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    復(fù)方真元顆粒的提取工藝研究

    2015-10-18 05:58:52張曉杭李偉鋒蔣建蘭
    中成藥 2015年3期
    關(guān)鍵詞:星點(diǎn)甘草酸甘草

    李 妍, 袁 樂(lè), 張曉杭, 曹 頌, 李偉鋒, 蔣建蘭*

    (1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系,天津 300072;2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院,天津 300193)

    復(fù)方真元顆粒的提取工藝研究

    李 妍1, 袁 樂(lè)2, 張曉杭1, 曹 頌1, 李偉鋒1, 蔣建蘭1*

    (1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系,天津300072;2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院,天津300193)

    目的 研究及優(yōu)化復(fù)方真元顆粒的兩次提取工藝。方法 以液固比和提取時(shí)間為自變量,以干膏率、甘草苷含有量、甘草酸含有量的綜合指標(biāo)作為因變量,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,優(yōu)選兩次提取工藝并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

    中藥復(fù)方真元顆粒;星點(diǎn)設(shè)計(jì);干膏率;甘草苷;甘草酸

    復(fù)方真元顆粒是天津安仁中醫(yī)院根據(jù)20余年臨床經(jīng)驗(yàn),切合腫瘤發(fā)病陰陽(yáng)失衡、真元受損和氣虛血瘀為證候核心的基礎(chǔ)上,依據(jù)甘附湯增擴(kuò)的有效驗(yàn)方。方中由熟附子(黑順片)、當(dāng)歸、甘草等9味中藥組成,具有散壯火、強(qiáng)少火、平陰陽(yáng)、清熱解毒之功效,臨床主要用于腫瘤的輔助治療,改善腫瘤患者體質(zhì),提高機(jī)體免疫和生存質(zhì)量,延長(zhǎng)患者壽命。但傳統(tǒng)湯劑有諸多缺點(diǎn),為使其攜帶和服用方便且能達(dá)到相同的藥效,首次將其開(kāi)發(fā)成為安全有效、質(zhì)量可控的顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方中每味藥材的化學(xué)成分和理化性質(zhì),結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)特點(diǎn),采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法[1-3],以干浸膏得率及甘草苷和甘草酸的含有量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo),優(yōu)選該制劑的提取工藝。

    1 材料

    1.1試藥 甘草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)111610-201106);甘草酸銨對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110731-201116);乙腈、冰醋酸為色譜純;無(wú)水乙醇為分析純。

    1.2儀器 Lab Alliance高效液相色譜儀(二元高壓梯度泵SeriesⅢ、自動(dòng)進(jìn)樣器As3000、二極管陣列檢測(cè)器UV6000LP、柱溫箱OV2001);AL2004電子分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司);Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司);N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);PTHW型普通恒溫電熱套(上海勒頓實(shí)業(yè)有限公司);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);AS-20500BT超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1甘草苷和甘草酸的測(cè)定

    2.1.1色譜條件 Apollo C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-1%醋酸水溶液(B),梯度洗脫(0~8 min,19%A;8~20 min,19%A→33%A;20~25 min,33%A→50%A;25~30 min,50%A→100% A;30~35 min,100%A→19%A;35~40 min,19%A);檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。

    2.1.2對(duì)照品溶液的制備 (1)精密稱取甘草苷對(duì)照品適量,加70%乙醇溶液制成每1 mL含100μg甘草苷的對(duì)照品溶液。(2)精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量加70%乙醇溶液制成每1 mL含208μg甘草酸銨的對(duì)照品溶液(甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7)。

    2.1.3干浸膏的制備 按照處方比例稱取藥材,加水煎煮得第1次提取液,濾過(guò),濃縮,冷凍干燥,備用;第1次煎煮所得濾渣加水煎煮得第2次提取液,濾過(guò),濃縮,冷凍干燥,備用。

    2.1.4供試品溶液的制備 精密稱取干膏0.075 0 g置于5 mL量瓶中,70%乙醇定容,于40℃下超聲混勻40 min,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為甘草苷和甘草酸的供試品溶液。

