乙型肝炎肝衰竭患者血清細(xì)胞因子與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

白潔　王曉霞

乙型肝炎肝衰竭患者血清細(xì)胞因子與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

白潔王曉霞

目的探討患有慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF）的患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞1/2（Th1/Th2）所分泌的細(xì)胞因子的含量，并探討其含量變化在ACHBLF中的作用。方法 收集17例本院體檢中心健康志愿者，35例患有ACHBLF以及18例患有慢性乙型肝炎（CHB）的患者的血清，利用流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)（CBA）檢測血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素4（IL4）、γ干擾素（IFNγ）、白細(xì)胞介素10（IL10）、白介素2（IL2）以及白介素6（IL6）的含量，并且分析ACHBLF患者血清內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子的變化情況。結(jié)果 健康對照組以及CHB組外周血循環(huán)中的IFNγ、IL4、TNFα以及IL6較ACHBLF顯著降低（P=0.016、0.020、0.017、0.018）。IL2和IL10在健康組和CHB組中的含量與ACHBLF患者中的含量相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ACHBLF患者血清中的凝血酶原活動度（PTA）、總膽紅素（TBil）以及白蛋白（Alb）的含量與IFNγ、IL4、IL6以及TNFα的含量之間沒有顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論 可能ACHBLF患者病情發(fā)展與血清中的細(xì)胞因子IL6、IFNγ、IL 4以及TNFα有一定的相關(guān)性，沒有發(fā)現(xiàn)肝功能與上述細(xì)胞因子之間的相關(guān)關(guān)系。CBA可以應(yīng)用于對各種細(xì)胞因子的檢測。

慢加急性乙型肝炎肝衰竭；流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)；細(xì)胞因子

慢加急性乙型肝炎肝衰竭（ACHBLF），即由慢性乙型肝炎（CHB）發(fā)展而成的急性肝衰竭，屬于重型慢性乙型肝炎。ACHBLF的病死率高達70％，是慢性重型肝炎中比較常見的一種疾病，通常起病急，預(yù)后差。ACHBLF的具體發(fā)病機制目前尚未闡明，但是相當(dāng)復(fù)雜，很多的ACHBLF患者都是由于感染病毒，病毒在機體內(nèi)活動活躍，使機體的免疫力下降，繼而產(chǎn)生大面積的炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致病情加重。在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的輔助性T細(xì)胞（Th），通過誘導(dǎo)其它重要的免疫細(xì)胞的活化而在機體中發(fā)揮重要的作用。Th細(xì)胞可以分為兩個亞群，Th1和Th2亞群，這兩個亞群的細(xì)胞在正常情況下處于一定的平衡狀態(tài)，Th1、Th2分泌的細(xì)胞因子相互抑制，使彼此都不會大幅度的升高或者降低。但是在病理情況下Th1、Th2常失衡。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞免疫損傷與乙型肝炎病毒（HBV）的持續(xù)性感染以及Th1、Th2的失衡有關(guān)。但目前對Th1、Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子的研究多采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA），該方法樣本需求量很大，每次又只能檢測一種因子，無法真實地反映各種細(xì)胞因子之間的聯(lián)系?，F(xiàn)代化的研究需要一種更加高效，低用量的方法來對細(xì)胞因子進行檢測。流式細(xì)胞微球芯片捕獲術(shù)（cytometric beadar ray，CBA）高通量、精確性高，最大的優(yōu)點是可以同時檢測很多種細(xì)胞因子。本研究通過運用CBA檢測患者Th1，Th2分泌的細(xì)胞因子的含量來探究患有ACHBLF患者的肝功能指標(biāo)與細(xì)胞因子變化的聯(lián)系。

資料和方法

一、臨床資料

收集2014年1月到12月本院患有ACHBLF的患者35例，女6例，男29例。CHB患者18例，女8例，男10例。另外收集本院體檢中心的17名健康志愿者作為對照組，女7名，男10名?；颊呷朐? d后清晨空腹取靜脈血，檢測其HBV DNA，血液學(xué)，HBV血清學(xué)標(biāo)志物以及肝功能等相關(guān)指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)為藥物性肝病，病毒感染，自身免疫性疾病，酒精性肝病，原發(fā)性肝癌、惡性腫瘤以及合并甲、丙、戊型肝炎病毒感染。所有參與研究的志愿者以及患者，須確保在3個月內(nèi)沒有使用過免疫調(diào)節(jié)藥物。

