幽門螺桿菌通過其優(yōu)勢蛋白組分活化肥大細胞的致病機制研究

吳登艷，杜茂濤，譚燃景

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種常見的致病性微需氧革蘭氏陰性桿菌，全世界人口中Hp感染率已過半。在病理狀態(tài)下，Hp定植于胃黏膜上皮細胞、進一步釋放毒力因子并引起機體強烈的免疫和炎癥反應(yīng)，它的感染與多種類型胃炎、消化性潰瘍以及胃癌等疾病密切相關(guān)，但其致病機制尚未完全明確[1]。肥大細胞作為一種胃腸道粘膜固有層細胞，在細菌防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，大量研究表明，在Hp感染相關(guān)性疾病中，胃腸道粘膜中肥大細胞的數(shù)量和活性均增加[2-3]，提示肥大細胞的活化在Hp感染的致病過程中發(fā)揮重要作用。因此，探究Hp對肥大細胞的活化作用對于揭示Hp感染相關(guān)性疾病的發(fā)病機制具有重要的意義。

雖然已有研究揭示Hp的空泡毒素(VacA)和中性粒細胞激活蛋白(NAP)對肥大細胞有激活作用[4-6]，后者的活化可釋放組胺，合成β-氨基己糖苷酶以及分泌IL-3、TNF-α、IFN-γ等多種炎性因子[7-9]，參與Hp致病，但目前關(guān)于Hp對肥大細胞作用的研究僅停滯于極個別蛋白水平，Hp全菌及其蛋白組分對人肥大細胞的活化作用尚缺乏系統(tǒng)性的分析和研究。

因此，本研究擬同時評估3種Hp全菌制劑：Hp的尿素裂解液(能使細菌充分裂解，蛋白充分變性，能較好的部分模擬在體激活方式。尿素裂解液具有不電離，呈中性，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀，利于分子篩組份篩選)、Hp的超聲裂解上清(細菌裂解充分，大分子蛋白容易斷裂，即單純?nèi)呀獾鞍椎捏w外激活)、福爾馬林滅活(細菌充分滅活，模擬死亡細菌的激活作用)的Hp對人LAD2肥大細胞株的直接活化作用；并用分子篩將Hp全菌尿素裂解液分解成30個連續(xù)分子量梯度的蛋白組分，擬從Hp全菌蛋白層面篩選出對LAD2肥大細胞活化效力最強的蛋白質(zhì)組分，并模擬肥大細胞活化的即刻反應(yīng)和延遲效應(yīng)，評價最強蛋白組分對肥大細胞潛在的炎性介質(zhì)釋放的劑量依賴和時間依賴作用，同時擬用液相色譜-質(zhì)譜分析方法明確最強-蛋白組分的具體成分；為進一步全面揭示Hp感染的致病機制提供依據(jù)，為治療Hp感染提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1Hp培養(yǎng)及不同細菌制劑的制備

1.1.1細菌培養(yǎng) Hp26695(ATCC○R700392 )菌株的擴增培養(yǎng)[10]：將菌株保種液均勻涂布于Hp固體培養(yǎng)基(P0701哥倫比亞血瓊脂平板，重慶龐通生物有限公司)上，5% O2、10% CO2、85% N2、37 ℃培養(yǎng)48 h。長出菌落后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的布氏肉湯液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)分裂期。

1.1.23種Hp全菌制劑的制備

1.1.2.1Hp尿素裂解液 PBS緩沖液重懸洗滌菌液3次后離心，取適量菌體沉淀，加入8 mol/L尿素溶液。

1.1.2.2Hp超聲裂解上清/可溶性Hp超聲裂解物 將收集的菌體重懸于PBS中，置于冰水混合浴中超聲裂解(80 W，10 min)。將裂解后懸液于4 ℃低溫離心(10 000 g×5 min)，收集離心后上清，BCA法試劑盒(Sigma-Aldrich, USA)測定蛋白濃度。

1.1.2.3福爾馬林滅活的Hp 將Hp菌體沉淀用0.3%福爾馬林溶液重懸，并置于慢速搖床37 ℃孵育6 h，用PBS反復(fù)重懸洗滌3次后制備成Hp-PBS懸液。