    2.1.5陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備缺甘草的陰性對(duì)照溶液。

    2.1.6專屬性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別測(cè)定對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液,結(jié)果見(jiàn)圖1。

    2.1.7線性范圍考察 精密稱取5份質(zhì)量成倍數(shù)的干膏,依照“2.1.4”項(xiàng)下方法,制備供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。以供試品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得回歸方程為Y甘草苷= 8×108X+483 531(r=0.998 1),Y甘草酸=9×107X+36 992(r=0.999 3),試驗(yàn)結(jié)果表明甘草苷質(zhì)量濃度在16.42~169.9μg/mL,甘草酸質(zhì)量濃度在0.344~3.562μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

    圖1 干浸膏中成分測(cè)定HPLC圖譜

    2.1.8精密度試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,甘草苷和甘草酸峰面積的RSD值分別為1.3%和2.4%,表明精密度良好。

    2.1.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為1.3%和1.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.10重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.4”項(xiàng)下方法重復(fù)制備供試品溶液6份,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.9%和1.2%,表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

    2.1.11加樣回收率試驗(yàn) 取相當(dāng)于干浸膏0.037 5 g的供試品細(xì)粉,平行稱定9份,分別置于5 mL量瓶中,按樣品中成分含有量80%、100%、120%的比例加入甘草苷和甘草酸對(duì)照品各3份,依照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,由回歸方程計(jì)算甘草苷和甘草酸量和回收率,甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為97.1%和102.6%,RSD值分別為1.9%和2.1%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

    2.1.12樣品測(cè)定 取干膏適量,平行取樣兩份,按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定,以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算干膏中甘草苷、甘草酸的量,與原藥材的比值即為含量。

    2.2干膏率的測(cè)定 精密稱定一定量的浸膏,冷凍干燥36 h至恒定質(zhì)量[4],置于干燥器中30 min恢復(fù)至室溫,迅速精密稱定質(zhì)量,按照下式計(jì)算干膏率:

    2.3提取工藝優(yōu)選

    2.3.1因素及水平考察 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理、預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),結(jié)合本處方藥材的特性,采取水煎提取法,提取次數(shù)為兩次,每次的考察因素分別為提取時(shí)間和液固比。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理,每因素設(shè)五水平,用代碼值-α,-1,0,1,α表示,分析因素及水平見(jiàn)表1和表2。

    表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)第1次提取的因素與水平

    表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)第2次提取的因素與水平

    2.3.2響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)法則,按照“2.1.3”項(xiàng)下干浸膏制備工藝,每次試驗(yàn)平行兩份,第1、2次提取試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3和4。為將所有指標(biāo)綜合為一個(gè)能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值,數(shù)據(jù)處理采用綜合指標(biāo)(overall desirability,OD)進(jìn)行直觀分析和方差分析。各指標(biāo)綜合評(píng)分方程:di=Yi/Ai(di為各指標(biāo)的評(píng)分值,Yi為各指標(biāo)的實(shí)測(cè)值,Ai為各指標(biāo)中相應(yīng)最大值),以干膏率作為篩選的主要指標(biāo),規(guī)定其權(quán)重系數(shù)為0.6,甘草苷和甘草酸的含有量規(guī)定其權(quán)重系數(shù)分別為0.2、0.2[5-7]。

    每次試驗(yàn)各指標(biāo)綜合評(píng)分方程:

    表3 第1次提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)

    表4 第2次提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)

    2.3.3數(shù)學(xué)模型擬合及方差分析 以O(shè)D值為因變量,使用Desgin Expert8.0.6對(duì)兩次提取各因素進(jìn)行二次式擬合,Y1、Y2分別為第1、2次提取的擬合方程:

    Y1=-206.039 21+35.319 63 A+49.389 07B+ 0.634 54AB-18.229 03A2-2.180 85B2;Y2=-78.572 22-6.823 63A+37.393 73B+5.680 00AB-25.596 00 A2-2.247 25B2;對(duì)擬合的方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表5和6。

