復(fù)方真元顆粒的提取工藝研究

李 妍， 袁 樂(lè)， 張曉杭， 曹 頌， 李偉鋒， 蔣建蘭*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津　300072；2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院，天津　300193）

復(fù)方真元顆粒的提取工藝研究

李 妍1， 袁 樂(lè)2， 張曉杭1， 曹 頌1， 李偉鋒1， 蔣建蘭1*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津300072；2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院，天津300193）

目的 研究及優(yōu)化復(fù)方真元顆粒的兩次提取工藝。方法 以液固比和提取時(shí)間為自變量，以干膏率、甘草苷含有量、甘草酸含有量的綜合指標(biāo)作為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)選兩次提取工藝并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

中藥復(fù)方真元顆粒；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；干膏率；甘草苷；甘草酸

復(fù)方真元顆粒是天津安仁中醫(yī)院根據(jù)20余年臨床經(jīng)驗(yàn)，切合腫瘤發(fā)病陰陽(yáng)失衡、真元受損和氣虛血瘀為證候核心的基礎(chǔ)上，依據(jù)甘附湯增擴(kuò)的有效驗(yàn)方。方中由熟附子（黑順片）、當(dāng)歸、甘草等9味中藥組成，具有散壯火、強(qiáng)少火、平陰陽(yáng)、清熱解毒之功效，臨床主要用于腫瘤的輔助治療，改善腫瘤患者體質(zhì)，提高機(jī)體免疫和生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者壽命。但傳統(tǒng)湯劑有諸多缺點(diǎn)，為使其攜帶和服用方便且能達(dá)到相同的藥效，首次將其開(kāi)發(fā)成為安全有效、質(zhì)量可控的顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方中每味藥材的化學(xué)成分和理化性質(zhì)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)特點(diǎn)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法［1-3］，以干浸膏得率及甘草苷和甘草酸的含有量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，優(yōu)選該制劑的提取工藝。

1　材料

1.1試藥 甘草苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111610-201106）；甘草酸銨對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110731-201116）；乙腈、冰醋酸為色譜純；無(wú)水乙醇為分析純。

1.2儀器 Lab Alliance高效液相色譜儀（二元高壓梯度泵SeriesⅢ、自動(dòng)進(jìn)樣器As3000、二極管陣列檢測(cè)器UV6000LP、柱溫箱OV2001）；AL2004電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；PTHW型普通恒溫電熱套（上海勒頓實(shí)業(yè)有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AS-20500BT超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1甘草苷和甘草酸的測(cè)定

2.1.1色譜條件 Apollo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～20 min，19%A→33%A；20～25 min，33%A→50%A；25～30 min，50%A→100% A；30～35 min，100%A→19%A；35～40 min，19%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 （1）精密稱取甘草苷對(duì)照品適量，加70%乙醇溶液制成每1 mL含100μg甘草苷的對(duì)照品溶液。（2）精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量加70%乙醇溶液制成每1 mL含208μg甘草酸銨的對(duì)照品溶液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7）。

2.1.3干浸膏的制備 按照處方比例稱取藥材，加水煎煮得第1次提取液，濾過(guò)，濃縮，冷凍干燥，備用；第1次煎煮所得濾渣加水煎煮得第2次提取液，濾過(guò)，濃縮，冷凍干燥，備用。

2.1.4供試品溶液的制備 精密稱取干膏0.075 0 g置于5 mL量瓶中，70%乙醇定容，于40℃下超聲混勻40 min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為甘草苷和甘草酸的供試品溶液。

2.1.5陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備缺甘草的陰性對(duì)照溶液。

2.1.6專屬性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.7線性范圍考察 精密稱取5份質(zhì)量成倍數(shù)的干膏，依照“2.1.4”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以供試品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y甘草苷= 8×108X+483 531（r=0.998 1），Y甘草酸=9×107X+36 992（r=0.999 3），試驗(yàn)結(jié)果表明甘草苷質(zhì)量濃度在16.42～169.9μg/mL，甘草酸質(zhì)量濃度在0.344～3.562μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1　干浸膏中成分測(cè)定HPLC圖譜

2.1.8精密度試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD值分別為1.3%和2.4%，表明精密度良好。

2.1.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為1.3%和1.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.4”項(xiàng)下方法重復(fù)制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.9%和1.2%，表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.11加樣回收率試驗(yàn) 取相當(dāng)于干浸膏0.037 5 g的供試品細(xì)粉，平行稱定9份，分別置于5 mL量瓶中，按樣品中成分含有量80%、100%、120%的比例加入甘草苷和甘草酸對(duì)照品各3份，依照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，由回歸方程計(jì)算甘草苷和甘草酸量和回收率，甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為97.1%和102.6%，RSD值分別為1.9%和2.1%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.12樣品測(cè)定 取干膏適量，平行取樣兩份，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算干膏中甘草苷、甘草酸的量，與原藥材的比值即為含量。

2.2干膏率的測(cè)定 精密稱定一定量的浸膏，冷凍干燥36 h至恒定質(zhì)量［4］，置于干燥器中30 min恢復(fù)至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量，按照下式計(jì)算干膏率：

2.3提取工藝優(yōu)選

2.3.1因素及水平考察 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理、預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合本處方藥材的特性，采取水煎提取法，提取次數(shù)為兩次，每次的考察因素分別為提取時(shí)間和液固比。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每因素設(shè)五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，分析因素及水平見(jiàn)表1和表2。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)第1次提取的因素與水平