1.1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real time quantility Polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Hp菌量 參考文獻[11]設(shè)計16S rRNA上游引物：5′-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3′, 16SrRNA下游引物：5′-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3′, Hp16sRNA probe, FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA)。根據(jù)Premix ExTaq試劑盒(Takara，寶生生物)說明加入Hp菌體模板、上游引物、下游引物和探針進行反應(yīng)。qRT-PCR條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s，共行39次循環(huán)；采集熒光。根據(jù)標準品16s RNA濃度的LOG值及CT值繪制標準曲線方程，并計算每個標本的實際菌量。

1.1.4Hp尿素裂解液中脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的去除與檢測[12]使用Triton X-114兩相分離技術(shù)去除Hp尿素裂解液中的LPS。將1%的Triton X-114與Hp尿素裂解液在0 ℃下混合5 min，以確保溶液均勻。37℃孵育5 min，形成兩相。觀察分層，離心取上清。分別用凝膠過濾和透析去除殘留的Triton X-114，并對去除后裂解液中的LPS含量進行檢測(Triton X-114 3次去除后，LPS的含量低于鱟試劑的檢測限)。

1.1.5Hp蛋白組分(Protein components，PCs)的制備 將三氯乙酸加入到已去除LPS的Hp尿素裂解液中，調(diào)整三氯乙酸至10%濃度，4 ℃條件下過夜使蛋白組份充分沉淀，離心后再將此沉淀通過透析去除三氯乙酸。利用分子篩通過連續(xù)離心將上一步純化后Hp裂解液分離成具有不同分子量梯度范圍的30個PCs，用BCA法試劑盒測定每種PC蛋白濃度，同時取樣行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳并凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.23種Hp制劑及其PCs對人LAD2肥大細胞株的直接活化作用的檢測

1.2.1LAD2肥大細胞株培養(yǎng) 將人LAD2肥大細胞株(NIH, USA)用含2 mmol/L谷氨酰胺、100 ng/mL人干細胞生長因子(Peprotech, UK)及青-鏈霉素的無血清StemPro-34培養(yǎng)基(Invitrogen Gibco, USA)于 37 ℃、5% CO2，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔1～2 d半量換液1次。約7～10 d細胞進入對數(shù)生長期，可用于下一步實驗。

1.2.23種Hp全菌制劑對LAD2肥大細胞活化作用的檢測

1.2.2.13種Hp制劑預(yù)處理LAD2肥大細胞 將3種Hp制劑稀釋成不同的濃度梯度，分別和終濃度為1×106/mL的LAD2細胞共培養(yǎng)30 min，3種細菌制劑的終濃度分別為：Hp尿素裂解液及超聲裂解上清(50、100、150、200 μg/mL)，福爾馬林滅活的Hp[(1.25、2.5、5.0、10) ×107CFU/mL]。陽性對照為1 μmol/L伊屋諾霉素(Sigma, USA)和LAD2肥大細胞共培養(yǎng)體系[13]，陰性對照為加入等量PBS的LAD2肥大細胞培養(yǎng)體系。同時，為了排除尿素對LAD2肥大細胞的影響，也檢測了終濃度為80、160、320、640 μmol/L的尿素溶液與1×106/mL LAD2肥大細胞的共培養(yǎng)體系。以上每個體系終體積為1 mL/孔，每個培養(yǎng)條件設(shè)3復(fù)孔、實驗重復(fù)3次。

1.2.2.2β-氨基己糖苷酶釋放率檢測 30 min后將以上共培養(yǎng)體系置于冰水浴終止反應(yīng)，收集不同反應(yīng)體系并離心，分別收集上清和細胞沉淀，各細胞沉淀分別用1% Triton X-100重懸裂解，以釋放細胞內(nèi)的β-氨基己糖苷酶。用人β-氨基己糖苷酶A ELISA試劑盒(CUSABIO, USA)分別檢測每個反應(yīng)體系上清和細胞沉淀中的β-氨基己糖苷酶含量，β-氨基己糖苷酶釋放率(%)=上清中β-氨基己糖苷酶量/(上清+細胞沉淀的β-氨基己糖苷酶量)。