    表5 第1次提取的方差分析

    表6 第2次提取的方差分析

    由方差分析可知,兩次回歸方程的P<0.05,失擬性檢驗(yàn)P>0.05,相關(guān)系數(shù)r1=0.809 3,r2=0.851 4,說(shuō)明方程擬合度良好,該模型準(zhǔn)確度較好,可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    2.3.4工藝條件優(yōu)化及預(yù)測(cè) 根據(jù)回歸方程,作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖,見(jiàn)圖2和圖3。結(jié)果表明,兩次提取的OD值分別在12倍、1 h和10倍、1 h左右達(dá)到最大。結(jié)合已建立的數(shù)學(xué)模型,得到一、二最佳的提取時(shí)間和液固比分別是1.09 h、11.41倍;0.91 h、9.40倍。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn),確定兩次提取工藝參數(shù)分別為1 h、12倍和1 h、10倍。

    圖2 第1次提取的提取時(shí)間、液固比及其相互作用對(duì)提取工藝的影響

    圖3 第2次提取的提取時(shí)間、液固比及其相互作用對(duì)提取工藝的影響

    2.4工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 依照最佳工藝條件對(duì)第1、2次提取進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果分別為:第1次提取干膏率27.72%,甘草苷1.29 mg/g,甘草酸2.69 mg/g,實(shí)際總OD值為94.60,與預(yù)測(cè)值97.29偏差-2.76%;第2次提取干膏率7.65%,甘草苷0.42 mg/g,甘草酸1.08 mg/g,實(shí)際總OD值為93.79,與預(yù)測(cè)值95.02偏差-1.29%,說(shuō)明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性,可用于該復(fù)方提取工藝的優(yōu)化。

    3 討論

    3.1抗腫瘤中藥真元顆粒原湯劑具有良好的臨床效果,熟附子味辛甘,性大熱,為補(bǔ)助元陽(yáng)之主藥,有回陽(yáng)救逆、逐寒燥濕、溫助腎陽(yáng)之功,為君藥[8];當(dāng)歸補(bǔ)血活血,為臣藥;甘草補(bǔ)中益氣,緩急解毒,調(diào)和諸藥,解附子之毒為佐藥等[9]?,F(xiàn)代研究表明,附子多糖、當(dāng)歸多糖、甘草多糖等各味藥材水溶性多糖均有不同程度的抗腫瘤功效[10-12],故采用水煎提取工藝。

    3.2本方中熟附子雖為君藥,但因其活性成分含有量較少,定量測(cè)定方法復(fù)雜,故采用測(cè)定方法較為成熟的有效成分甘草苷、甘草酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo),另由于復(fù)方成分復(fù)雜,有效成分較多,故亦結(jié)合干膏率三者共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用OD值對(duì)指標(biāo)進(jìn)行處理,三者權(quán)重分別為0.2、0.2、0.6,較為合理。但由于本方藥味較多,試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)僅為三項(xiàng),并未結(jié)合相關(guān)藥效學(xué)研究,因此還需進(jìn)一步完善。

    3.3星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和結(jié)果表達(dá)方面較正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法更加優(yōu)良,適宜進(jìn)行非線性模型擬合,可提高優(yōu)化預(yù)測(cè)的精確性,更好地體現(xiàn)各因素、指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系[13-14]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化兩次提取工藝,得到最佳條件,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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    R284.2

    B

    1001-1528(2015)03-0660-04

    10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.046

    2014-01-04

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102900)

    李 妍(1989—),女,碩士生,從事中藥制劑工藝研究。Tel:18222289215,E-mail:lxxxyyyl@163.com

    蔣建蘭(1972—),女,博士,副教授,從事中藥現(xiàn)代化研究。Tel:(022)27400388,E-mail:jljiang@tju.edu.cn

    結(jié)果 結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定第1次最佳提取工藝為12倍量水煎煮1 h,第2次最佳提取工藝為10倍量水煎煮1 h。結(jié)論優(yōu)化的最佳提取工藝合理可行,適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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