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    茯苓中多糖含量的測(cè)定方法研究*

    2015-10-16 01:04:53張文芳陳丹紅
    福建輕紡 2015年5期
    關(guān)鍵詞:濃硫酸水楊酸總糖

    張文芳,陳丹紅

    (福建省測(cè)試技術(shù)研究所, 福建 福州 350003)

    茯苓中多糖含量的測(cè)定方法研究*

    張文芳,陳丹紅

    (福建省測(cè)試技術(shù)研究所, 福建 福州 350003)

    篩選分光光度法測(cè)定茯苓中多糖含量的最優(yōu)條件,以便快速準(zhǔn)確地進(jìn)行茯苓產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法:采用苯酚—濃硫酸比色法測(cè)定茯苓中總糖含量;采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色定糖法測(cè)還原糖含量,相減得多糖含量;同時(shí)分別從水浴時(shí)間,苯酚和濃硫酸用量等方面考察最優(yōu)條件;進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方面試驗(yàn)。結(jié)果:茯苓總糖測(cè)定的最優(yōu)條件為6%苯酚1.0ml,濃硫酸5.0ml,沸水浴15 min;回歸方程為回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0056x,R2=0.9943;測(cè)茯苓還原糖的回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7720x,R2=0.9903。方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,可用作茯苓中多糖含量的測(cè)定。

    茯苓;總糖; 還原糖; 多糖;紫外分光光度法

    茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,為我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材,具有祛濕利尿、健脾和胃、補(bǔ)體強(qiáng)身、安神寧心的作用。茯苓主要化學(xué)成分為茯苓多糖、三萜類、樹膠、蛋白質(zhì)和脂肪酸等化合物等。中外學(xué)者對(duì)茯苓的化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其所含的多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等,都有著密切的關(guān)系。大量研究表明植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效,而且對(duì)機(jī)體幾乎沒有毒性。天然多糖化合物作為一種免疫調(diào)節(jié)劑已越來越多地用于腫瘤、肝炎等疾病的治療和康復(fù)。而艾滋病的肆虐更使天然多糖化合物特別是它的強(qiáng)抗病毒活性的衍生物,成為科學(xué)家們尤其是藥物學(xué)家們高度重視的對(duì)象。茯苓中多糖的含量與藥效的關(guān)系極大,建立茯苓多糖的分析測(cè)定體系對(duì)于茯苓藥材的內(nèi)在質(zhì)量控制具有重要意義。文章與以前僅采用采用苯酚—濃硫酸體系測(cè)總糖的方法不同,扣除了還原糖的含量,得到茯苓多糖的真實(shí)含量。該方法簡(jiǎn)便、快速,可為進(jìn)一步研究茯苓種植質(zhì)量和藥理活性提供分析數(shù)據(jù)。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器(表1)

    1.2 試劑

    苯酚,濃硫酸:上?;瘜W(xué)試劑有限公司,分析純;其余均為化學(xué)純,市售。

    表1 實(shí)驗(yàn)儀器

    2 方法及結(jié)果

    2.1 茯苓多糖測(cè)定方法的研究

    2.1.1 原理

    提取液中不僅含有多糖,還含有一些還原糖如單糖和寡糖,由于無法直接測(cè)得溶液中多糖的含量,因此用苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量,DNS法測(cè)得還原糖含量,然后兩者相減即得多糖含量。

    茯苓多糖=茯苓總糖-茯苓還原糖

    2.1.2 茯苓總糖測(cè)定---采用苯酚硫酸法

    2.1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

    苯酚-硫酸試劑可與游離的單糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起顯色反應(yīng),己糖在490 nm(戊糖以及糖醛在480 nm)處有最大吸收,吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測(cè)定。

    2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

    (1)取9支干凈的試管,然后按照表2提供的數(shù)據(jù)加樣。

    (2)加完樣后靜置20min,待顯色穩(wěn)定

    (3)以0號(hào)試管為空白對(duì)照,于490 nm下測(cè)溶液的吸光值。

    (4)樣品含量的測(cè)定:取一定量的待側(cè)樣品,加水補(bǔ)足2 mL,按上述步驟,測(cè)490 nm的光密度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

    2.1.2.3 苯酚硫酸法測(cè)總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0056x,R2=0.9943。

    2.1.3 還原糖含量測(cè)定

    采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色定糖法

    2.1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

    還原糖是指含自由醛基或酮基的單糖(如葡萄糖)和某些具有還原性的雙糖(如麥芽糖)。它們?cè)趬A性條件下,可變成非?;顫姷南┒?。遇氧化劑時(shí),具有還原能力,烯二醇本身則被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。黃色的3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑與還原糖在堿性條件下共熱后,自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),反應(yīng)液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比,在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定溶液的吸光度,查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算,便可求得樣品中還原糖的含量。(DNS溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物,在一定的范圍內(nèi)還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定的比例關(guān)系。(該方法操作簡(jiǎn)單,快速,雜質(zhì)干擾較少)。

    表2

    圖1 苯酚硫酸法測(cè)總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑:

    甲液:溶解6.9 g結(jié)晶酚于15.2 mL10%氫氧化鈉溶液中,并用水稀釋至69 mL,在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。

    圖2 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)測(cè)還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    乙液:稱取255 g酒石酸鉀鈉加到300 mL10%氫氧化鈉溶液中,再加入880 mL1%3,5-二硝基水楊酸溶液。

