān)。尤其是苯環(huán)上的羥基,由于氧的電子與芳香環(huán)電子共軛的影響,對(duì)氫離子的束縛能力減弱,相對(duì)容易給出氫離子自身被氧化成醌而具有較強(qiáng)的還原性,而脂肪鏈上的羥基則被氧化為醛、酮或羧酸。此外,分子內(nèi)氫鍵越多,抗氧化活性越強(qiáng)[15],試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與理論相吻合,說明該方法測(cè)定結(jié)果可靠,可應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

    3.3丹參藥品的抗氧化能力評(píng)價(jià)

    3.3.1樣品清除率比較 分別取各樣品溶液用50%乙醇稀釋50倍后成200 mg/L的質(zhì)量濃度,以50%乙醇做空白對(duì)照,按照“3.1”項(xiàng)所示的方法測(cè)定清除率。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

    表3 高質(zhì)量濃度(200 mg/L)下各丹參藥品的自由基清除率比較(%)

    從表3可以看出8種丹參藥物在質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)都具有較高的羥自由基清除率,其中6#樣品清除率達(dá)到99%,其清除率大小依次為6#>7#>3#>8#>1#>2#>4#>5#。

    3.3.2樣品IC50比較 根據(jù)藥物清除率能力差異選擇不同質(zhì)量濃度范圍對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,測(cè)定各自清除率,清除率對(duì)質(zhì)量濃度的擬合方程如表4所示。計(jì)算各自IC50值亦如表4所示,IC50大小依次為3#<6#<1#<2#<7#<8#<4#<5#,即抗氧化能力順序?yàn)?#>6#>1#>2#>7#>8#>4#>5#。

    表4 丹參藥物清除率y-質(zhì)量濃度x曲線擬合和IC50值

    樣品的清除率排序與抗氧化能力排序差別的原因正是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度下抗氧化劑抗氧化能力與質(zhì)量濃度之間不呈正比關(guān)系。而對(duì)于一個(gè)確定的體系而言,IC50值是一個(gè)定值,與抗氧化劑的質(zhì)量濃度無關(guān)。因此建議此類型實(shí)驗(yàn)都采用IC50值來表示抗氧化能力大小。

    4 結(jié)論

    建立了評(píng)價(jià)丹參藥品抗氧化能力的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法,對(duì)該發(fā)光體系進(jìn)行各種參數(shù)優(yōu)化,考察了方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。該方法簡(jiǎn)單、高效、快速、精密度高、穩(wěn)定性好。將該方法應(yīng)用于3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力評(píng)價(jià),結(jié)果表明低質(zhì)量濃度下抗氧化劑的自由基清除率與質(zhì)量濃度成正比,高質(zhì)量濃度則不然。把清除率對(duì)質(zhì)量濃度作多項(xiàng)式4階擬合時(shí),曲線擬合度良好。3種抗氧劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素>丹參素鈉>綠原酸。8種丹參藥物的抗氧化能力大小依次為3#>6#>1#>2#>7#>8#>4#>5#。

    化學(xué)發(fā)光法最大優(yōu)點(diǎn)是不需要光源,操作成本低,適合于抗氧化型藥物的抗氧化能力效果的總體評(píng)價(jià)。

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    R285.5

    B

    1001-1528(2015)03-0667-04

    10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.048

    2014-01-09

    國(guó)家自然科學(xué)基金(21005092);科技部國(guó)際合作計(jì)劃項(xiàng)目(2010DFA32680)

    賈 巧(1988—),女,碩士,從事天然產(chǎn)物活性成分篩選。Tel:18227678557,E-mail:missjia880519@163.com

    陳 華 Tel:(023)65106615,E-mail:chenhuacqu@aliyun.com

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