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    HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者的DC-CIK免疫治療

    2015-10-17 13:44:06馮艷紅邱潔李麗吳衛(wèi)鋒常家寶楊永峰周振先
    肝臟 2015年10期
    關(guān)鍵詞:回輸免疫治療干擾素

    馮艷紅 邱潔 李麗 吳衛(wèi)鋒 常家寶 楊永峰 周振先

    HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者的DC-CIK免疫治療

    馮艷紅邱潔李麗吳衛(wèi)鋒常家寶楊永峰周振先

    目的用人體自身DC-CIK免疫治療HBe Ag陽性的慢性乙型肝炎患者,觀察HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA以及肝功能的變化,以探討自身DC-CIK免疫治療抗病毒作用。方法 從人血中分離單抗細(xì)胞,在體外誘導(dǎo)自體DC細(xì)胞,乙型肝炎疫苗負(fù)載,和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng),制備DC-CIK細(xì)胞,給予HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者輸用。每周1次,共5次。檢查治療前后肝功能TBil、ALT、AST,病毒學(xué)指標(biāo)DNA、HBs Ag、HBe Ag定量。結(jié)果 HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者用人體自身DC-CIK免疫治療(5次)4周,前后比較發(fā)現(xiàn)肝功能TBil、ALT、AST有明顯好轉(zhuǎn),病毒學(xué)指標(biāo)HBs Ag、HBeAg、HBV DNA都有下降,但仍未實現(xiàn)陰轉(zhuǎn)。結(jié)論 HBe Ag陽性的慢性乙型肝炎患者用人體自身DC-CIK免疫治療,在4周時間內(nèi)就有明顯的抗病毒效果,以及肝功能好轉(zhuǎn)的作用。

    HBe Ag陽性;慢性乙型肝炎;DC-CIK免疫治療

    慢性乙型肝炎又分HBe Ag陽性和HBe Ag陰性慢性乙型肝炎,其中HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者病毒復(fù)制活躍,病毒量更高,發(fā)病幾率更大,傳染性更強(qiáng)。目前所用抗HBV核苷類藥物雖然抑制病毒作用強(qiáng)而快,但HBe Ag/抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)化率太低。長期使用導(dǎo)致HBV產(chǎn)生耐藥突變株,引起ALT和HBV DNA突變,導(dǎo)致病情惡化[1]。α-干擾素對HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者HBeAg/抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)化較快,但有效率太低,且降DNA作用差。干擾素與核苷類藥物對HBV在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程形成的cccDNA仍無能為力。本研究使用DC-CIK免疫細(xì)胞治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者,觀察此療法的抗病毒作用,現(xiàn)報道如下。

    資料和方法

    一、研究對象

    按照2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[2]診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇近3年我院收治的HBeAg陽性、HBV DNA陽性、ALT異常(40~400 IU/L)慢性乙型肝炎患者18例,年齡平均36歲(19~48歲),男10例,女8例。比較18例患者在DC-CIK細(xì)胞治療前后肝功能、HBe Ag、HBs Ag、DNA的變化,從而探討DC-CIK細(xì)胞的抗病毒作用。

    二、方法

    DC-CIK細(xì)胞療法:無菌條件下取患者外周靜脈血10 m L,用0.9%氯化鈉溶液以1∶1的比例稀釋后沿離心管壁緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上,2 000 r/min離心20 min后,取白膜層細(xì)胞,0.9%氯化鈉溶液洗滌2次,以無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2 ×106/m L轉(zhuǎn)到培養(yǎng)瓶內(nèi),置37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育3 h,分離黏附細(xì)胞及非黏附細(xì)胞。黏附細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),加入細(xì)胞因子1 000 k U/L集落刺激因子(CSF)、500 k U/L白介素-4,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),隔天半量換液并添加細(xì)胞因子,第6 d加入表面抗原20 mg/L及腫瘤壞死因子500μg/L,培養(yǎng)第7 d收集細(xì)胞。而非黏附細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮,加入細(xì)胞因子10 k U/L干擾素、500 k U/L白介素-2、500μg/LCD3單克隆抗體及100 k U/L白介素-1,隔天換液,在培養(yǎng)第7 d加入培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞(DC),繼續(xù)培養(yǎng)7 d后,收集細(xì)胞給予患者以靜脈回輸?;剌?次,時間為1個月。治療前后檢查患者肝功能TBil、ALT、AST、HBe Ag、HBs Ag、HBV DNA,以研究DC-CIK免疫細(xì)胞治療對HBe Ag陽性患者的抗病毒作用。