1.2.2.3甲苯胺藍染色計算脫顆粒率 離心收集各細胞沉淀，用新鮮配制的甲醛/冰醋酸(3∶1)液固定并細胞涂片，風(fēng)干后0.1%的甲苯胺藍染液染色2 min，95%酒精分色10 s，去離子水洗滌2次。再次風(fēng)干后中性樹脂封片并在光學(xué)顯微鏡下觀測，每張涂片連續(xù)計數(shù)5個高倍鏡視野，計算脫顆粒率。

1.2.330種Hp-PCs對LAD2肥大細胞潛在活化作用的檢測 將150 μg/mL終濃度的Hp尿素裂解液和10 μg/mL終濃度的各PCs分別和1×106/mL LAD2肥大細胞共培養(yǎng)30 min，檢測不同培養(yǎng)體系中LAD2肥大細胞的β-氨基己糖苷酶釋放率。將上一步所得的6種β-氨基己糖苷酶釋放率高于15%的PCs稀釋成不同濃度梯度(1、2、4、8 μg/mL)，分別和1×106/mL LAD2肥大細胞共培養(yǎng)30 min。檢測不同培養(yǎng)體系中LAD2肥大細胞的β-氨基己糖苷酶釋放情況。

1.3Hp優(yōu)勢性蛋白組分PC17對LAD2肥大細胞的潛在激活效應(yīng)的檢測

1.3.1即刻效應(yīng)的檢測 將最終篩得的Hp優(yōu)勢性PC17組分稀釋成不同濃度(1、2、4、8 μg/mL)，分別和1×106/mL LAD2肥大細胞共培養(yǎng)30 min。ELISA法檢測不同PC17濃度下LAD2肥大細胞的β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺、TNF-α釋放水平(Histamine ELISA kit, Cloud-Clone, Houston, TX, USA; Human TNF-α ELISA kit, Dakewe, Shenzhen, China)。

在以上細胞實驗中，通過4%臺盼藍染色和細胞計數(shù)監(jiān)測不同條件下LAD2肥大細胞活力，確保不會導(dǎo)致明顯的細胞死亡。

1.4液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)分析Hp優(yōu)勢的PC17的成分 用膠內(nèi)酶消化法將PC17條帶從SDS-PAGE蛋白電泳凝膠中切下并制備上樣樣品[14]，用LTQ Orbitrap Velos Pro 質(zhì)譜儀聯(lián)合Easy-nLC 1000 分析系統(tǒng)對制備好的PC17上樣樣品進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，并通過Proteome DiscovererTM1.4將數(shù)據(jù)與GenBank中Hp-26695的NCBI.fasta 數(shù)據(jù)庫進行比對。

2 結(jié) 果

2.13種Hp全菌制劑能有效活化人LAD2肥大細胞 β-氨基己糖苷酶釋放檢測示，100、150、200 μg/mL的Hp尿素裂解液和超聲裂解上清預(yù)處理組，及 (2.5、5.0、10) ×107CFU/mL的福爾馬林滅活Hp預(yù)處理組中的LAD2肥大細胞均能被有效活化(P<0.05)，并且這3種制劑對LAD2肥大細胞活化能力隨著其濃度的增加而增大。在相同的工作濃度下，Hp尿素裂解液的活化能力優(yōu)于Hp超聲裂解上清(P<0.05)(圖1)。

分別與陰性對照比較,①P<0.05，②P<0.01, ③P<0.001; 與200 μg/mL Hp超聲裂解上清比較,④ P<0.005; 與陰性對照比較,⑤P>0.05 圖1 不同Hp制劑預(yù)處理的LAD2細胞的β-氨基己糖苷酶釋放率Fig.1 β-Hexosaminidase release rate of LAD2 cells pre-treated by different Hp preparations

