UPLC法測定地榆乙酸乙酯部位中4個鞣質(zhì)類成分

禹奇男， 熊永愛， 楊榮平， 張帥杰， 楊 明*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川　成都　611137；2.重慶市中藥研究院，重慶　400065；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑教育部重點實驗室，江西　南昌　330004）

UPLC法測定地榆乙酸乙酯部位中4個鞣質(zhì)類成分

禹奇男1， 熊永愛1， 楊榮平2， 張帥杰3， 楊 明3*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137；2.重慶市中藥研究院，重慶400065；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004）

目的 建立UPLC法同時測定地榆乙酸乙酯部位中沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸4種鞣質(zhì)類成分。方法 地榆70%乙醇提取液再經(jīng)乙酸乙酯萃取，甲醇溶解并定容，分析采用shim-pack XR-ODSIII色譜柱（2.0 mm×75 mm，1.6μm），以甲醇-0.5%醋酸水溶液為流動相梯度洗脫，體積流量0.4 mL/min，柱溫30℃，PDA檢測器于274 nm波長下對各成分進行定量測定。結(jié)果 沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸在18 min內(nèi)均達到基線分離，各成分在其線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍分別為0.048～0.287μg（r2=0.999 6），0.151～0.905μg（r2=0.999 7），0.169～1.014μg（r2=0.999 4），0.040～0.239μg（r2=0.999 4）。平均加樣回收率分別為98.5%（RSD 1.3%），99.0%（RSD 1.5%），101.2%（RSD 2.1%），99.6%（RSD 1.3%）。結(jié)論 分析表明內(nèi)蒙古所產(chǎn)地榆中沒食子酸和鞣花酸這兩類可水解鞣質(zhì)的含有量大于其他地區(qū)。吉林所產(chǎn)地榆中兒茶素類縮合鞣質(zhì)的含有量較高。

地榆；鞣質(zhì)類化合物；沒食子酸；鞣花酸；超高效液相色譜

地榆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品?！捌湫晕⒑犊?、酸、澀，歸肝、大腸經(jīng)”。具有涼血止血，解毒斂瘡的功效。除了具有上述功效外，地榆還具有很好的升高外周血細(xì)胞作用，課題組前期采用環(huán)磷酰胺致小鼠貧血模型，研究表明地榆總鞣質(zhì)能使環(huán)磷酰胺致貧血模型小鼠的外周血白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）的數(shù)量升高。目前地榆測定指標(biāo)成分多為沒食子酸，測定成分單一，不能完全反應(yīng)其內(nèi)在質(zhì)量。本實驗采用UPLC，建立同時測定地榆乙酸乙酯部位中沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸4種鞣質(zhì)類成分的方法。此法快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可較全面地反應(yīng)地榆中鞣質(zhì)類成分，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑 島津超高效液相色譜儀LC-30A，SPD-M20A DAD紫外檢測器，LC-solution色譜工作站（島津公司）；十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），恒溫水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）。液相用甲醇為色譜純（安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純（重慶川東化工有限公司）。

沒食子酸對照品（批號110831-200803，中國藥品生物制品檢定所），兒茶素（批號110877-201203，中國食品藥品檢定研究所），沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號G101020，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司），鞣花酸（批號R-004-120817，成都瑞芬思生物科技有限公司）。

10批不同產(chǎn)地的地榆藥材生品均購于藥材市場，并經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云副究員鑒定系地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根。

1.2色譜條件 Shim-pack XR-ODSIII色譜柱（2.0 mm×75 mm，1.6μm）；以流動相A為甲醇，流動相B為0.5%醋酸水溶液，梯度洗脫（0～1.5 min，7%～7%A；1.5～1.7 min，7%～12%A；1.7～8.5 min，12%～13.8%A；8.5～11 min，13.8～17%A；11～11.10 min，17%～30%A；11.10～18 min，30%～30%A）；體積流量0.4 mL/min；柱溫30℃；檢測波長274 nm；進樣量2μL。

1.3對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸5.98 mg，兒茶素18.85 mg，沒食子兒茶素沒食子酸酯21.13 mg，鞣花酸4.98 mg，分別置于5 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度。分別精密移取上述對照品溶液各2 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。