二、研究方法

將Th1/Th2細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品溶解在2.0 m L稀釋液中，在室溫靜置15 min以后稀釋。稀釋方法：取300μL的稀釋液加入300μL的標(biāo)準(zhǔn)液，混勻，此時就是進行了1∶2稀釋。使用倍比稀釋依次進行1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256以及1∶512的倍數(shù)進行稀釋。將6種捕獲了細(xì)胞因子的磁珠等體積混勻，取50μL于分析管里。依次加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品、50μL血清樣本以及50μL藻紅蛋白，混勻以后避光室溫放置3 h。再加入1 m L的洗液，200×g離心5 min。加入300μL的洗液使磁珠懸浮，上儀器前震蕩3～5 s。分析采集的圖譜用Cell Quest軟件，而將分析結(jié)果換算成濃度則使用BD FACSComp軟件。Alb、ALT、TBil、PTA等均在本院檢驗中心檢測，而HBV DNA以及HBV血清學(xué)標(biāo)志物等均在本實驗室進行檢驗。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析。使用ANOVA方差分析進行組間比較，運用（ˉx±s）的形式表示正態(tài)分布資料，用Pearson的方法進行臨床指標(biāo)與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、健康對照者及患者的基本臨床資料

對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的臨床資料進行比較。在TBil、ALT以及HBV DNA方面的比較結(jié)果顯示，ACHBLF組的血清中TBil、ALT的含量明顯高于健康對照組和CHB組（P=0.023、0.012），HBV DNA低于其它兩組（P＜0.001），見表1。

表1　健康對照者及患者臨床基本資料

二、健康對照組、CHB組以及ACHBLF組血清中Th1、Th2細(xì)胞因子含量的變化

標(biāo)準(zhǔn)品共9個濃度點，整個過程由計算機自動處理，曲線的適配度在95％以上，曲線見圖1。

三、CBA檢測健康對照者與患者細(xì)胞因子濃度對照

對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的血清細(xì)胞因子濃度進行比較。在IL10、IL6、IFNγ、TNFα、IL2以及IL4等方面的比較結(jié)果顯示，ACHBLF組的血清中含量明顯高于健康對照組和CHB組（P=0.014、0.018、0.016、0.017、0.015、0.020），見表2。

四、ACHBLF患者血清中的IFNγ、TNFα及IL4、IL6與TBil、Alb及PTA的相關(guān)性分析

ACHBLF患者中，反映肝功能與血清內(nèi)IFNγ、TNFα及IL4、IL6的含量無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。對TBil、Alb、PTA分別與IFNγ、IL4、IL6、TNFα的相關(guān)性進行了Spearman分析，統(tǒng)計結(jié)果見表3。

圖1Th1、Th2細(xì)胞因子擬合曲線

表2　CBA檢測健康對照與患者細(xì)胞因子濃度

表3ACHBLF患者血清中IFNγ、TNFα及IL4、IL6 與TBil、Alb及PTA相關(guān)數(shù)據(jù)的r值

討　論

T淋巴細(xì)胞可以被分為不同種類，相同的種類又可以分為不同亞群［1］。不同種類的細(xì)胞之間依靠所分泌細(xì)胞因子的不同而相互促進，相互制約，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、Th2和Th1［2］。T淋巴細(xì)胞還在宿主移植排異、感染性及很多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義。近年來，已經(jīng)有很多研究表明，HBV和HCV的感染過程中有T淋巴細(xì)胞的參與，且在HBV感染中影響頗大的Th1和Th2可能影響HBV感染后機體的結(jié)局［3］。

細(xì)胞因子在抵抗內(nèi)源性以及外源性的抗原和調(diào)節(jié)機體自身的狀態(tài)需求時起到非常重要的作用。細(xì)胞因子是由體內(nèi)的細(xì)胞合成以及分泌的多肽。現(xiàn)在檢測細(xì)胞因子的技術(shù)有3種：（1）分子雜交檢測；（2）生物活性檢測；（3）免疫學(xué)直接定量細(xì)胞因子［4］。目前最常用的檢測方法是ELISA，因生物活性檢測以及雜交檢測要求的實驗條件較高，不是所有的實驗室均能滿足其所需條件。ELISA具有經(jīng)濟，操作簡單等優(yōu)點，但同時也有缺點，它樣本需求量大，精確性低，且1次只能檢測1種細(xì)胞因子，耗時耗力。CBA是一種多重蛋白的液相定量檢測技術(shù)，其基本原理為：首先要形成捕獲微球，具體做法是在微球上包被捕獲的不同熒光強度的抗體，接著和樣本溶液混合，樣本中能與微球上的抗體特異性結(jié)合的蛋白或者抗原就會結(jié)合到微球上，然后加入已經(jīng)熒光標(biāo)記過的檢測抗體，最后放上流式細(xì)胞儀對其進行檢測［5］。和傳統(tǒng)的ELISA法相比，CBA具有很多優(yōu)點：（1）所需的樣本量大大降低，為傳統(tǒng)檢測的1/6；（2）可以同時檢測很多種蛋白，因它是分別針對不同的抗體，且使用了在熒光強度方面各有不同的微球群；（3）穩(wěn)定性好，有效避免了酶聯(lián)放大技術(shù)容易出現(xiàn)的假陽性［6］。

