HPLC法同時測定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸和川續(xù)斷皂苷Ⅵ

季寧平， 徐曉秋， 傅超美， 劉 芳， 胡慧玲

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川　成都　610075）

［質(zhì) 量］

HPLC法同時測定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸和川續(xù)斷皂苷Ⅵ

季寧平， 徐曉秋， 傅超美*， 劉 芳， 胡慧玲

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都610075）

目的 建立同時測定艾附暖宮丸中芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的高效液相色譜法。方法 艾附暖宮丸50%甲醇提取液的高效液相色譜分析以C18色譜柱為固定相，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，體積流量1 mL/min，柱溫為30℃，線性梯度洗脫，芍藥苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測波長為230 nm、阿魏酸檢測波長為321 nm。結(jié)果 芍藥苷在0.502～5.016 7μg（r=0.999 3）范圍內(nèi)、阿魏酸在0.147～1.760μg（r=0.999 8）范圍內(nèi)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ在0.975～11.480μg（r=0.999 5）范圍內(nèi)，對照品進(jìn)樣質(zhì)量和色譜峰峰面積呈良好線性關(guān)系，加樣回收率分別為97.8%、100.5%和97.6%，RSD值分別為2.0%、2.0%和1.8%。結(jié)論 建立的高效液相色譜法簡便穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠，可用于艾附暖宮丸的質(zhì)量控制。

艾附暖宮丸；高效液相色譜；芍藥苷；阿魏酸；川續(xù)斷皂苷Ⅵ

艾附暖宮丸是由艾葉（炭）、香附（醋炙）、當(dāng)歸、川芎、白芍（酒炒）、續(xù)斷、吳茱萸（制）、肉桂、地黃、黃芪（蜜炙）十味中藥經(jīng)粉碎成細(xì)粉加煉蜜制得的小蜜丸或大蜜丸，具有理氣養(yǎng)血、暖宮調(diào)經(jīng)的功效，主要用于血虛氣滯、下焦虛寒所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥［1］。其療效確切，為治療寒凝沖任所致的月經(jīng)不調(diào)等癥的代表成藥。目前市面所售艾附暖宮丸成方制劑品種規(guī)格多樣，相關(guān)質(zhì)量控制研究文獻(xiàn)較少，其中多數(shù)只采用了某單味飲片的成分定量測定作為質(zhì)控指標(biāo)［2-4］，質(zhì)控指標(biāo)稍顯單一，且《中國藥典》2010年版該項下僅進(jìn)行了芍藥苷測定，專屬性差，難以全面評估其質(zhì)量優(yōu)劣。目前，多數(shù)高效液相設(shè)備配備有可進(jìn)行多波長測定的檢測器，能同時進(jìn)行至少兩種以上波長的測定，可同時測定多種成分，已廣泛地應(yīng)用到多數(shù)飲片、提取物及制劑的質(zhì)量控制中［5-7］，其中較多使用雙波長同時測定多種成分法?；诖?，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種較為簡便的能同時測定艾附暖宮丸中多種成分的高效液相色譜法［8-12］。

1　儀器與試藥

島津LC-20AT系列高效液相色譜儀（配有紫外檢測器、自動進(jìn)樣器、二元梯度泵、島津LC-Solution色譜工作站，日本島津公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德國賽多利斯公司）；電熱套ZDHW型（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

艾附暖宮丸（樣品1，購于康貝大藥房，批號20131001；樣品2，購于康壽大藥房，批號20120954；樣品3，購于萬安大藥房，批號20130801；樣品4，購于榮州大藥房，批號1210740）；芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號120903-200809）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號0773-9910）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號101227）；色譜乙腈（美國天利公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Global C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～35 min，10%～20%A；35～52 min，20%～30%A；52～67 min，30%～50% A；67～82 min，50%～60%A）；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；芍藥苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測波長為230 nm，阿魏酸為321 nm。對照品溶液、供試品及陰性樣品的色譜圖，見圖1。

2.1.1對照品溶液的制備 取芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.502、0.147、0.975 mg/mL的混合溶液，即得。

圖1　艾附暖宮丸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Aifu Nuangong Pills

2.1.2供試品溶液的制備 取樣品適量，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性樣品的制備（專屬性考察） 按《中國藥典》2010年版中“艾附暖宮丸”的制法制備缺少芍藥、川芎、當(dāng)歸、續(xù)斷的水蜜丸，再按照“2.1.2”項下制備陰性供試品。

2.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10、12μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積值，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，見表1。

表1　各對照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 Regression equation，correlation coefficient and linearity and range of each reference substance

2.3精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（樣品1，批號20131001）10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ色譜峰峰面積的RSD值分別為0.1%、0.1%、0.1%，表明儀器精密度良好。

2.4重復(fù)性試驗(yàn) 同一樣品（樣品1，批號20131001）按“2.1.2”項下平行制備6份供試品溶液，每份溶液精密取10μL進(jìn)樣2次，測定峰面積，計算。芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量的RSD值分別為1.1%、2.6%、2.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（樣品1，批號20131001），室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10μL進(jìn)樣，測定峰面積。芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ色譜峰峰面積的RSD值分別為0.4%、0.4%、0.8%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.6加樣回收試驗(yàn) 取已知含有量的艾附暖宮丸樣品（樣品1，批號20131001）1 g，精密稱定，共6份。每份樣品分別精密加入質(zhì)量濃度為1.231 mg/mL的芍藥苷對照品溶液2 mL、0.183 mg/mL的阿魏酸對照品溶液1 mL、1.214 mg/mL的川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶液2 mL，按“2.1.2”項下方法按照相應(yīng)的比例制備供試品溶液，精密吸取50μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，見表2。芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均回收率分別為97.8%、100.5%和97.6%，RSD值分別為2.0%、2.0%和1.8%。