1.4供試品溶液的制備 稱取藥材粉末0.5 g，置于60 mL具塞圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，水浴回流提取60 min，提取2次，濾過，合并濾液。濃縮揮干，殘渣用25 mL水分散，再用乙酸乙酯25 mL萃取，重復(fù)3次，合并乙酸乙酯部分，濃縮揮干，用甲醇溶解并定容至25 mL，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2　試驗結(jié)果

2.1系統(tǒng)適用性試驗 樣品溶液及對照品溶液依次進樣，獲得色譜圖（見圖1）?？梢詮膱D中看出，沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸與相鄰峰的分離度達到完全基線分離。

圖1　混合對照品（A）和供試品（B）的UPLC圖Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances（A）and samp le（B）

2.2線性關(guān)系考查，檢測限和定量限 分別精密移取沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、鞣花酸對照品溶液各0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，依照“1.2”項下色譜條件進樣，以對照品進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，對其進行線性回歸，得到混合對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合各對照品回歸方程。將混合對照品溶液用甲醇不斷進行稀釋后分析，得到4個化合物的檢測限LOD值（S/N≈3）和定量限LOQ值（S/N≈10）。目標(biāo)化合物的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r），線性范圍、檢測限和定量限見表1。結(jié)果表明，各化合物在線性范圍內(nèi)進樣量與峰面積線性關(guān)系良好，方法靈敏度高。

表1　化合物的回歸方程，線性范圍，相關(guān)系數(shù)，檢測限和定量限Tab.1 Regression equations，linear range，correction coefficient，lim its of detection（LOD）and lim its of quantification（LOQ）for analytes

2.3精密度試驗 將混合對照品溶液，按“1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測得4種化合物的RSD值分別為沒食子酸1.1%，兒茶素1.6%，沒食子兒茶素沒食子酸酯2.4%，鞣花酸1.5%。表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗 取地榆粗粉，按“1.4”項下操作制備供試品溶液，分別在供試品制備后0、2、4、8、12 h按“1.2”項下色譜條件進樣，結(jié)果沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的RSD值分別為2.0%、1.7%、2.8%和2.3%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重復(fù)性試驗 取地榆粗粉6份，按“1.4”項下操作制備供試品溶液，按“1.2”項下色譜條件進樣，結(jié)果沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的RSD值分別為2.5%、1.9%、2.8%和2.1%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.6加樣回收率試驗 分別精密稱取沒食子酸12.47 mg、兒茶素37.03 mg、沒食子兒茶素沒食子酸酯31.85 mg、鞣花酸7.68 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得加樣回收率試驗的混合對照品溶液。

精密稱取已知含有量的地榆粗粉6份（批次1，四川產(chǎn)地），每份約0.25 g，精密吸取上述制備的混合對照品溶液1 mL加入每份樣品中。然后按“1.4”項下操作制備供試品溶液，按“1.2”項下色譜條件進樣。結(jié)果見表2。

2.7樣品測定 取10批次地榆藥材粉末，按“1.4”項下操作制備供試品溶液，按“1.2”項下色譜條件進樣測定，采用外標(biāo)一點法計算4種成分在10批次藥材中的量，比較各批次藥材中成分含有量的差異。測定結(jié)果見表3。

表2　沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的加樣回收率（n=6）Tab.2 Recovery rates of gallic acid，catechins，allic catechin gallic acid ester and ellagic acid（n=6）

3　討論

本研究運用DAD檢測器對沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的對照品進行紫外全波長掃描，結(jié)果表明，各成分具有較強的紫外吸收。沒食子酸的最大吸收波長為270 nm、兒茶素的最大吸收波長為278 nm、沒食子兒茶素沒食子酸酯的最大吸收波長為274 nm，鞣花酸的最大吸收波長為253 nm，對比不同波長下色譜峰分離效果和對稱性，結(jié)果以274 nm作為測定波長較好。對甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.5%醋酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%醋酸水4組流動相進行了試驗，結(jié)果表明甲醇-0.5%醋酸水系統(tǒng)進行梯度洗脫效果最佳，且基線平穩(wěn)，能在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)基線分離。對4個化合物的檢測限和定量限進行了測定，結(jié)果4個化合物線性范圍的下限和測得樣品中的量均高于此定量限，說明此分析方法合理，具有靈敏的定量檢測能力。另比較了超聲和回流2種提取方法，不同比例的乙醇提取，不同提取次數(shù)以及萃取次數(shù)，結(jié)果以70%乙醇回流提取2次，每次60 min，乙酸乙酯萃取3次的效果最佳。

