周亞菁, 查日維, 謝曉梅, 張 靜, 王 鍵
(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),安徽 合肥 230012)
宣木瓜總有機(jī)酸的提取和純化工藝優(yōu)化
周亞菁, 查日維, 謝曉梅*, 張 靜, 王 鍵
(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),安徽合肥230012)
目的 建立提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸的最佳工藝。方法 以可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo),運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化宣木瓜總有機(jī)酸提取工藝;通過(guò)單因素試驗(yàn),考察上樣溶液質(zhì)量濃度、pH、HCl洗脫液濃度和體積流量對(duì)強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂純化總有機(jī)酸的影響。結(jié)果 最佳提取工藝是料液比1∶8,75%乙醇,提取時(shí)間2 h,提取次數(shù)2次;最佳純化工藝是上樣溶液質(zhì)量濃度1 g/mL,樣品液pH為10,HCl洗脫液濃度為0.3 mol/L,體積流量為3 mL/min。此工藝下所得宣木瓜總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)67.66%。結(jié)論 本方法可有效提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸,工藝穩(wěn)定、可行,易于實(shí)施,。
宣木瓜;總有機(jī)酸;回流提??;陰離子交換
木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果實(shí),宣木瓜是藥用木瓜的道地藥材[1]。木瓜藥材的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)是“味酸者為佳”[2],《中國(guó)藥典》規(guī)定木瓜水提液的pH應(yīng)在3.0~4.0[3],可見(jiàn)酸性是構(gòu)成木瓜藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。中藥有機(jī)酸藥理作用廣泛[4],已有研究表明總有機(jī)酸是宣木瓜鎮(zhèn)痛抗炎作用的有效組分之一[5]。木瓜有機(jī)酸組成復(fù)雜,既有極性強(qiáng)的水溶性有機(jī)酸(如蘋(píng)果酸、檸檬酸等[6]),也有極性弱的水不溶性有機(jī)酸(如齊墩果酸、熊果酸等三萜酸[7]),還有極性介于其間的酚酸(如綠原酸、咖啡酸等[8])。關(guān)于宣木瓜有機(jī)酸提取純化工藝鮮見(jiàn)研究報(bào)道。鑒于木瓜有機(jī)酸極性分布寬的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)采用含水乙醇提取制備宣木瓜總有機(jī)酸粗提物,再利用717型強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂純化總有機(jī)酸;以可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo),建立提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸的最佳工藝,旨在為宣木瓜總有機(jī)酸制備及開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。
宣木瓜藥材收集于安徽宣城(2012年10月),經(jīng)安徽省宣州市金泉生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司姚勇高級(jí)工程師鑒定為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的近成熟果實(shí),粉碎(過(guò)40目篩)備用。717型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),所用試劑均為分析純,水為超純水。
BP211D電子天平(十萬(wàn)分之一,德國(guó)賽多利斯公司);pHS-3CA精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司);MiLLi-QAdvantage超純水機(jī)(美國(guó)MiLLipore公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。
2.1總有機(jī)酸的測(cè)定 采用電位滴定法測(cè)定總有機(jī)酸。取宣木瓜藥材提取或純化樣品適量,加水溶解、定容,精取15mL,按電位滴定法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅧA),用已標(biāo)定的0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,用Origin 6.0 Professional繪制滴定曲線(見(jiàn)圖1),二級(jí)微商內(nèi)插法確定滴定終點(diǎn),以蘋(píng)果酸(C4H6O5)計(jì)算總有機(jī)酸含有量。
2.2總有機(jī)酸提取工藝優(yōu)化 在前期提取方法比較試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用回流提取法[9]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)4個(gè)因素進(jìn)行考察,各因素均確定為三個(gè)水平,依據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)法,以總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo),確立最佳提取工藝。提取操作為:精密稱(chēng)取宣木瓜樣品10 g置圓底燒瓶中,加適量溶劑回流提取,濾過(guò),濾液濃縮,真空干燥,得總有機(jī)酸提取物;取提取物適量,按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因素水平見(jiàn)表1,正交試驗(yàn)方案和結(jié)果、方差分析見(jiàn)表2、表3。
表3表明F值均小于F臨界值,即各因素對(duì)提取的影響無(wú)顯著性差異,所以采用直觀分析。表2中極差(R)結(jié)果表明,料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)4個(gè)因素對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸提取含有量的影響為:D>C>B>A,總有機(jī)酸提取的最佳工藝組合為A1B2C2D2,即料液比1∶8,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,提取時(shí)間2h,提取次數(shù)2次。
圖1 總有機(jī)酸提取純化產(chǎn)品的滴定曲線(A)和二級(jí)微商曲線(B)
2.3總有機(jī)酸提取工藝驗(yàn)證 稱(chēng)取宣木瓜藥材150 g,按“2.2”項(xiàng)下的提取操作及優(yōu)選工藝參數(shù),平行操作3份,提取物按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定,可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.20%,34.08%,33.47%,結(jié)果表明總有機(jī)酸提取工藝穩(wěn)定、可行。
表1 因素水平