    將甲乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用。在室溫放置7~10d以后使用。

    2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

    (1) 取9支干凈的試管,編號(hào)0~8,分別按照表3加入試劑。

    (2)加完樣后在沸水浴中加熱5min,取出,然后立即用流動(dòng)冷水冷卻。

    (3)待樣品冷卻完全后每管中加入21.5 mL蒸餾水,充分搖勻。

    (4)以0號(hào)管為空白對(duì)照,于520 nm下測(cè)光吸收值。

    (5)樣品含量的測(cè)定:取一定量的待側(cè)樣品加水補(bǔ)足2 mL,按上述步驟,測(cè)得其520 nm的光吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可算出還原糖含量。

    表3

    2.1.3.4 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)測(cè)還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)

    回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7720x,R2=0.9903。

    2.2 茯苓多糖測(cè)定方法的優(yōu)化

    2.2.1 對(duì)照品溶液制備:精密稱取105℃干燥 恒重的葡萄糖50mg與50ml容量瓶中用水溶解并定容,搖勻。精密吸取5ml于50ml容量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得 0.1mg.mL-1的對(duì)照品溶液。

    2.2.2 苯酚用量選擇:精密稱取對(duì)照品溶液各1.0ml的5份,分別加入6%苯酚0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4 mL,混勻,每份分別緩慢加入濃硫酸5 mL并攪拌,充分搖勻,靜至5min后再置沸水浴中 加熱15min,取出,冷卻至室溫,在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表4。選擇6%苯酚用量為1.0 mL。

    2.2.3 濃硫酸用量選擇:精密稱取對(duì)照品溶液1.0ml的5份,各加入6%苯酚1.0ml,分別緩慢加入濃硫酸4.0,4.5 , 5.0,5.5,6 mL,并攪拌,充分搖勻,靜至5min后再置沸水浴中 加熱15min,取出,冷卻至室溫,在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表5。選擇濃硫酸用量為5.0 ml。

    2.2.4 水浴時(shí)間選擇:精密稱取對(duì)照品溶液1.0mL的5份,各加入6%苯酚1.0mL,分別緩慢加入濃硫酸5.0 mL 并攪拌,充分搖勻,靜至5min后再置沸水浴中加熱分別為5、10、15、20、25min,取出,冷卻至室溫,在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表6。選取水浴時(shí)間為15min。

    2.2.5 樣品的測(cè)試及精密度實(shí)驗(yàn): 稱取同一批茯苓粉末(過60目篩)各1.0g 6份,按上述測(cè)定總糖和還原糖方法測(cè)定后相減得多糖含量,平行測(cè)定茯苓多糖含量為0.725 mg.mL-1,RSD為1.07%(n=6),結(jié)果見表7,表明精密度良好。

    2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)偏差: 稱取同一批茯苓粉末(過60目篩)各1.0g 3份,分別加入葡萄糖供試品10 mL(1 mg.mL-1)的母液。按最優(yōu)的測(cè)定條件測(cè)總糖和還原糖,測(cè)定后相減得多糖含量,平行測(cè)定3次茯苓多糖的回收量,計(jì)算得平均回收率為:102.39%,RSD為0.36%(n=3),表明回收率良好,結(jié)果見表8。

    表4 6%苯酚不同用量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表5 濃硫酸不同用量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表6 水浴不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn):精確稱取同一供試液1 mL,按含量測(cè)定方法的最佳條件操作,以試劑空白作對(duì)照,每隔30min 測(cè)一次吸光度,考察樣品3h內(nèi)的穩(wěn)定性,結(jié)果表明供試樣品在3小h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

    3 結(jié)論

    采用苯酚—濃硫酸比色法測(cè)定茯苓中總糖含量;采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色定糖法測(cè)還原糖含量,相減得多糖含量;建立的這個(gè)方法體系測(cè)量結(jié)果比用苯酚—濃硫酸比色法算多糖的結(jié)果更精確;方法的重現(xiàn)性,穩(wěn)定性,精密度,回收率都達(dá)到了檢測(cè)要求,該方法未見報(bào)道可作為茯苓產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控的有效方法。

    表7 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表8 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

    [1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草上冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999,554.

    [2]仲兆金,劉浚.分光光度法測(cè)定茯苓有效成分的最優(yōu)條件研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,1.10(2):17-18.

    [3]張思番,劉靜涵,蔣建勤,周詠梅.茯苓化學(xué)成分和藥理作用及開發(fā)利用[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2005,18(2):227-230.

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    [5]胡明華,梁永威,彭川叢 .不同產(chǎn)地不同規(guī)格的茯苓水溶性多糖含量比較[J].中國(guó)藥業(yè),2012,21(7):10-11.

    [6]沈玉萍,李軍,賈曉斌.中藥茯苓化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28.(3):297-300.

    [7]周燕霞,唐明林,殷輝安,等.茯苓中多糖的提取及含量測(cè)定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,15(4):330-333.

    O652

    A

    1007-550X(2015)05-0035-05

    10.3969/j.issn.1007-550X.2015.05.002

    *福建省科技廳項(xiàng)目----‘茯苓產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研制 ’(2011R1007-4)資助。

    2015-04-13

    張文芳(1963-),女,工程師。

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