甲苯胺藍染色顯示：LAD2肥大細胞胞漿中的顆粒呈現(xiàn)紫紅色，細胞核呈現(xiàn)深藍色，未脫顆粒的細胞有均質(zhì)性的胞漿和完整的胞膜(綠色箭頭)，而脫顆粒的細胞則細胞膜連續(xù)性破壞，胞漿顆粒從細胞噴射出呈放射狀外觀(紅色箭頭)(圖2)；3種Hp制劑作用下的LAD2肥大細胞脫顆粒率趨勢，與β-氨基己糖苷酶釋放率趨勢基本一致(圖3)。

(a)陰性對照，(b)1 μmol/L伊屋諾霉素預(yù)處理，(c)200 μg/mL Hp尿素預(yù)處理?！?00倍光鏡, bar=50 μm。圖2 LAD2細胞的甲苯胺藍染色Fig.2 Light microscope feature of LAD2 cells

與陰性對照比較,③P<0.001圖3 不同Hp制劑預(yù)處理的LAD2細胞的脫顆粒率Fig.3 Degranulation ratio of LAD2 cells in different pre-treated groups by different Hp preparations

2.2Hp中最具LAD2肥大細胞活化作用的優(yōu)勢性PCs是PC17

2.2.1Hp 30種PCs對LAD2肥大細胞的直接活化作用 我們用分子篩離心將Hp尿素裂解液分成30個連續(xù)分子量梯度范圍的組分(圖4)，命名為PC1-PC30。對這些PCs引起LAD2肥大細胞β-氨基己糖苷酶釋放率的檢測顯示：在10 μg/mL的作用濃度下，PC3、9、10、17、27、28表現(xiàn)出較其余PCs更強的LAD2肥大細胞活化能力，與陰性對照比較，它們的促β-氨基己糖苷酶釋放率均大于15%(P<0.001)(圖5)。

自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和實現(xiàn)自我更新的重要途徑［2，65］。早在1995年，Nitatori等［66］報道短暫性CCAO可誘導(dǎo)沙土鼠海馬CA1神經(jīng)元組織蛋白酶B陽性自噬溶酶體增加和神經(jīng)元損傷。近年來，自噬在缺血性神經(jīng)元損傷中的作用受到關(guān)注，膠質(zhì)細胞自噬與神經(jīng)元損傷的關(guān)系亦被報道。但是，腦缺血后自噬的分子調(diào)控機制尚不完全清楚，自噬在腦缺血過程中起保護還是損傷作用一直存在爭議［2］。

圖4 Hp 30種連續(xù)分子量梯度的PCsFig.4 Display of Hp-PCs with different molecular weight ranges in SDS-PAGE

與陰性對照比較β氨基己糖苷酶釋放率>15%，③ P<0.001圖5 Hp 30種PCs對LAD2肥大細胞的直接活化作用Fig.5 Activation effects of 30 kinds of Hp-PCs on LAD2 cells

2.2.2Hp 6種優(yōu)勢性PCs對LAD2肥大細胞的潛在量效作用 通過檢測不同濃度PC3、9、10、17、27、28促LAD2肥大細胞β-氨基己糖苷酶釋放率顯示，這6種PCs對LAD2肥大細胞的活化作用隨著作用濃度的增加而增大。在2、4、8 μg/mL工作濃度下，PC17表現(xiàn)出較其它5種PCs更優(yōu)的促β-氨基己糖苷酶釋放能力，而且4 μg/mL的PC17和150 μg/mL Hp尿素裂解液的促β-氨基己糖苷酶釋放率相當(P>0.05)。至此，我們在Hp中篩選出對LAD2肥大細胞有最強活化作用的PC17組分(圖6)。

分別與2 μg/mL PC3, 9, 10, 27, 28預(yù)處理組比較,① P<0.05；分別與4 μg/mL PC3, 9, 10, 27, 28預(yù)處理組比較，② P<0.01；分別與8 μg/mL PC3, 9, 10, 27, 28 預(yù)處理組比較,③P<0.01；NC為 陰性對照。圖6 Hp 6種優(yōu)勢性PCs對LAD2肥大細胞的活化作用Fig.6 Activation effects of top-six PCs on LAD2 cells

