北京市市售生禽肉及社區(qū)居民冰箱耶爾森菌污染狀況及分子特征研究

王麗麗，張 尋，段 然，陸 崢，魏 東，陳 倩

耶爾森菌屬(Yersinia)是腸桿菌科中一類極具生物多樣性的物種，目前已發(fā)現(xiàn)18個種[1]。其中已明確對人類致病的有鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)、假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)。條件致病的有弗氏耶爾森菌(Yersiniafrederiksenii)、中間耶爾森菌(Yersiniaintermedia)、克氏耶爾森菌(Yersiniakristensenii)等。本屬細(xì)菌通常先引起嚙齒動物、家畜和鳥類等動物感染，人類通過接觸已感染的動物、食入污染食物或節(jié)肢動物叮咬等途徑而被感染。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是近年來受到全球重視的一種腸道致病菌，也是國際上公認(rèn)的重要的食源性病原菌，人感染后導(dǎo)致耶爾森菌病(Yersinosis)，也可引起多種家禽、家畜發(fā)病。20世紀(jì)80 年代中期我國證實有2次流行，造成500多人感染。目前主要以低水平散發(fā)為主。由于該菌具有嗜冷性，是少數(shù)可以在冰箱低溫儲存食品中繁殖的病原菌之一，冰箱中存放的食物成為本菌的重要傳染源，因此小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病又被稱為“冰箱病”。國內(nèi)外有很多學(xué)者對生肉和冰箱冷藏食品小腸結(jié)腸炎耶爾森菌污染狀況做了研究[2-3]，但是對居民冰箱耶爾森菌污染在食源性疾病傳播中的作用研究較少。

本研究對北京市市售生禽肉及社區(qū)居民冰箱耶爾森菌污染狀況進(jìn)行監(jiān)測，并對分離菌株的生物型、血清型、毒力基因攜帶情況、抗生素敏感性以及PFGE等分子特征展開研究,為開展食源性耶爾森菌監(jiān)測溯源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品來源 2018年6-12月采集自北京市超市和農(nóng)貿(mào)市場的生禽肉，樣品包括預(yù)包裝和散裝的整雞、雞腿、雞翅等共60件。同期采集的北京市社區(qū)居民冰箱冷藏室涂抹，共60件。

1.2試劑與儀器 改良磷酸鹽緩沖液增菌液、CIN-I培養(yǎng)基、改良Y培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司、API 20E生化鑒定條購自法國生物梅里埃公司，膽鹽-七葉苷平板購自英國Oxoid公司、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌診斷血清購自鄭州萬泰生物科技有限公司，調(diào)節(jié)陽離子濃度的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液及革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板由上海星佰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，PCR反應(yīng)體系試劑購自天根生化科技有限公司，限制性內(nèi)切酶NotI、XbaI購自大連Takara公司，SeaKem Gold瓊脂糖購自美國Cambraex Bio Seience Rockland公司，蛋白酶K購自德國Merck公司。PCR儀為CFX96、脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad CHEF-DRⅢ系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)為 Bio-Rad Gel Doc 2000系統(tǒng)，均購自美國伯樂公司?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜為MALDI-TOF MS，購自德國Bruker公司。

藥敏實驗用質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門菌H9812。

1.3菌株分離方法 以無菌操作取生禽肉 25 g放入含有 225 mL 改良磷酸鹽緩沖液增菌液，冰箱涂抹放入10 mL 改良磷酸鹽緩沖液增菌液中，4 ℃增菌10～20 d后劃線接種于耶爾森選擇性平板CIN-I培養(yǎng)基，25 ℃ 24～48 h，采用MALDI-TOF對CIN選擇性平板上“公牛眼”狀形態(tài)可疑的菌落初步鑒定[4]，用API 20E 鑒定條和16S rRNA[5]進(jìn)行確認(rèn)。

1.4血清型鑒定 利用玻片凝集法對鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株進(jìn)行血清分型。

1.5毒力基因檢測 按照參考文獻(xiàn)[6-8]合成ail、yatA、ystB、yadA、rfbC、virF6種毒力基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增體系：采用20 μL反應(yīng)體系，每個體系中加入2×Taq PCR Mastermix(KT201-01)10 μL，純水 7 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。