    三、統(tǒng)計學(xué)處理

    利用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P≤0.05者,表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、DC-CIK免疫細(xì)胞治療對肝功能的影響

    治療前后TBil都在正常范圍,治療后較治療前數(shù)值有所下降。ALT治療前均值112.28 IU/L,治療后均值46.62 IU/L,下降明顯,P 值為0.01,差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。AST治療后也有下降。但治療前后TBil和AST差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果說明DC-CIK治療能使患者肝功能好轉(zhuǎn)。

    表1 DC-CIK治療前后肝功能的比較

    二、DC-CIK治療前后HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的影響

    表2中說明,HBs Ag、HBeAg、HBV DNA在DCCIK治療后均有下降,但治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    其中5例患者(27.78%),年齡19~26歲,治療前ALT 300~400 IU/L,治療后HBs Ag、HBe Ag、DNA下降比較明顯,治療后12周實現(xiàn)HBe Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換,HBV DNA降至正常。

    表2 DC-CIK治療前后HBs Ag、HBeAg、HBV DNA的比較

    三、DC-CIK治療的不良反應(yīng)

    除個別患者有輕微發(fā)熱不適,無其他不良反應(yīng)。

    討 論

    慢性乙型肝炎患者DC功能低下或缺陷,導(dǎo)致機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞應(yīng)答呈耐受狀態(tài)。CHB患者體內(nèi)DC的功能缺陷具體表現(xiàn)為[3-5]CHB感染者循環(huán)中DC表達(dá)的HLA-DR和共刺激分子B7(CD80/CD86)減少,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力下降,外周血單核細(xì)胞(PBMC)中產(chǎn)IFN-γ的DC前體細(xì)胞(pre-DC,p DC)的數(shù)量和功能也顯著下降。研究發(fā)現(xiàn),慢性乙型肝炎DC的表型與提呈能力與HBV的載量有密切關(guān)系[6]。DC經(jīng)抗原刺激后向淋巴結(jié)遷移,將其攜帶的抗原信息傳遞給相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞,激發(fā)、增強(qiáng)并重建CHB患者抗HBV特異性T細(xì)胞與B細(xì)胞免疫應(yīng)答,特異性地清除病毒與病毒感染的細(xì)胞,從根本上清除HBV感染,解除CHB患者HBV長期持續(xù)感染狀態(tài),產(chǎn)生長久療效。

    經(jīng)抗原刺激后的DCs還分泌多種細(xì)胞因子,增強(qiáng)抗體非特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮“天然免疫佐劑”的作用。將CHB患者的淋巴細(xì)胞體外進(jìn)行激活,形成細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)和樹突狀細(xì)胞激活的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK)可直接改善免疫狀態(tài)。同時CIK、DC-CIK分泌大量天然免疫因子(IFNs,IL-2,IL-12等),促進(jìn)特異性免疫,有助于快速打破CHB患者的免疫耐受。

    DC-CIK治療慢性乙型肝炎技術(shù),是在體外將患者單核細(xì)胞用IFN-α,IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)和擴(kuò)增為CIK后,再與用GM-CSF、IL-4等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的具有極強(qiáng)抗原呈遞功能的DC共培養(yǎng),并加入HBV特異性抗原,之后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)達(dá)到特異性殺傷乙型肝炎病毒的方法。

    本研究結(jié)果顯示,18例HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者經(jīng)DC-CIK治療后4周,HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA都有一定程度的下降,但治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明DC-CIK治療能使HBe Ag陽性乙型肝炎患者的HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA下降,具有一定的抗病毒作用。但治療后第4周還未能實現(xiàn)HBs Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換及HBV DNA 陰轉(zhuǎn),更未能實現(xiàn)HBs Ag的陰轉(zhuǎn)。其中5例(27.78%)年齡較輕者,治療前ALT較高者,效果更顯著,12周實現(xiàn)HBs Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換及HBV DNA陰轉(zhuǎn)。