2.3PC17的蛋白質(zhì)組分分析 通過將PC17的LC-MS/MS數(shù)據(jù)與GenBank中Hp-26695的NCBI.fasta數(shù)據(jù)庫比對揭示，PC17主要包含23種蛋白質(zhì)，它們的分子量在21～35 kDa之間(圖7、表1)。

表1 與GenBank Hp-26695數(shù)據(jù)庫比對確定PC17主要蛋白成分Tab.1 Proteins identification of PC17 against the GenBank of Hp-26695

以滯留時間內(nèi)的質(zhì)荷比表示(6～110 min)圖7 PC17的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of PC17

2.4PC17對LAD2肥大細胞潛在的活化效應(yīng) 為了明確PC17 對LAD2肥大細胞的具體激活效應(yīng)，我們模擬了肥大細胞活化的即刻反應(yīng)和延遲效應(yīng)，評價了30 min內(nèi)PC17促LAD2肥大細胞釋放組胺、TNF-α的效能，以及共培養(yǎng)0.5、6、12、24 h后，促LAD2肥大細胞釋放IL-3、IL-4、IL-17A、IFN-γ和LTB4的效能，結(jié)果顯示：在30 min內(nèi)，終濃度分別為2、4、8 μg/mL的PC17和150、200 μg/mL的Hp尿素裂解液均能有效激活LAD2肥大細胞釋放β-氨基己糖苷酶、組胺和TNF-α，且這3種炎性介質(zhì)的釋放水平與刺激濃度呈正量效關(guān)系。就引起LAD2肥大細胞釋放組胺和TNF-α的效能來看，PC17最小工作濃度分別為1 μg/mL和2 μg/mL，而Hp尿素裂解液最小工作濃度分別為100 μg/mL和150 μg/mL；就引起這3種炎性介質(zhì)釋放水平來看，4 μg/mL的PC17大致和150 μg/mL的Hp尿素裂解液效能相當(t1=0.441，t2=2.099，t3=0.441，P>0.05)(圖8 (a)、(b)、(c))。

隨著作用時間延長，4 μg/mL PC17和150 μg/mL Hp尿素裂解液均能顯著刺激LAD2肥大細胞釋放IL-3、IFN-γ和LTB4(6、12、24 h)，這些炎性介質(zhì)的釋放水平與共培養(yǎng)時間呈正量效關(guān)系。并且，PC17的促IL-3釋放水平在6、12、24 h，促IFN-γ釋放水平在0.5、 6、 12、24 h，促LTB4釋放水平在0.5、6 h，均優(yōu)于Hp尿素裂解液(P<0.05)；而兩者促LTB4釋放水平在12, 24 h無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖8 (d)、(e)、(f))。

4 μg/mL的PC17和150 μg/mL 的Hp尿素裂解液均不能有效激活LAD2肥大細胞釋放IL-4、IL-17A，分別同陰性照比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

(a)β-氨基己糖苷酶釋放, (b) 組胺釋放, (c)不同濃度的PC17和Hp尿素裂解液促 TNF-α 釋放。分別與陰性對照比較，① P<0.05，②P<0.01，③ P<0.001；與150 μg/mlHp尿素裂解液預(yù)處理組比較，④P>0.05。不同時間PC17和Hp尿素裂解液促(d) IL-3釋放, (e) IFN-γ釋放， (f) LTB4釋放,與同一時間點Hp尿素裂解液預(yù)處理組比較： ① P<0.05，② P<0.01，③ P<0.001。NC：陰性對照。圖8 PC17促LAD2肥大細胞釋放炎性介質(zhì)的作用Fig.8 Inflammatory mediators release from LAD2 cells induced by PC17

