玉葉金花苷酸甲酯抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用研究

潘利明， 林 勵

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東　廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東　廣州　510006）

玉葉金花苷酸甲酯抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用研究

潘利明1， 林 勵2*

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的 研究玉葉金花苷酸甲酯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用。方法 以二甲苯致小鼠耳腫脹模型觀察其抗炎作用；通過醋酸致小鼠扭體實驗及熱板法實驗觀察其鎮(zhèn)痛作用；研究玉葉金花苷酸甲酯對7種常見細(xì)菌的抑制效果，采用紙片擴(kuò)散法觀察抑菌圈直徑，采用連續(xù)稀釋法測定最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。結(jié)果 玉葉金花苷酸甲酯的中、高劑量（0.10、0.15 g/kg）能顯著減輕二甲苯致炎小鼠的耳腫脹度（P＜0.05）；對于由醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，玉葉金花苷酸甲酯各劑量組與空白組比較，有顯著性差異；在小鼠熱板實驗中，與空白對照組相比，玉葉金花苷酸甲酯中、高劑量（0.10、0.15 g/kg）對熱刺激引發(fā)的小鼠痛反應(yīng)時間有明顯的延長作用；玉葉金花苷酸甲酯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌均有抑制作用，其MIC分別為2.5、10、0.312 5、1.25、1.25、10、0.625 mg/mL。結(jié)論 玉葉金花苷酸甲酯具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛及抗菌作用。

玉葉金花苷酸甲酯；玉葉金花；抗炎作用；鎮(zhèn)痛作用；抑菌作用

玉葉金花苷酸甲酯（mussaenoside）是一種環(huán)烯醚萜苷成分，本課題組在前期工作中從茜草科植物玉葉金花Mussaenda Pubescens Ait.f.中分離得到。玉葉金花具有清熱解暑、涼血解毒等功效，用于感冒、中暑、發(fā)熱、咳嗽、腸炎、腎炎水腫、咽喉腫痛、跌打、蛇傷，以及斷腸草、木薯、野菌中毒等癥［1-3］。本課題組已證實玉葉金花水提物具有明顯的抗炎及抗菌作用［4］，為了證實玉葉金花苷酸甲酯是否為玉葉金花藥材抗炎、鎮(zhèn)痛及抗菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，開展了本研究。

1　動物、儀器與材料

1.1動物 昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，由廣東藥學(xué)院實驗動物中心提供，符合SPF級標(biāo)準(zhǔn)，許可證號Y2012-0125。

1.2藥品與試劑 玉葉金花苷酸甲酯由本研究室分離純化并鑒定結(jié)構(gòu)，采用HPLC歸一法測定其純度大于98%；阿斯匹林，山東新華制藥有限公司，批號20110409；化學(xué)致痛劑使用0.7%醋酸溶液；牛肉膏（中國進(jìn)出口檢驗技術(shù)研究所）；蛋白胨（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；瓊脂（廣東省汕頭市水產(chǎn)品綜合加工廠）；酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3儀器 YPB1003型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；PV-200型足腫容積測量儀（成都泰盟科技有限公司）；ZXC-3R型恒溫自控?zé)岚鍍x（石家莊市永豐電子通訊設(shè)備廠；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-1F型潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；303-4A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海迅能電熱設(shè)備有限公司）；RE3000C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.4供試菌株 大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、傷寒桿菌（Salmonella enteric，ATCC 14028）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，ATCC 700603）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，CMCC 43501）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（Peudomonas aeruginosa，ATCC 9027）、痢疾桿菌（Shigella，CMCC 51252）均由廣東藥學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室提供。

2　方法

2.1玉葉金花苷酸甲酯溶液的配制 精密稱取玉葉金花苷酸甲酯0.75 g，至50 mL量瓶中，加適量生理鹽水溶解，定容至刻度，搖勻，得15 mg/m L的玉葉金花苷酸甲酯溶液，冷藏備用。

2.2抗炎試驗［5-6］對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)均分5組，即空白對照組，陽性對照組，玉葉金花苷酸甲酯高、中、低劑量組。陽性對照組按0.2 g/kg給予阿司匹林混懸液，空白對照組給予等量生理鹽水，玉葉金花苷酸甲酯給藥組分別按0.15、0.10、0.05 g/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)4 d。于末次給藥1 h后，各組小鼠均右耳廓正反面均勻涂布二甲苯每只0.05 mL，左耳不涂為正常耳。致炎腫脹后1 h，脫頸椎處死小鼠，每鼠剪下左、右兩耳片，用6 mm直徑打孔器分別在同一部位打下兩耳片，電子天平稱定質(zhì)量，以左、右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度，比較各組間差異，計算腫脹度（mg）及腫脹抑制率，腫脹抑制率=［（空白對照組腫脹度-給藥組腫脹度）/空白對照組腫脹度］×100%。