    重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院任紅教授研究小組對19例CHB患者用HBsAg負(fù)載的DC疫苗進(jìn)行治療(皮下注射兩次,間隔2周),11/19(57.9%)有臨床應(yīng)答,10/19(52.6%)HBe Ag轉(zhuǎn)陰,HBV DNA平均下降101.77±2.39。其中兩例聯(lián)用拉米夫定治療的患者產(chǎn)生了完全臨床應(yīng)答[7]。解放軍三○二醫(yī)院王福生教授研究小組對21例CHB患者進(jìn)行CIK治療(輸注3次,間隔1 d),CIK治療后,血清ALT水平和HBV DNA水平呈下降趨勢,其中1例患者對拉米夫定耐藥,進(jìn)行CIK治療后,血清ALT和HBV DNA下降,持續(xù)20周,并出現(xiàn)了HBe Ag/抗-HBe的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[8]。楊莉[9]、康海燕[10]均是用DC-CIK聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎,研究結(jié)果3個月時即有ALT、HBs Ag、HBV DNA好轉(zhuǎn),6個月時效果更好;比單用干擾素效果好。韓際奧等[11]報道單用DC-CIK治療慢性乙型肝炎,24周后ALT、HBs Ag、HBV DNA都有下降,認(rèn)為DC-CIK聯(lián)合回輸有抗乙型肝炎病毒作用,可以使肝功能好轉(zhuǎn)。

    本研究DC-CIK聯(lián)合培養(yǎng)回輸,治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎(未聯(lián)合干擾素),治療后4周,在抗病毒及ALT恢復(fù)方面都顯示有效。ALT較高者、年輕者,效果較為顯著。因為回輸次數(shù)有限,觀察時間有限,還未達(dá)到理想效果。DC-CIK單用免除了注射干擾素的諸多副作用,避開了服用核苷類藥物的耐藥以及時間過長等不利因素,不失為一種患者愿意接受的方法。

    1斯崇文.對當(dāng)前慢性乙型肝炎抗病毒治療的看法.中華傳染病雜志,2005,23:73-74.

    2中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版).肝臟,2011,16:2-16.

    3Duan XZ,Zhuang H,Wang M,et al.Decreased numbers and impaired function of circulating dendritic cell subsets in patients with chronic hepatitis B infection(R2).J Gastroenterol Hepatol,2005,20:234-242.

    4Zheng BJ,Zhou J,Qu D,et al.Selective functional deficit in dendritic cell-T interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection.J Viral Hepat,2004,11:217-224.

    5Tavakoli S,Schwerin W,Rohwer A,et al.Phenotype and function of monocyte derived dendritic cells in chronic hepatitis B virus infection.J Gen Virol,2004,85:2829-2836.

    6錢峰,賀永文,朱傳武,等.慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞表型及抗原提呈能力與HBV載量的關(guān)系.肝臟,2005,10:8-10.

    7Chen M,Li YG,Zhang DZ,et al.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B:a clinical study.World J Gastroenterol,2005,11:1806-1808.

    8Shi M,Qian S,Chen WW,et al.Hepatitis B virus(HBV)antigen-pulsed monocyte-derived dendritic cells from HBV-associated hepatocellular carcinoma patients significantly enhance specific T cell responses in vitro.Clin Exp Immunol,2007,147:277-286.

    9楊莉,趙召霞,許怡,等.DC-CIK細(xì)胞療法聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎臨床研究.河北醫(yī)藥,2010,32:2647-2648.

    10康海燕,王建彬,董江龍,等.自體DC、CIK回輸聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎的臨床觀察.山東醫(yī)藥,2011,51:55-56.

    11韓際奧,馬應(yīng)杰,王志凌,等.DC-CIK治療慢性乙型肝炎患者療效觀察.肝臟,2013,18:677-679.

    2015-03-01)

    (本文編輯:易玲)

    南京市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(YKK11079)

    210003 江蘇 東南大學(xué)附屬南京市第二醫(yī)院肝病科(馮艷紅,邱潔,李麗,吳衛(wèi)鋒,常家寶,楊永峰),生物細(xì)胞室(周振先)

    馮艷紅,Email:aaa_mike@sina.com

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