3 討 論

Hp感染極其普遍，西方國家的感染率為25%～50%，而少數(shù)發(fā)展中國家甚至高達70%[15]。Hp感染與一些胃腸道系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，然而其致病機制仍未完全揭示，大量研究表明，Hp感染后胃腸道粘膜的肥大細胞數(shù)量及活性均增加[2-3]，并且Hp的VacA和NAP蛋白有直接激活人或鼠肥大細胞的作用[4-6]，提示肥大細胞的活化在Hp感染的致病機制中發(fā)揮重要作用。肥大細胞廣泛分布于胃腸道粘膜固有層，它既是速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的效應(yīng)細胞，也是各種炎癥形成發(fā)展過程中的關(guān)鍵細胞。Hp感染后寄生于胃粘膜上皮細胞，很難被機體徹底清除，可長期釋放一些毒力蛋白如VacA和CagA等破壞胃腸道防御層完整性，引起粘膜糜爛或潰瘍形成[16]，給細菌及其代謝產(chǎn)物與粘膜固有層的肥大細胞接觸提供了有效途徑。因此，推測Hp感染后能夠通過對胃腸道粘膜肥大細胞的潛在活化作用觸發(fā)/參與Hp感染相關(guān)性疾病的發(fā)病。

為了驗證這一推論，我們檢測了3種Hp全菌制劑(Hp尿素裂解液、Hp超聲裂解上清、福爾馬林滅活的Hp)對人LAD2肥大細胞株的直接作用，結(jié)果顯示，這3種全菌制劑均能在短時間內(nèi)引起LAD2肥大細胞脫顆粒率和β-氨基己糖苷酶釋放率增加，而且這種潛在活化效能呈劑量依賴性(圖1)。但是，Hp主要通過哪種具體成分活化肥大細胞仍未可知。

盡管已有研究發(fā)現(xiàn)Hp的VacA、NAP等蛋白有直接激活肥大細胞的作用[4-6]，但由于Hp菌體成分復(fù)雜，以上的研究僅限于單個蛋白水平，仍未能全面系統(tǒng)的揭示Hp對肥大細胞的直接活化作用。據(jù)此，我們將Hp尿素裂解液分解成為連續(xù)分子量梯度的30組蛋白組分，并評價它們對肥大細胞的活化效能。我們發(fā)現(xiàn)，其中有6組蛋白組分(PC3、9、10、17、27、28)均展示出了潛在的LAD2肥大細胞活化效應(yīng)(圖2 B)，并且，PC17對LAD2肥大細胞激活作用最強(圖2 C)。至此，我們首次從Hp全菌中篩選出了對LAD2肥大細胞潛在活化效應(yīng)最強的蛋白成分。

鑒于肥大細胞活化后可合成和釋放多種炎性介質(zhì)，激發(fā)級聯(lián)的炎癥反應(yīng)。接下來我們評價了Hp尿素裂解液和其PC17促LAD2肥大細胞炎性介質(zhì)釋放的潛在效能。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的PC17可以在短時間內(nèi)激活LAD2肥大細胞釋放β-氨基己糖苷酶、組胺以及TNF-α(圖4 A、B、C)，并且這種活化效應(yīng)與PC17的工作濃度呈正量效關(guān)系。非常明確，肥大細胞被激活后首先釋放胞漿顆粒中預(yù)合成的炎性介質(zhì)，如β-氨基己糖苷酶、組胺、TNF-α、類胰蛋白酶、糜蛋白酶等[7-9]。組胺有很強的血管活性和平滑肌收縮效應(yīng)，還可以和胃壁細胞H2受體結(jié)合，刺激胃酸分泌，直接導(dǎo)致胃粘膜損傷。同時，TNF-α能夠趨化白細胞并進一步加重炎癥反應(yīng)，而中性粒細胞的浸潤則是Hp致病的重要要機制之一，它可以釋放大量細胞酶、溶酶體酶、氧自由基、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等導(dǎo)致胃粘膜進一步受損[17]。由此，我們可以得出結(jié)論：Hp或主要通過其PC17組分，在短時間內(nèi)活化LAD2肥大細胞，同時使細胞釋放預(yù)先合成的炎性介質(zhì)，且這種活化效應(yīng)呈濃度依賴性。換句話說，在那些與Hp感染相關(guān)的胃腸道疾病中，Hp可能通過直接觸發(fā)的方式使肥大細胞活化并脫顆粒，這一過程中最有效的作用成分可能集中在PC17蛋白組分中。