感染HBV的機體通過正常免疫應(yīng)答來抵御HBV的繼續(xù)入侵。在受到抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞立即分化為Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。CTL主要通過分泌TNFα以及IFNγ等來清除病毒，通過介導(dǎo)非溶解細(xì)胞途徑，另一方面也可以通過溶解受感染的細(xì)胞來清除靶病毒［7］。由于Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IL2以及IFNγ，Th1細(xì)胞占優(yōu)勢時，有利于完全清除病毒［8］。Th2細(xì)胞分泌的IL4以及IL10等，可以介導(dǎo)體液免疫以及抑制Th1的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，此時可以使病毒感染呈現(xiàn)緩慢的趨勢［9］。當(dāng)機體的免疫應(yīng)答異常以及病毒攻擊重癥肝炎患者時，患者體液免疫功能亢進、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞的活性增高。此時CTL細(xì)胞增殖分化增多，大量炎癥細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞，浸潤肝組織，使大量的肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死。

IL2必須與靶細(xì)胞膜表面的IL2受體raiL-2R結(jié)合才能發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能［11］?；加蠥CHBLF的患者，細(xì)胞膜上sIL2R的含量與正常對照組相比顯著升高。sIL2R是活化的淋巴細(xì)胞膜上raiL-2R的a鏈，它和rai L-2R一樣，可以結(jié)合血液中的IL2，此時血液中的IL2本來含量已經(jīng)降低，加上sIL2R的競爭結(jié)合作用，封閉了細(xì)胞因子，使免疫系統(tǒng)功能紊亂加劇，免疫功能更加低下，病情加重［12］。而HBV，HCV等的持續(xù)感染使機體產(chǎn)生更多sIL2R，使很多淋巴細(xì)胞又被活化，且這種活化效應(yīng)是不正常的，會使病情惡化［12］。此時大量庫普弗細(xì)胞活躍增生，單核巨噬細(xì)胞大面積浸潤，IL6產(chǎn)生增多，而肝臟此時清除IL6的功能已經(jīng)減弱，清除效果不理想。

在重癥肝炎中，IFNγ起到非常重要的作用。當(dāng)Th1呈現(xiàn)優(yōu)勢應(yīng)答時，IFNγ的表達水平較高，是引起肝細(xì)胞壞死的重要原因。重癥肝炎時，TNFα不僅可以通過細(xì)胞免疫激活體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNFα，還可以激活CTL細(xì)胞，激活其殺傷作用［13］。此外，它還可以使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，通過中性粒細(xì)胞的粘附作用。本研究中，ACHBLF組患者的血清IFNγ以及TNFα顯著升高，而在CHB組以及健康對照組的血清中，IFNγ和TNFα的含量則非常低。通過分析，造成這一結(jié)果的原因可能是重癥肝炎時分泌了較多的IFNγ和TNFα，T細(xì)胞要清除病毒的感染，從而造成了大量肝細(xì)胞的損傷，也使HBV DNA的含量下降。另外一種可能的原因就是ACHBLF患者很容易合并感染，而TNFα是一種促炎因子，感染會使它的含量急劇升高［14］。TNFα和IL4相互協(xié)調(diào)，共同介導(dǎo)炎癥的發(fā)展，兩者共同升高可以反映全身或者局部感染存在［15］。本研究證實，肝炎時TNFα的血清濃度變化趨勢與IL6與IL4相同，可能是由于肝炎患者多合并全身或者局部的感染，促炎因子的升高，發(fā)生級聯(lián)瀑布反應(yīng)，但具體原因還有待進一步觀察。

本研究分析了凝血因子全套指標(biāo)以及肝功能衰竭指標(biāo)ALb、TBil等與Th1、Th2細(xì)胞因子的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者并無顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。同時可能由于機體啟動了免疫反應(yīng)，使促炎因子和免疫抑制因子含量急劇升高，使Th1、Th2的變化不完全符合規(guī)律。CBA的特異性以及敏感性，還需要進一步的驗證。同時上述假設(shè)還需要擴大病例進行研究。由于本研究僅限于分析外周血中細(xì)胞因子的變化情況，但是外周血中的細(xì)胞因子具有多源性，所以它的含量變化并不能直接反映肝臟中Th1、Th2細(xì)胞因子的含量變化情況，因此有待進一步檢測肝臟中細(xì)胞因子的含量來反映患者的細(xì)胞因子變化情況。

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2015-04-16）

（本文編輯：易玲）

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