2.3鎮(zhèn)痛試驗

2.3.1醋酸所致小鼠扭體試驗［7-8］動物分組、給藥劑量及給藥方式同“2.2”項，連續(xù)6 d。最后一次給藥1 h后，腹腔注射0.7%冰醋酸（0.01 mL/g）。記錄各組小鼠15 min內(nèi)扭體（腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢）的次數(shù)。以［（空白組扭體均數(shù)-受試組扭體均數(shù)）/空白組扭體均數(shù)］× l00%作為受試組抑制率。并比較各給藥組與空白組15 min內(nèi)的扭體次數(shù)是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3.2熱板試驗［9-10］取18～22 g雌性昆明種小鼠，實驗前禁食12 h，飲水不限，將熱板測痛儀預(yù)熱至（55± 0.5）℃，測定小鼠的痛閾值。痛反應(yīng)在5～30 s內(nèi)為合格鼠，取2次正常痛閾平均值，作為該鼠給藥前痛閾值。將合格小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥劑量同“2.1.2”項下，連續(xù)灌胃6 d，于末次給藥后30、60、90min分別測量小鼠痛閾值，以60 s為限，以免燙傷小鼠。以痛覺反應(yīng)出現(xiàn)時間（潛伏期）長短為評價指標(biāo)，痛閾提高的百分率=［（給藥后的痛閾-基礎(chǔ)痛閾）/基礎(chǔ)痛閾］×100%。

2.4抑菌試驗

2.4.1試劑的配制 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20 g，加熱溶解于1 000 mL水中，調(diào)pH為7.4～7.6，分裝，高壓濕熱滅菌（1.05 kg/cm2，121℃，20 min），備用。

肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH（7.0±0.1）分裝，高壓濕熱滅菌（1.05 kg/cm2，121℃，20 min），備用。

菌懸液的制備：挑取活化好的菌落，用平板計數(shù)法計數(shù)，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度約為1×106～1×107cfu/mL，備用。

玉葉金花苷酸甲酯溶液配制：精密稱定玉葉金花苷酸甲酯適量，用無菌蒸餾水配制成0.2 g/mL溶液，置于4℃冰箱中冷藏備用。

2.4.2實驗方法

2.4.2.1紙片擴(kuò)散法測定抑菌效果［11-12］將滅菌后的培養(yǎng)基在超凈工作臺上冷卻至50～60℃，每個培養(yǎng)皿加入約15 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基凝固后，用無菌移液器加入0.1 mL的菌液，用涂布器將菌液涂勻。用無菌鑷子將滅菌后直徑6 mm的小圓濾紙片置入玉葉金花苷酸甲酯滅菌水溶液（低質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，高質(zhì)量濃度為0.2 g/mL）中，浸泡2 h后取出，貼于平板上。每個紙片相隔一定間距，每種菌各設(shè)5個重復(fù)，然后以滅菌蒸餾水作為空白對照。將貼有濾紙片的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測抑菌圈直徑，取5次測量的平均值。

2.4.2.2最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定［13-15］采用2倍稀釋法，將玉葉金花苷酸甲酯用滅菌蒸餾水稀釋，分別和適量的營養(yǎng)肉湯相混合，得終質(zhì)量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1 mg/mL的不同溶液。將實驗菌液（大腸桿菌、傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、痢疾桿菌）調(diào)整濃度為105～106cfu/mL，取0.1 mL分別接種各試管中，每個濃度設(shè)5個平行管，并分別設(shè)不含玉葉金花苷酸甲酯的對照管及不加菌液的對照管，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長，肉湯清亮透明表示無細(xì)菌生長（-），肉湯渾濁表示有細(xì)菌生長（+），以能抑制細(xì)菌生長的提取物最高稀釋度作為其最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 for Windows統(tǒng)計分析軟件分析處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組之間的比較用t檢驗。

4　結(jié)果

4.1抗炎試驗 致炎20 min后，各組小鼠右耳均可見高度紅腫。數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1　玉葉金花苷酸甲酯對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n=12）