鑒于肥大細胞快速活化后的數(shù)小時內(nèi)，可以發(fā)生以合成和釋放新的炎性介質(zhì)為特點的延遲效應(yīng)[9]，因此，我們也就PC17 對LAD2肥大細胞的活化作用進行了時間依賴性評估。我們發(fā)現(xiàn)，PC17或Hp尿素裂解液均能夠有效促LAD2肥大細胞分泌IL-3、IFN-γ和LTB4，并且這種促分泌效應(yīng)呈時間依賴性。隨著反應(yīng)時間的增加，PC17較Hp尿素裂解液促LAD2細胞分泌更多的的 IL-3和IFN-γ(圖4 D，E)，促LTB4分泌在兩組均隨時間增加而達到高水平(圖4 F)。在兩類預(yù)處理組中，LAD2肥大細胞釋放IL-4、IL-17A的水平隨時間無顯著變化(數(shù)據(jù)未展示)。已揭示IL-3參與了嗜酸性粒細胞的生長、存活和活化[18]，而嗜酸性粒細胞浸潤是胃腸道Hp感染的組織學(xué)特征之一；IFN-γ、LTB4可以招募淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞，在促發(fā)炎癥和組織損傷中發(fā)揮重要作用[8,19]。因此，我們認為，在那些與Hp感染相關(guān)性疾病病程中，Hp主要利用它優(yōu)勢性的PC17組分，不僅可能迅速激活肥大細胞釋放胞內(nèi)存儲的炎性因子導(dǎo)致胃腸道的急性損傷，而且可能通過促肥大細胞不斷合成和分泌更多的炎性介質(zhì)如IL-3、IFN-γ、LTB4等誘導(dǎo)級聯(lián)的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生持續(xù)性損傷。盡管IL-4和IL-17被報道在Hp感染相關(guān)性疾病發(fā)病中發(fā)揮了一定作用[11]，但在我們的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)PC17有促肥大細胞釋放這兩種炎癥介質(zhì)的能力。這至少可以表明，Hp并不能通過直接促肥大細胞分泌IL-4和IL-17而致病。本研究還發(fā)現(xiàn)，即使PC17的工作濃度(4 μg/mL)明顯低于Hp尿素裂解液(150 μg/mL)，PC17仍可能活化LAD2肥大細胞，促其釋放和150 μg/mL Hp尿素裂解液預(yù)處理水平相當?shù)摩?氨基己糖苷酶、組胺、TNF-α、LTB4(圖4 A，B，C，F(xiàn))，以及水平更高的IL-3、IFN-γ(圖4 D，E)。因此我們有理由推論，PC17對LAD2肥大細胞的作用可以代表Hp對人肥大細胞的主要潛在活化作用。

肥大細胞作為一種組織固有細胞，不僅可以通過高親和力的IgE受體參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，也能對細菌感染作出反應(yīng)，參與先天免疫反應(yīng)[20]。一些肥大細胞的表面受體，如Toll樣受體(TLR)TLR2、TLR4，可以識別細菌并引起細胞活化[21]，因此我們推測，Hp，尤其是其PC17組分，可能通過被肥大細胞TLRs識別并進一步觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答而參與其致病進程。

為了進一步揭示PC17的具體成分，我們對其進行了LC-MS/MS分析表明，PC17主要包含23種分子量區(qū)間在21～35 kDa的蛋白(表1)。雖然目前對這23種蛋白的肥大細胞活化作用知之甚少，但其中的Hp脲酶及其亞基已被推測具有肥大細胞活化效力，因為它可能與可誘發(fā)大鼠肥大細胞釋放組胺的刀豆脲酶有相同的性質(zhì)[22]。

綜上所述，本研究明確了Hp對人LAD2肥大細胞株潛在的直接活化作用，并首次從Hp全菌中系統(tǒng)地篩選出對LAD2肥大細胞活化作用可能的最強的蛋白組分，探究了其致病效能和具體蛋白質(zhì)成分。雖然本研究并不盡善盡美，PC17中具體效應(yīng)蛋白質(zhì)仍需要進一步確定，但該研究一定程度上揭示了Hp感染相關(guān)性疾病的發(fā)病機制，為找到針對性治療的靶點提供線索。

利益沖突：無