蒙藥玉簪花乙醇提取物體外和體內(nèi)的抑菌活性研究

辛 穎， 白玉花

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古　通遼　028000）

蒙藥玉簪花乙醇提取物體外和體內(nèi)的抑菌活性研究

辛 穎， 白玉花

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

目的 研究蒙藥玉簪花乙醇提取物的體外、體內(nèi)抑菌活性，為尋找新的抗菌藥物提供藥理學(xué)參考依據(jù)。方法

玉簪花；乙醇提取物；抑菌活性

玉簪花Hosta plantaginea是百合科玉簪屬宿根的草本植物，因其酷似古代婦女發(fā)髻上的玉簪而得名，有“江南第一花”的美譽(yù)［1］。玉簪花也叫白萼花、白鶴花，主要分布于亞洲的亞熱帶和溫帶地區(qū)，原產(chǎn)自我國(guó)和日本，我國(guó)各地均有栽培［2-3］。玉簪始載于《本草叢新》，書中記載：玉簪辛甘而寒，搗汁服，解一切毒。玉簪花的全草均能入藥，其花性涼味甘，具有微毒；葉、根入藥可治療化膿性中耳炎。玉簪花為蒙醫(yī)習(xí)用傳統(tǒng)藥材，蒙古名為邦占嘎?tīng)柌?、查干邦占、哈?哈塔胡爾-其其格等，一般在夏、秋含苞待放時(shí)采收，及時(shí)陰干，主治咽喉腫痛、聲音嘶啞、肺熱等癥，具有清熱、解毒、止咳、利咽之功效［4-6］。《蒙藥正典》記載其性涼，味苦。用于治療咽喉腫痛、肺熱、毒熱；《認(rèn)藥白晶鑒》中描述“玉簪生濕草地，花白者上品，味苦，治喉疾、解毒、清疫熱”［7］；《無(wú)誤蒙藥鑒》亦記有“玉簪花可以清肺熱、治喉疾和解毒等”［8］。百合科玉簪屬植物的主要化學(xué)成分為甾體皂苷［9-10］、黃酮［11］和生物堿類［12］。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在玉簪花的化學(xué)成分及其解熱鎮(zhèn)痛抗炎的藥理活性方面，有關(guān)其抑菌作用的報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究擬觀察玉簪花的抑菌活性，為抑菌蒙藥玉簪花的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株、動(dòng)物、主要試劑與儀器 乙型溶血性鏈球菌（beta hemolytic streptococcus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、變形桿菌（Proteusbacillusυu(píng)lgaris）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、腸球菌（Enterococcus）和白色念球菌（Candida albicans）由內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～24 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（吉）2008-0005。玉簪花購(gòu)自通遼蒙藥廠。青霉素、鏈霉素購(gòu)自上海生工。LB細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，瓊脂2%，調(diào)pH為7.4～7.6，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。雙目生物顯微鏡（北京上光儀器有限公司，XSP-2CA），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DHP9012）；電子天平（北京儀特諾電子科技有限公司，DE-120 W）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司，DHG-9023A精密型）；恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HZQ/THZ）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司，RE-301）；智能電熱套（上海越眾儀器設(shè)備有限公司，ZNHW）；高壓滅菌鍋（威海新月化玻儀器設(shè)備有限公司，YXQ-LS-30SII）；雙人單面超凈工作臺(tái)（蘇州江東精密儀器有限公司，SW-CJ-2FB）。

1.2制備玉簪花乙醇提取物 取玉簪花藥材500 g，以95%乙醇提取2次，每次4 h，合并提取液并濃縮，得95%乙醇提取物，其提取得率為14.25%。過(guò)濾除菌后分別配制成含生藥0.01～10.00 g/mL的藥液備用。

1.3玉簪花乙醇提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.1溝槽法測(cè)定玉簪花乙醇提取物抑菌活性 菌懸液的制備：將8種菌從冰箱取出后，在LB瓊脂培養(yǎng)基上活化，再分別挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心10 min，用PBS洗一遍，再用PBS將菌懸液吸光度調(diào)至0.5左右，稀釋100倍（約含菌106cfu/mL）備用。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Ⅰ組，蒸餾水）、青霉素對(duì)照組（Ⅱ組，2 g/L）、鏈霉素對(duì)照組（Ⅲ組，2 g/L）及玉簪花乙醇提取物不同質(zhì)量濃度組（0.01、0.10、1.00和10.00 g/mL，Ⅳ～Ⅶ組）。在固體平板培養(yǎng)基上，用無(wú)菌刀片沿直徑挖一細(xì)直的溝槽，在溝槽中分別加入Ⅰ-Ⅶ組備用藥物，然后在溝槽兩側(cè)用接種環(huán)分別劃線接種濃度為106cfu/mL的8種菌液，然后將固體平板置于37℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察溝槽兩側(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。如果溝槽與細(xì)菌劃線接種交界處沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，則說(shuō)明玉簪花乙醇提取物對(duì)該細(xì)菌有抑制作用，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為陽(yáng)性（+）；若交界處出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，則說(shuō)明抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（-）。

