吸入氫氣對膿毒血癥大鼠急性肺損傷的影響

滕娜等

[摘要] 目的 探討吸入氫氣（H2）對膿毒血癥大鼠急性肺損傷的影響。 方法 選取雄性SD大鼠40只，體重200～250 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組（n = 10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1% H2組和2% H2組。采用CLP法制備膿毒血癥模型。1% H2組與2% H2組于CLP術(shù)后12 h分別吸入1% H2與2% H2 2 h。結(jié)束后，采集股動(dòng)脈血樣行血?dú)夥治觯?jì)算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；測定血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平；隨后處死大鼠取肺組織，檢測肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）、核因子-кB（NF-κB）、髓過氧化物酶（MPO）活性；光鏡下觀察肺組織病理改變。 結(jié)果 與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2降低，血漿中HMGB1、IL-6水平升高，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平升高，病理學(xué)損傷明顯加重（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2升高，血漿中HMGB1、IL-6水平降低，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平降低，病理學(xué)損傷也減輕（P < 0.05），1% H2組和2% H2組上述各指標(biāo)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 吸入H2能夠減輕膿毒血癥引起的急性肺損傷，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氫氣；膿毒血癥；大鼠；肺損傷

[中圖分類號] R631 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（a）-0008-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of hydrogen （H2） inhalation on acute lung injury in rats with sepsis. Methods Forty healthy male SD rats （weighing 200-250 g） were randomly divided into 4 groups （n = 10） using a random number table： sham operation group （SH group）， cecal ligation and puncture group （CLP group）， 1% H2 group， 2% H2 group respectively. Sepsis model was produced by CLP. 1% H2 and 2% H2 group received 2 h inhalation of 1% H2 and 2% H2 at 12 h after CLP， respectively. At the end of hydrogen inhalation， blood samples were obtained for blood gas analysis. PaO2/FiO2 was calculated and the levels of high mobility group protein 1 （HMGB1）， interleukin-6 （IL-6） were determined. The rats were then sacrificed and lungs were immediately removed for determination of the activity of Toll-like receptors-4 （TLR-4）， nuclear factor kappa B （NF-κB） and myeloperoxidase （MPO）； pathology assessment of lung was done under light microscope. Results Compared with SH group， PaO2/FiO2 was significantly decreased， plasma levels of HMGB1， IL-6 increased， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs increased， and the pathological injury was significantly aggravated in CLP group， 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. Compared with CLP group， PaO2/FiO2 increased significantly， levels of HMGB1， IL-6 in plasma decreased markedly， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs decreased， and the pathological injury was reduced in 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. There were no significant differences of the above indexes between 1% H2 group and 2% H2 group （P > 0.05）. Conclusion Hydrogen inhalation can alleviate sepsis induced ALI in rats， and its mechanism may be related to inhibiting inflammatory response.

[Key words] Hydrogen； Sepsis； Rat； Lung injury

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以急性肺部炎癥及肺泡毛細(xì)血管屏障功能損傷為主要特征的危及生命的臨床綜合征。膿毒血癥是引起ALI最主要原因之一[1-2]，目前尚沒有有效的藥物治療措施。研究表明，氫氣（H2）或含有H2的溶液具有選擇性抗氧化、抗炎癥等臟器保護(hù)作用[3-6]。本研究探討吸入H2對大鼠膿毒血癥肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠[購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批號為SCXK（蘇）2011-0003]40只，SPF級，體重200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組（n = 10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1% H2組和2% H2組。

1.2 動(dòng)物模型制作

參照文獻(xiàn)[7]的方法建立CLP模型，沿大鼠腹正中線做一長為1 cm的切口，游離腸系膜和盲腸，用4-0絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，用18號針頭貫通穿刺盲腸結(jié)扎端，擠出少許糞便，后將盲腸還納至腹腔，逐層縫合腹壁切口。SH組僅剖腹，分離盲腸遠(yuǎn)端，逐層關(guān)腹。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)[8]使用M177021H2發(fā)生器（北京中西遠(yuǎn)大公司）提供H2，其純度為99.999%。將大鼠放入帶有進(jìn)氣口和出氣口的密封箱子內(nèi)，將H2和空氣混合后從進(jìn)氣口輸入箱內(nèi)，殘余氣體從出氣口收集。用泵吸式JSA8-H2高敏氫氣檢測儀（深圳吉順安科技有限公司）通過通氣管路調(diào)定吸入H2濃度。1% H2組和2% H2組于CLP術(shù)后12 h時(shí)分別吸入1%的H2和2%的H2 2 h，SH組與CLP組只放置于箱子內(nèi)，不吸入H2。