表2　加樣回收率試驗(yàn)（n=6）Tab.2 Results of recorery tests（n=6）

2.7樣品測定 取3個批號的艾附暖宮丸，按“2.1.2”項及“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行制備3個，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，將所測定的峰面積帶入相應(yīng)的回歸方程中，計算，結(jié)果見表3。

表3　不同廠家艾附暖宮丸中3種成分測定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Determ ination results of three contents from differentmanufacturers（±s，n=3）

表3　不同廠家艾附暖宮丸中3種成分測定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Determ ination results of three contents from differentmanufacturers（±s，n=3）

注：“—”表示未檢測出。

樣品 批號芍藥苷/（mg·g-1）川續(xù)斷皂苷Ⅵ/（mg·g-1）阿魏酸/（mg·g-1）樣品120131001 2.519 4±0.033 2.470 4±0.022 0.186 7±0.003樣品2 20120954 2.018 0±0.004 2.096 5±0.018 0.205 1±0.009樣品3 20130801 1.752 5±0.028 2.005 8±0.031—樣品4 1210740 1.194 1±0.022 1.615 8±0.011 0.229 1±0.023陰性樣品實(shí)驗(yàn)室自制———

3　討論

3.1提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)對提取方法進(jìn)行了考察，加熱回流法和超聲法之間存在顯著性差異，加熱回流法的提取效果顯著高于超聲法，所以選擇加熱回流法作為提取方法。并且采用單因素試驗(yàn)法，分別對提取溶媒（體積分?jǐn)?shù)分別為25%、50%、75%和100%甲醇溶液）和提取時間（30、45、60min）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，除25%的甲醇溶液提取效率較低以外，其他3種體積分?jǐn)?shù)溶媒提取效果無顯著性差異，從減小成本角度出發(fā)，選擇50%的甲醇作為提取溶媒；加熱回流30 min即可將成分基本提取完全，故本實(shí)驗(yàn)中各供試品溶液的提取方法為：用50%甲醇溶液加熱回流30 min。

3.2流動相的優(yōu)化 為使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時間較為合理，在參考了文獻(xiàn)［13-15］的基礎(chǔ)之上結(jié)合多次預(yù)試，最終確定以乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)為流動相進(jìn)行梯度洗脫。流動相中加入適量的酸可以改善峰的分離度并防止峰的拖尾，考慮到固定相對酸的承受能力，所以選擇0.1%的磷酸溶液。

3.3檢測波長的確定 由于芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ三者的最大吸收波長，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，其中芍藥苷（230 nm）與川續(xù)斷皂苷Ⅵ（212 nm）最大吸收波長接近，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品在230 nm與212 nm色譜峰面積相差不大，且212 nm近端吸收較嚴(yán)重，也受檢測器限制，僅能作雙波長測定，為進(jìn)行同時測定故選擇230 nm作為川續(xù)斷皂苷Ⅵ的吸收波長，而阿魏酸的最大吸收波長為321 nm與230 nm色譜峰面積相差較大，且所使用高效液相色譜儀支持雙波長測定，故確定阿魏酸檢測波長為321 nm。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：285.

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［12］ 謝劍琳，張振秋，楊 超，等.HPLC波長切換法同時測定牡丹皮中6個成分的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（2）：85-89.

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Determ ination of paeoniflorin，ferulic acid and asperosaponinⅥin Aifu Nuangong Pills by HPLC

JINing-ping， XU Xiao-qiu， FU Chao-mei， LIU Fang， HU Hui-ling
（Pharmacy College，Chengdu Uniυersity of Traditional Chinese Medicine；The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Deυelopmentand Utilization of ChineseMedicine Resources，Chengdu 610075，China）

AIM To setup an HPLCmethod for determining three bioactive components，paeoniflorin，ferulic acid and asperosaponinⅥin Aifu Nuangong Pills.METHODS The chromatographic separation ofmethanolic extract of Aifu Nuangong Pillswas performed on Global-C18（250mm×4.6mm，5μm）column in a gradientelution manner using amixture of acetonitrile and 0.1%phosphoric asmobile phase.The flow ratewas1mL/min and column temperaturewasmaintained at30℃.The detection wavelength of paeoniflorin and asperosaponinⅥwas set up at230 nm，ferulic acid at321 nm.RESULTS The linear range was 0.502-5.016 7μg（r=0.999 3）for paeoniflorin，0.147-1.760μg（r=0.999 8）for ferulic acid and 0.975-11.480μg（r=0.999 5）for asperosaponinⅥ.The average recoverieswere 97.8%for paeoniflorin with RSD=2.0%，100.5%for ferulic acid with RSD=2.0%，and 97.6%for asperosaponinⅥwith RSD=1.8%，respectively.CONCLUSION Themethod is simple and convenient，reliable and accurate，it can be utilized as a quality controlmethod for Aifu Nuanging Pills. KEY WORDS：Aifu Nuangong Pills；HPLC；paeoniflorin；ferulic acid；asperosaponinⅥ

R927.2

A

1001-1528（2015）03-0534-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.016

2014-05-09

四川省科技支撐計劃（310931）

季寧平，碩士生，從事中藥制劑新技術(shù)新方法研究。Tel：13882189250，E-mail：504549915@qq.com

傅超美，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑、新劑型和新技術(shù)研究。Tel：（028）61800236，E-mail：chaomeifu @126.com