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)第2次提取的因素與水平

2.3.2響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)法則，按照“2.1.3”項(xiàng)下干浸膏制備工藝，每次試驗(yàn)平行兩份，第1、2次提取試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3和4。為將所有指標(biāo)綜合為一個(gè)能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值，數(shù)據(jù)處理采用綜合指標(biāo)（overall desirability，OD）進(jìn)行直觀分析和方差分析。各指標(biāo)綜合評(píng)分方程：di=Yi/Ai（di為各指標(biāo)的評(píng)分值，Yi為各指標(biāo)的實(shí)測(cè)值，Ai為各指標(biāo)中相應(yīng)最大值），以干膏率作為篩選的主要指標(biāo)，規(guī)定其權(quán)重系數(shù)為0.6，甘草苷和甘草酸的含有量規(guī)定其權(quán)重系數(shù)分別為0.2、0.2［5-7］。

每次試驗(yàn)各指標(biāo)綜合評(píng)分方程：

表3　第1次提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表4　第2次提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3.3數(shù)學(xué)模型擬合及方差分析 以O(shè)D值為因變量，使用Desgin Expert8.0.6對(duì)兩次提取各因素進(jìn)行二次式擬合，Y1、Y2分別為第1、2次提取的擬合方程：

Y1=-206.039 21+35.319 63 A+49.389 07B+ 0.634 54AB-18.229 03A2-2.180 85B2；Y2=-78.572 22-6.823 63A+37.393 73B+5.680 00AB-25.596 00 A2-2.247 25B2；對(duì)擬合的方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5和6。

表5　第1次提取的方差分析

表6　第2次提取的方差分析

由方差分析可知，兩次回歸方程的P＜0.05，失擬性檢驗(yàn)P＞0.05，相關(guān)系數(shù)r1=0.809 3，r2=0.851 4，說(shuō)明方程擬合度良好，該模型準(zhǔn)確度較好，可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3.4工藝條件優(yōu)化及預(yù)測(cè) 根據(jù)回歸方程，作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖2和圖3。結(jié)果表明，兩次提取的OD值分別在12倍、1 h和10倍、1 h左右達(dá)到最大。結(jié)合已建立的數(shù)學(xué)模型，得到一、二最佳的提取時(shí)間和液固比分別是1.09 h、11.41倍；0.91 h、9.40倍。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定兩次提取工藝參數(shù)分別為1 h、12倍和1 h、10倍。

圖2　第1次提取的提取時(shí)間、液固比及其相互作用對(duì)提取工藝的影響

圖3　第2次提取的提取時(shí)間、液固比及其相互作用對(duì)提取工藝的影響

2.4工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 依照最佳工藝條件對(duì)第1、2次提取進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果分別為：第1次提取干膏率27.72%，甘草苷1.29 mg/g，甘草酸2.69 mg/g，實(shí)際總OD值為94.60，與預(yù)測(cè)值97.29偏差-2.76%；第2次提取干膏率7.65%，甘草苷0.42 mg/g，甘草酸1.08 mg/g，實(shí)際總OD值為93.79，與預(yù)測(cè)值95.02偏差-1.29%，說(shuō)明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，可用于該復(fù)方提取工藝的優(yōu)化。

3　討論

3.1抗腫瘤中藥真元顆粒原湯劑具有良好的臨床效果，熟附子味辛甘，性大熱，為補(bǔ)助元陽(yáng)之主藥，有回陽(yáng)救逆、逐寒燥濕、溫助腎陽(yáng)之功，為君藥［8］；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，為臣藥；甘草補(bǔ)中益氣，緩急解毒，調(diào)和諸藥，解附子之毒為佐藥等［9］?，F(xiàn)代研究表明，附子多糖、當(dāng)歸多糖、甘草多糖等各味藥材水溶性多糖均有不同程度的抗腫瘤功效［10-12］，故采用水煎提取工藝。

3.2本方中熟附子雖為君藥，但因其活性成分含有量較少，定量測(cè)定方法復(fù)雜，故采用測(cè)定方法較為成熟的有效成分甘草苷、甘草酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，另由于復(fù)方成分復(fù)雜，有效成分較多，故亦結(jié)合干膏率三者共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用OD值對(duì)指標(biāo)進(jìn)行處理，三者權(quán)重分別為0.2、0.2、0.6，較為合理。但由于本方藥味較多，試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)僅為三項(xiàng)，并未結(jié)合相關(guān)藥效學(xué)研究，因此還需進(jìn)一步完善。

3.3星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和結(jié)果表達(dá)方面較正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法更加優(yōu)良，適宜進(jìn)行非線性模型擬合，可提高優(yōu)化預(yù)測(cè)的精確性，更好地體現(xiàn)各因素、指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系［13-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化兩次提取工藝，得到最佳條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0660-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.046

2014-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81102900）

李 妍（1989—），女，碩士生，從事中藥制劑工藝研究。Tel：18222289215，E-mail：lxxxyyyl@163.com

蔣建蘭（1972—），女，博士，副教授，從事中藥現(xiàn)代化研究。Tel：（022）27400388，E-mail：jljiang@tju.edu.cn

結(jié)果 結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定第1次最佳提取工藝為12倍量水煎煮1 h，第2次最佳提取工藝為10倍量水煎煮1 h。結(jié)論優(yōu)化的最佳提取工藝合理可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。