表1　玉葉金花苷酸甲酯對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別給藥劑量/ g/kg耳腫脹度/ mg腫脹抑制率/ %空白對照組-6.24±2.75玉葉金花苷酸甲酯低劑量組0.05 5.55±2.30 11.05玉葉金花苷酸甲酯中劑量組0.10 3.89±1.17*37.66玉葉金花苷酸甲酯高劑量組0.15 2.17±1.14**65.22阿司匹林組0.20 3.16±2.37**49.36

結(jié)果表明玉葉金花苷酸甲酯的中、高劑量能顯著減輕二甲苯致炎小鼠的耳腫脹度（P＜0.05），且高劑量的作用優(yōu)于阿司匹林，低劑量則作用不顯著，提示玉葉金花苷酸甲酯中高劑量有良好的抑制急性炎癥的作用。

4.2鎮(zhèn)痛試驗

4.2.1對醋酸引起的扭體反應(yīng)的影響 對于由醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，玉葉金花苷酸甲酯各劑量組、陽性對照組與空白組比較，有顯著性差異，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，數(shù)據(jù)見表2，說明玉葉金花苷酸甲酯能抑制醋酸引致的小鼠扭體反應(yīng)，提示該成分有較好的外周鎮(zhèn)痛效果。

表2　對醋酸引起的扭體反應(yīng)的影響（±s，n=12）

表2　對醋酸引起的扭體反應(yīng)的影響（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）動物數(shù)扭體次數(shù)/（次/15min）鎮(zhèn)痛率/ %空白對照組-12 41.41±17.79玉葉金花苷酸甲酯低劑量組0.05 12 34.67±18.30*16.28玉葉金花苷酸甲酯中劑量組0.10 12 15.08±9.21*63.58玉葉金花苷酸甲酯高劑量組0.15 12 5.58±3.92**86.52阿司匹林組0.20 12 8.00±4.29**80.68

4.2.2熱板試驗 在小鼠熱板試驗中，與空白對照組相比，玉葉金花苷酸甲酯中、高2個劑量對熱刺激引發(fā)的小鼠痛反應(yīng)時間有明顯的延長作用，數(shù)據(jù)見表3。

表3　玉葉金花苷酸甲酯熱板法鎮(zhèn)痛試驗結(jié)果（±s，n=10）

表3　玉葉金花苷酸甲酯熱板法鎮(zhèn)痛試驗結(jié)果（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

30 min 60 min 90 min空白對照組組別劑量/（g·kg-1）給藥前痛閾/s給藥后痛閾16.94±7.70 18.10±6.67 17.40±6.97 17.47±7.14玉葉金花苷酸甲酯低劑量組0.05 15.87±7.05 17.19±7.14 16.45±6.75 15.79±7.20玉葉金花苷酸甲酯中劑量組0.10 16.76±3.50 23.56±3.92*28.68±4.28**19.23±4.80玉葉金花苷酸甲酯高劑量組0.15 14.06±4.53 19.76±5.25 30.89±3.44**17.94±4.80阿司匹林組0.20 12.50±2.71 20.02±4.73 30.34±5.15**-16.67±3.53

4.3抑菌試驗

4.3.1紙片擴(kuò)散法實驗結(jié)果 兩種濃度的玉葉金花苷酸甲酯水溶液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、痢疾桿菌、陰溝腸桿菌、傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌均有一定的抑制作用，數(shù)據(jù)見表4。

表4　紙片擴(kuò)散法法測定抑菌效果（±s，n=5）

表4　紙片擴(kuò)散法法測定抑菌效果（±s，n=5）

對照大腸桿菌供試菌株抑菌圈/mm低質(zhì)量濃度0.1 g/mL高質(zhì)量濃度0.2 g/mL 23.8±0.84 26.4±0.55-15.4±0.55 18.6±0.55-傷寒桿菌11.4±0.89 12.6±0.55-肺炎克雷伯菌20.8±0.84 22.4±0.55-陰溝腸桿菌17.0±1.22 20.4±0.55-金黃色葡萄球菌17.4±0.55 18.0±0.71-銅綠假單胞菌17.0±1.22 19.2±0.45-痢疾桿菌

4.3.2最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）測定的實驗結(jié)果 玉葉金花苷酸甲酯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌均有抑菌作用，其MIC分別為2.5、10、0.312 5、1.25、1.25、10、0.625 mg/mL，數(shù)據(jù)見表5。