表2 宣木瓜總有機(jī)酸提取正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 方差分析
2.4總有機(jī)酸純化工藝優(yōu)化
2.4.1樹(shù)脂的預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[10],取717型強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂適量,置3 000 mL燒杯中,用水洗至水相澄清,水浸泡24 h使其充分膨脹,傾去水層;用樹(shù)脂體積2倍量的1 mol/LNaOH溶液浸泡4 h;再用水洗至中性;然后用1 mol/L HCl溶液浸泡4 h,再用水洗至中性,最后再用1 mol/L NaOH溶液浸泡8 h,水洗至中性,備用。
2.4.2上樣溶液的制備 取“2.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝所得提取物適量,加水溶解分散,1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH,靜置一夜,超聲30 min,離心30 min(2 000 r/min),取上清液濃縮制得上樣溶液,備用。
2.4.3吸附泄漏試驗(yàn) 將預(yù)處理好的樹(shù)脂裝入層析柱中(2 cm×10 cm),柱床體積為10 mL,精密量取“2.4.2”項(xiàng)下上樣溶液50 mL,控制體積流量1.0 mL/min通過(guò)層析柱,每5 m L為1管,以流出液pH為縱坐標(biāo),洗脫液體積為橫坐標(biāo),繪制吸附泄漏曲線[11]。吸附泄漏曲線見(jiàn)圖2。當(dāng)收集到第5管時(shí),溶液pH與原上樣溶液接近,說(shuō)明此時(shí)樹(shù)脂柱達(dá)到吸附飽和,即當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時(shí),717型陰離子交換樹(shù)脂對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸吸附的泄露點(diǎn)為2.5 BV左右,此時(shí)樹(shù)脂吸附達(dá)到最佳。
圖2 717型陰離子交換樹(shù)脂吸附總有機(jī)酸的泄漏曲線
2.4.4上樣液質(zhì)量濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/mL的上樣溶液,取10 mL經(jīng)處理過(guò)的樹(shù)脂,濕法裝柱,上樣體積流量為1 mL/min,吸附飽和后用去離子水沖洗,鹽酸洗脫,收集洗脫液,水飽和正丁醇等體積萃取,直至正丁醇層無(wú)有機(jī)酸反應(yīng),合并萃取相,減壓濃縮、干燥,即得純化的總有機(jī)酸。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表4。
2.4.5洗脫劑濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗,再分別以0.3、0.5、1.0 mol/L的HCl洗脫,收集洗脫液,按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。
2.4.6洗脫體積流量的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗,再分別用鹽酸以0.5、1.0、3.0 mL/min的體積流量洗脫,收集洗脫液,按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。
2.4.7上樣液pH的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL pH為9、10、11的上樣液依法上樣、水洗,洗脫,收集洗脫液,按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 宣木瓜有機(jī)酸純化工藝影響因素的考察結(jié)果
由表4可知,宣木瓜總有機(jī)酸的最佳純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、上樣液pH為10、HCl洗脫劑濃度0.3 mol/L、洗脫體積流量為3 mL/min。
2.5總有機(jī)酸純化工藝驗(yàn)證 稱(chēng)取宣木瓜醇提物2.6 g,按“2.4”項(xiàng)下的純化操作及優(yōu)選工藝參數(shù),平行操作3份,純化物按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定,可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為69.79%、66.53%、66.66%,表明717型陰離子交換樹(shù)脂純化宣木瓜總有機(jī)酸工藝穩(wěn)定、可行。
3.1宣木瓜所含有機(jī)酸種類(lèi)豐富,pKa值多在3~5左右,滴定曲線表現(xiàn)出明顯的滴定突躍;因?yàn)闃悠啡芤侯伾珪?huì)干擾指示劑的終點(diǎn)判斷,故采用了電位滴定法。
3.2本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)的正交試驗(yàn),優(yōu)選出總有機(jī)酸提取工藝,通過(guò)測(cè)定原料總有機(jī)酸,表明提取物總有機(jī)酸轉(zhuǎn)移率可達(dá)75%以上。
3.3在離子交換樹(shù)脂純化有機(jī)酸的實(shí)驗(yàn)中,考察了上樣液質(zhì)量濃度、洗脫劑濃度、洗脫體積流量及上樣液pH對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸動(dòng)態(tài)吸附的影響,發(fā)現(xiàn)上樣液pH對(duì)純化物總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大影響,提高pH有利于有機(jī)酸解離,便于與樹(shù)脂的陰離子發(fā)生交換,從而得到高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。選擇HCl作為洗脫劑,不僅有利于酸性AgNO3試液判斷洗脫終點(diǎn)[12],而且在酸性條件下,結(jié)合在離子交換樹(shù)脂上的有機(jī)酸根離子會(huì)轉(zhuǎn)化為游離有機(jī)酸,利于洗脫。經(jīng)過(guò)離子交換工藝后,宣木瓜中總有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由提取物中的33.58%提高到67.66%,取得了較好的純化富集效果。
3.4本實(shí)驗(yàn)還考察了醇提物堿化除雜、酸化后有機(jī)溶劑萃取宣木瓜總有機(jī)酸,所得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于上述結(jié)果;故選用本法提取純化宣木瓜中總有機(jī)酸有效可行,且易于實(shí)施。
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R284.2
B
1001-1528(2015)03-0664-03
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.047
2014-05-10
十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI04B06);安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2012A188)
周亞菁(1990—),女,碩士生,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析。Tel:(0551)68129153,E-mail:513729364@qq.com
謝曉梅,女,教授,碩士生導(dǎo)師。Tel:(0551)68129153,E-mail:xiexiaomei9401@sina.com