1.3.2藥物瓊脂培養(yǎng)基法測(cè)定玉簪花乙醇提取物抑菌活性

分別取瓊脂培養(yǎng)基27 mL裝入50 mL錐形瓶中，置50℃水浴備用，將玉簪花乙醇提取物的不同質(zhì)量濃度組（0.01、0.10、1.00和10.00 g/m L，Ⅳ～Ⅶ組）加入到瓊脂培養(yǎng)基中，加入1.5 mL兔血，混勻后倒入平皿冷卻。用移液槍吸入5μL菌液到培養(yǎng)皿上涂成直徑為1 cm的圓后，置入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。如沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，則說(shuō)明玉簪花乙醇提取物對(duì)該細(xì)菌有抑制作用，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為陽(yáng)性（+）；若出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，則說(shuō)明抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（-）。

1.4玉簪花乙醇提取物體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1胃膜素混懸液的配置 稱取胃膜素20 g，放于研缽內(nèi)，加少量生理鹽水研磨，加至400 mL，加壓滅菌10 min即可。臨用時(shí)調(diào)整其pH至7.0。

1.4.2菌液的制備 將菌液37℃培養(yǎng)16～18 h后，用無(wú)菌生理鹽水10倍比例稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度菌液，比濁法測(cè)定活菌數(shù)，再吸取稀釋好的不同濃度的菌液1 m L分別放于滅菌試管內(nèi)，分別加入5%胃膜素混懸液9 mL，即做成濃度為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1× 103cfu/mL的細(xì)菌懸液備用。

1.4.3預(yù)實(shí)驗(yàn) 將不同濃度的菌懸液分別注射于小鼠體內(nèi)，每濃度組10只，腹腔注射乙型溶血性鏈球菌，0.5 mL/只，感染，腹腔注射金黃色葡萄球菌，0.5 mL/只，感染，觀察動(dòng)物4 d內(nèi)的死亡情況，選用引起小鼠80%～100%死亡的菌液濃度作為本研究中體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)的用量。

1.4.4玉簪花乙醇提取物體內(nèi)抑制乙型鏈球菌和金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠108只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、玉簪花乙醇提取物低、中、高劑量組（0.02、0.20、2.00 g/kg）。每組12只，玉簪花3個(gè)劑量組連續(xù)灌胃3 d后，第4天給藥30 min后除了空白組以外其他組根據(jù)菌株毒力預(yù)試實(shí)驗(yàn)情況選取LD80-90（1×108）的細(xì)菌量感染小鼠，乙型溶血性鏈球菌腹腔注射感染，每只0.5 mL，金黃色葡萄球菌每只0.5 mL，腹腔注射。觀察小鼠一般狀況，觀察并統(tǒng)計(jì)4 d內(nèi)各組小鼠的死亡率。當(dāng)有小鼠死亡時(shí)，無(wú)菌操作分別取出小鼠腎臟，稱定質(zhì)量研磨，用無(wú)菌生理鹽水配制成0.1 g/mL的組織懸液，取0.2 mL均勻涂布瓊脂平板，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察計(jì)數(shù)菌落。挑取培養(yǎng)出的菌落，用細(xì)菌測(cè)定儀對(duì)其進(jìn)行鑒定。至感染第9天，非用藥組小鼠全部死亡，同時(shí)處死其余各組剩余小鼠，以同樣的方法做腎臟組織懸液培養(yǎng)。若無(wú)菌落生長(zhǎng)而給藥劑量較大應(yīng)考慮動(dòng)物可能死于藥物毒性，存活動(dòng)物心血標(biāo)本培養(yǎng)應(yīng)無(wú)菌。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間的死亡率比較采取卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1玉簪花乙醇提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)

2.1.1溝槽法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 空白對(duì)照組對(duì)8種致病菌均無(wú)抑制作用，青霉素對(duì)照組對(duì)白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性鏈球菌具有抑制作用。鏈霉素對(duì)照組對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用。不同質(zhì)量濃度的玉簪花乙醇提取物的抑菌效果不同，當(dāng)玉簪花質(zhì)量濃度為10.00 g/mL和1.00 g/mL時(shí)對(duì)乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。當(dāng)玉簪花質(zhì)量濃度降至0.10 g/mL和0.01 g/mL時(shí)對(duì)8種致病菌均無(wú)抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　溝槽法檢測(cè)玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.1.2藥物瓊脂培養(yǎng)基法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，青霉素對(duì)照組對(duì)白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性鏈球菌具有抑制作用；鏈霉素對(duì)照組對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用；玉簪花質(zhì)量濃度為10.00 g/mL、1.00 g/mL和0.10 g/mL時(shí)對(duì)乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　藥物瓊脂培養(yǎng)基法檢測(cè)玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.2玉簪花乙醇提取物體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組無(wú)動(dòng)物死亡，1×108cfu/mL的致死率為83.33%，確定為本次實(shí)驗(yàn)感染的菌液濃度。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的動(dòng)物死亡率為91.7%和41.7%（P＜0.01），表明造模成功。與模型對(duì)照組比較，玉簪花的中、高劑量組小鼠的死亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且平均存活天數(shù)增加。提示玉簪花乙醇提取物對(duì)乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌致小鼠感染死亡具有明顯的保護(hù)作用，顯示了玉簪花具有一定的體內(nèi)抗菌作用。培養(yǎng)24 h后自然死亡小鼠都有菌落生長(zhǎng)，第9天處死小鼠空白組無(wú)菌落生長(zhǎng)，其他組較少有生長(zhǎng)。鑒定結(jié)果為乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　玉簪花乙醇提取物體內(nèi)抑菌活性實(shí)驗(yàn)