表3　地榆樣品測定結(jié)果Tab.3 M easured values of Sanguisorba officinalis

本研究所用樣品來自四川、貴州、甘肅、吉林、陜西、內(nèi)蒙古等地區(qū)，成分定量測定結(jié)果表明地榆中鞣質(zhì)類成分含有量普遍較高，這與地榆中主要含鞣質(zhì)類成分相符。不同產(chǎn)地的地榆中4種鞣質(zhì)類成分含有量存在差異。例如內(nèi)蒙古所產(chǎn)藥材中沒食子酸和鞣花酸成分這兩類可水解鞣質(zhì)的含有量大于其他地區(qū)。吉林所產(chǎn)藥材中兒茶素成分這類縮合鞣質(zhì)的含有量較高。此外，同一地區(qū)所產(chǎn)藥材各批次間成分含有量差異也較大，這些差異可能與產(chǎn)地的氣候，日照，海拔等自然因素有關(guān)。

本研究建立UPLC檢測地榆乙酸乙酯部位中鞣質(zhì)類成分的方法，為地榆活性物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了科學(xué)的依據(jù)。普通高效液相測定地榆樣品中沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯和鞣花酸的量，分析時間較長，一次需70 min以上。本研究采用超高效液相色譜法，建立同時測定地榆乙酸乙酯部位中這些鞣質(zhì)類化合物的方法，可在18 min內(nèi)完成一次色譜分析，與普通高效液相色譜法相比，大幅縮短分析時間。作為HPLC的一種突破，UPLC大大短縮了分析時間、提高了分析效率和柱效，為中藥這一多成分復(fù)雜體系的分析檢測提供了一種新的強有力工具。

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Determ ination of four tannins of ethyl acetate extract from Sanguisorba officinalis by UPLC

YU Qi-nan1， XIONG Yong-ai1， YANG Rong-ping2， ZHANG Shuai-jie3， YANG Ming3*
（1.Chengdu Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；2.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China；3.Jiangxi Unirersity of Traditiond ChineseMedicine，Key Lab of Mordern Preparation of Traditional ChineseMedicine，Ministry of Education，Nanchang 330004，China）

AIM To develop an UPLCmethod for simultaneously determining four tannins（gallic acid，catechin，gallocatecholgallate and ellagic acid）of ethyl acetate extract from Sanguisorba officinalis.METHODS The crude extract of S.Officinalis was gained through 70%ethanol and ethyl acetate in turn，and then was solved in methyl solution and the volume was setwith methanol.Their analysiswas performed on shim-pack XR-ODSIII column（2.0 mm×75 mm，1.6μm）with methanol（A）and 0.5%glacial acetic acid（B）asmobile phase in a gradient elution manner.The flow ratewas0.4mL/min，the detection wavelength was set at274 nm，the injection volume was2μL，and the column temperature was30℃.RESULTS The peaks of gallic acid，catechin，gallocatecholgallate，and ellagic acid reached the baseline separation within 18 minutes，and showed a good linearity in the range of 0.048～0.287μg（r2=0.999 6），0.151～0.905μg（r2=0.999 7），0.169～1.014μg（r2= 0.999 4），and 0.040～0.239μg（r2=0.999 4），respectively.The average recoveries were 98.5%（RSD 1.3%），99.0%（RSD 1.5%），101.2%（RSD 2.1%），and 99.6%（RSD 1.3%），respectively.CONCLUSION The experimental data shows that the contents of two constituents of S.officinalis，gallic acid and ellagic acid，collected from Inner Mongolia are higher than these from the rest，the contents of catechin and gallocate-cholgallate collected from Jilin Province are themost in themeasured samples.

Sanguisorba officinalis；tannins；gallic acid；ellagic acid；UPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0574-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.025

2014-07-27

國家自然科學(xué)基金（81373976）；國家重大新藥創(chuàng)制專項（2013ZX09103002-013）

禹奇男，碩士生，從事中藥新制劑、新劑型及新技術(shù)的研究與應(yīng)用。Tel：18680977657，E-mail：393705947@qq.com

楊 明（1962—），男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：13870608983，E-mail：574825214@qq.com