1.4 取材及處理方法

吸H2 2 h后，四組分別采集動(dòng)脈血樣3 mL，1 mL用于進(jìn)行血?dú)夥治?，采用i-STAT300型血?dú)夥治鰞x（Abbott公司，美國），計(jì)算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；另外2 mL，于4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。隨后處死大鼠，取左肺組織勻漿，4℃ 10 000 r/min離心15 min，離心后取上清液，采用ELISA測定肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）含量（試劑盒購自于美國R&D公司）及髓過氧化物酶（MPO）活性（試劑盒購自南京建成科技有限公司）。嚴(yán)格按照說明書操作。取右肺組織，置于10%福爾馬林中固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理改變情況并參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行病理學(xué)損傷評分，1分：肺組織結(jié)構(gòu)正常；2分：肺間質(zhì)輕度充血和中性粒細(xì)胞浸潤；3分：肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，血管周圍水腫形成，中度中性粒細(xì)胞浸潤；4分：肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量中性粒細(xì)胞浸潤。隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野進(jìn)行評分，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠PaO2/FiO2及肺組織病理學(xué)評分比較

與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2降低，病理學(xué)損傷明顯加重（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2升高，病理學(xué)損傷明顯減輕（P < 0.05）。1% H2組和2% H2組組間上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 四組大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)比較

與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性明顯升高，血漿中HMGB1、IL-6水平增高（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性降低，血漿中HMGB1、IL-6水平降低（P < 0.05），1% H2組和2% H2組組間上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

ALI是感染、休克及創(chuàng)傷等多種原因引起的嚴(yán)重的肺部病理性改變，進(jìn)一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。據(jù)資料顯示，ALI/ARDS是重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)患者死亡的主要原因之一[10]。目前只能采用支持治療，尚無根治性治療措施。目前的研究認(rèn)為膿毒血癥是導(dǎo)致ALI/ARDS的重要原因，而CLP是誘發(fā)膿毒血癥的經(jīng)典方法，已廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究[11-13]。本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，術(shù)后10～12 h，大鼠開始出現(xiàn)活動(dòng)減少、豎毛、蜷縮、呼吸急促等；同時(shí)，研究結(jié)果表明，炎癥因子水平明顯增高，提示膿毒血癥模型制備成功；CLP后PaO2/FiO2降低，肺組織病理學(xué)損傷評分升高，提示膿毒血癥誘發(fā)ALI的模型制備成功；而吸入H2后PaO2/FiO2升高，肺組織病理學(xué)損傷評分降低，提示吸入H2可以減輕大鼠膿毒血癥誘發(fā)的ALI。

中性粒細(xì)胞浸潤是引起ALI的重要原因之一[14-15]。肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤和激活在一定程度上決定了ALI的程度，大量中性粒細(xì)胞黏附聚集于肺組織毛細(xì)血管內(nèi)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，可導(dǎo)致肺損傷；中性粒細(xì)胞活化后透過呼吸暴發(fā)及脫顆粒作用，加重肺組織損傷[16]。MPO作為中性粒細(xì)胞的特異性酶，其活性可反映中性粒細(xì)胞的聚集浸潤程度[17]。本研究結(jié)果提示，與CLP組比較，吸入H2組MPO活性降低，表明H2通過抑制組織中的MPO浸潤從而減輕炎性反應(yīng)。

TLR-4是誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的門戶蛋白，研究提示它在多種病理反應(yīng)中起重要作用[18-19]。CLP產(chǎn)生的內(nèi)毒素刺激機(jī)體釋放大量的HMGB1釋放入血[20]，HMGB1作為TLR-4的內(nèi)源性配體，可激活TLR-4信號通路，通過多種途徑使NF-кB活化，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子IL-6的釋放[21]。本研究結(jié)果表明CLP導(dǎo)致肺組織中的TLR-4、HMGB1、NF-кB的表達(dá)增加，血漿中的IL-6水平上升。吸入H2可以降低TLR-4、HMGB1、NF-кB及血漿中的IL-6水平。

H2無色無味，含量非常豐富。作為一種抗氧化物質(zhì)，H2具有準(zhǔn)備簡單、無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)大量的研究表明H2能夠改善各種因素導(dǎo)致的器官功能障礙[3-6]，因此H2治療有著非常廣泛的應(yīng)用前景；當(dāng)H2濃度大于4.6%時(shí)有爆燃的風(fēng)險(xiǎn)[8]，為安全起見，筆者只采用了低濃度的H2吸入作為治療手段，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，吸入H2能夠明顯減輕膿毒血癥引起的ALI，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2015-04-25 本文編輯：張瑜杰）