3　討論

玉簪花的全草均可入藥，根入藥可以起到清熱消腫、解毒止痛的作用，葉入藥具有消腫解毒的功效，而花入藥則能利濕、調(diào)經(jīng)止帶。中藥記載用玉簪花的鱗莖可以清熱解毒、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)痛止血、消腫散瘀，臨床上用于治療風(fēng)濕疼痛和關(guān)節(jié)腫大等癥。作為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙醫(yī)常用藥材的玉簪花，在《蒙藥正典》中記載其性涼、味苦，用于治療咽喉腫痛、肺熱和毒熱。蒙醫(yī)主要用玉簪花來(lái)治療急、慢性咽炎。

將玉簪花配制成醋治療耕牛的脫節(jié)爛頭病，其治療的有效率可達(dá)96.4%［13］。玉簪花根在治療骨質(zhì)增生方面也有很好的治療效果［14］。有研究發(fā)現(xiàn)玉簪花的乙醇提取物具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，可以在小鼠的熱板實(shí)驗(yàn)中降低疼痛閾值；在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中減少扭體次數(shù)［15］。玉簪花的化學(xué)成分中含有甾體類化合物，其具有一定的抗癌活性，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒選擇性［16］。玉簪全草中的生物堿對(duì)煙草花葉病毒、乙酰膽堿酯酶具有明顯抑制作用［17］。葉曉川等研究結(jié)果顯示，玉簪花的正丁醇萃取物對(duì)紅色毛癬菌和白色念球菌具有明顯的抑制作用；玉簪花的乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯，說(shuō)明玉簪花具有一定的抑菌活性，推測(cè)其主要抑菌成分可能為黃酮類化合物和皂苷［18］。

目前有關(guān)玉簪花抑制細(xì)菌作用方面的研究很少，尤其是針對(duì)致病菌的報(bào)道更為少見(jiàn)。本研究選取了臨床常見(jiàn)的8種致病菌，觀察玉簪花乙醇提取物對(duì)8種致病菌的抑制作用，為將其開(kāi)發(fā)為抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究中溝槽法體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：玉簪花乙醇提取物對(duì)乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用。藥物瓊脂培養(yǎng)基法對(duì)玉簪花乙醇提取物抑制8種致病菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：玉簪花乙醇提取物在體外對(duì)乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，并且其抑菌作用隨濃度增加而增強(qiáng)，且玉簪花對(duì)青霉素、鏈霉素雙重耐藥的金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。本研究的體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：玉簪花乙醇提取物灌胃給藥劑量高于0.20 g/kg時(shí)具有明顯的體內(nèi)抑菌活性，且抑菌作用隨著濃度增加呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。有報(bào)道顯示玉簪花的主要化學(xué)成分為黃酮、甾體皂苷和生物堿類，究竟哪類成分是其抑菌成分，仍需要進(jìn)一步探索。該研究可以為天然綠色資源植物玉簪花的開(kāi)發(fā)、充分合理利用提供有價(jià)值的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0653-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.044

2014-05-23

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011BS1204）

辛 穎（1980—），女，博士，副教授，從事蒙藥藥理學(xué)研究。Tel：（0475）8314894，E-mail：xinying20081115@163.com

體外實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Ⅰ組）、青霉素對(duì)照組（Ⅱ組）、鏈霉素對(duì)照組（Ⅲ組）和玉簪花乙醇提取物的不同質(zhì)量濃度組（0.01、0.10、1.00、10.00 g/mL）組（Ⅳ～Ⅶ組）。醇提法制備玉簪花的乙醇提取物，溝槽法和含藥瓊脂培養(yǎng)基法檢測(cè)玉簪花乙醇提取物對(duì)乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、白色念球菌的體外抑菌活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組和玉簪花低、中、高劑量組（0.02、0.20、2.00 g/kg），以乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌種，小鼠灌胃給予玉簪花乙醇提取物7 d后，腹腔注射乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌，通過(guò)觀察小鼠死亡率衡量玉簪花乙醇提取物的體內(nèi)抗菌活性。結(jié)果 體外抑菌試驗(yàn)顯示，當(dāng)玉簪花質(zhì)量濃度高于1.00 g/mL，玉簪花乙醇提取物對(duì)乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用。在體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)中，玉簪花乙醇提取物中、高劑量具有抑制乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌的作用，與空白對(duì)照組的小鼠死亡率相比，小鼠死亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 蒙藥玉簪花乙醇提取物中含有抑菌的活性成分。