5　討論

5.1二甲苯致小鼠耳腫脹試驗 因分離得到的藥量有限，抗炎動物模型僅做了小鼠耳腫脹試驗，從結(jié)果看，玉葉金花苷酸甲酯中高劑量有良好的抑制急性炎癥的作用，提示玉葉金花苷酸甲酯為玉葉金花藥材抗炎活性的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表5　玉葉金花苷酸甲酯最低抑菌質(zhì)量濃度實驗結(jié)果

5.2鎮(zhèn)痛試驗 采用經(jīng)典的醋酸致小鼠扭體法及熱板法疼痛模型來考察玉葉金花苷酸甲酯的鎮(zhèn)痛作用。醋酸致小鼠扭體模型是通過化學(xué)試劑刺激造成小鼠腹腔急性炎癥反應(yīng)，是篩選非甾體抗炎藥鎮(zhèn)痛作用的一種敏感簡便的方法；熱板法屬于反射性測痛模型，對僅具有外周鎮(zhèn)痛作用的非甾體抗炎藥不敏感，是區(qū)分麻醉性鎮(zhèn)痛藥和非甾體鎮(zhèn)痛藥的有效模型。兩個實驗結(jié)果表明玉葉金花苷酸甲酯有顯著的鎮(zhèn)痛作用，其高劑量組與阿司匹林效果相當(dāng)，對化學(xué)刺激疼痛實驗?zāi)Ｐ图皩岽碳ぬ弁磳嶒災(zāi)Ｐ途^敏感，提示其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能同時具有外周和中樞的鎮(zhèn)痛作用，尚需要進(jìn)一步實驗驗證。

5.3抑菌試驗 最低抑菌質(zhì)量濃度測定的兩個實驗結(jié)果表明玉葉金花苷酸甲酯對供試的7種細(xì)菌具有明顯的抗菌活性，抗菌譜廣，無論是對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）還是革蘭氏陰性菌（肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌和大腸埃希菌）都有不錯的抑制效果。

紙片擴(kuò)散法實驗結(jié)果可見玉葉金花苷酸甲酯對7種供試菌都有一定的抑制作用，高濃度的抑菌效果強(qiáng)于低濃度，綜合分析兩個濃度的抑菌效果可知玉葉金花苷酸甲酯對痢疾桿菌的抑制效果最強(qiáng)，次之為肺炎克雷伯菌，對陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的抑制效果相當(dāng)，對傷寒桿菌的抑制效果最弱。

玉葉金花苷酸甲酯對7種供試菌的MIC由小及大順序為肺炎克雷伯菌（0.312 5 mg/mL）＞陰溝腸桿菌（0.625 mg/mL）＞傷寒桿菌（1.25 mg/mL）=痢疾桿菌（1.25 mg/mL）＞金黃色葡萄球菌（2.5 mg/mL）＞大腸桿菌（10 mg/mL）=銅綠假單胞菌（10 mg/mL），這與濾紙片法得到的結(jié)果不能完全吻合，其原因可能有以下幾點：（1）制作濾紙片過程中，部分濾紙片沒有浸泡完全，藥物沒有均勻地分布在每一個部分，影響了抑菌圈的結(jié)果。（2）由于MIC的測定是在得到抑菌圈實驗結(jié)果才進(jìn)行的，所以菌懸液多放置培養(yǎng)了1 d，在這1 d內(nèi)，可能有細(xì)菌產(chǎn)生變異，如易產(chǎn)生耐藥性變異的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌等，而對MIC的實驗結(jié)果也造成一定的影響。（3）在培養(yǎng)細(xì)菌的時候，為了保證不污染環(huán)境，故需要在試管上蓋塞子，同時又要保證細(xì)菌能夠生長，所以在蓋塞子的時候又要保留一絲空隙，但是在實際操作中，不可能做到每個試管的條件完全一致，故可能細(xì)菌的生長速度會因此而有所影響，最后直接影響實驗結(jié)果。

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R966

B

1001-1528（2015）03-0633-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.038

2014-02-02

國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項目（81403190）

潘利明（1979—），博士，實驗師，從事中藥資源開發(fā)與新藥研究工作。Tel：（020）39352178，E-mail：635533515@ qq.com

林 勵（1954—），研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源開發(fā)與新藥研究工作。Tel：（020）39358270，E-mail：1wyll@ gzhtcm.edu.cn