1.6七葉苷代謝反應(yīng)鑒定 將待測菌株點種于膽鹽-七葉苷平板，置于25 ℃培養(yǎng)24 h后觀察接種點周邊培養(yǎng)基顏色變化[9]。

1.7耐藥性測定 根據(jù)臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件M100-S25推薦的藥敏試驗抗生素選擇原則[10]確定耐藥監(jiān)測的抗生素名單，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行抗生素敏感試驗，利用商品化藥敏板條定量測定致病菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。按照相同的操作測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC 25922的耐藥性。測試的抗生素包括30種，分別為氨芐西林(ampicillin，AMP，2～64 μg/mL)、氨芐西林-舒巴坦(ampicillin/sulbactam，AMS，2～64 μg/mL)、四環(huán)素(tetracycline，TET，1～32 μg/mL)、氯霉素(chloramphenicol，CHL，2～64 μg/mL)、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT，0.25～8 μg/mL)、頭孢唑林(cefazolin，CFZ，0.5～16 μg/mL)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX，0.25～8 μg/mL)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ，0.5～16 μg/mL)、頭孢西丁(cefoxitin，CFX，2～64 μg/mL)、慶大霉素(gentamicin，GEN，1～32 μg/mL)、亞胺培南(imipenem，IMI，0.25～8 μg/mL)、萘啶酸(nalidixic，NAL，4～64 μg/mL)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole，Sul，32～512 μg/mL)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP，0.03～32 μg/mL)、阿莫西林-克拉維酸(amoxicillin/ clavulanate，AMC，2～64 μg/mL)、多黏菌素E(colistin，CT，0.5～16 μg/mL)、多黏菌素B(polymyxin B，PB，0.5～16 μg/mL)、米諾環(huán)素(minocycline，MIN，1～32 μg/mL)、阿米卡星(amikacin，AMI，4～128 μg/mL)、氨曲南(aztreonam，AZM，1～32 μg/mL)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP，0.03～32 μg/mL)、頭孢吡肟(cefepime，F(xiàn)EP，0.25～16 μg/mL)、美羅培南(meropenem，MEM，0.06～4 μg/mL)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEV，0.125～8 μg/mL)、多西環(huán)素(doxycycline，DOX，0.5～16 μg/mL)、卡那霉素(kanamycin，KAN，8～64 μg/mL)、鏈霉素(streptomycin，STR，4～32 μg/mL)、吉米沙星(gemifloxacin，GEM，0.015～16 μg/mL)、阿奇霉素(azithromycin，AZI，2～64 μg/mL)、頭孢噻肟-克拉維酸(cefotaxime-clavulanate，CTX-C，0.12～4 μg/mL)、頭孢他啶-克拉維酸(ceftazidime-clavulanate，CAZ-C，0.25～8 μg/mL)。根據(jù)CLSI的相應(yīng)解釋標(biāo)準(zhǔn)獲得敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結(jié)果。

1.8PFGE分型 按照中國CDC編寫的《小腸結(jié)腸炎耶爾森菌假結(jié)核耶爾森菌實驗室分離與鑒定手冊》[4]進(jìn)行。主要實驗參數(shù)如下：細(xì)菌懸液濃度用bioMérieux 麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)至4.0～4.2；使用NotⅠ限制性內(nèi)切酶(50 U)，37 ℃酶切 2 h；電泳參數(shù)為 2～20 s，19 h；電泳后使用GelRed染色，純水脫色，讀取電泳圖譜；沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。PFGE圖像錄入BioNumerics (Version 7.6，Applied Maths，Inc.)軟件，對電泳圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建聚類樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離、鑒定結(jié)果及毒力基因檢測結(jié)果 經(jīng)API 20E、質(zhì)譜、16S rRNA鑒定并確認(rèn)，本研究共分離到17株耶爾森菌，其中9株小腸結(jié)腸炎耶爾森、4株中間耶爾森菌、1株克氏耶爾森菌、1株Yersinia massiliensis、2株魯氏耶爾森菌(表1)。

表1 北京市市售生禽肉和居民冰箱耶爾森菌生物型、血清型及毒力基因結(jié)果Tab.1 Biotype, serotype and virulence gene results of Yersinia bacteria of onsale raw poultry and household refrigerators in Beijing

2.2生物分型 對分離到的小腸結(jié)腸炎耶爾森進(jìn)行七葉苷代謝反應(yīng)鑒定，結(jié)果5株為七葉苷反應(yīng)陽性，其中1株居民冰箱涂抹分離株為生物1A/O∶8型，2株市售生禽肉分離株為生物1A/O∶9型，2株市售生禽肉分離株為生物1A∶UN型。

2.3抗生素敏感性結(jié)果 17株耶爾森菌分離株中，頭孢唑林、氨芐西林耐藥率較高，分別為76.47%(13/17)、52.94%(9/17)，可能與這些菌株表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)。對氯霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、慶大霉素、米諾環(huán)素、阿米卡星、左氧氟沙星、多西環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素10種抗生素100%敏感。各測試抗生素的耐藥率和MIC50、MIC90見表2。

表2 北京市17株耶爾森菌抗生素敏感性Tab.2 Antibiotic sensitivity of 17 Yersinia strains in Beijing

對測試菌株進(jìn)行耐藥譜分析，發(fā)現(xiàn)2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對多達(dá)11種抗生素耐藥(表3)，其中Y8分離自社區(qū)居民冰箱涂抹，Y12分離自北京市某大型超市散裝冰鮮雞肉。1株分離自某品牌預(yù)包裝雞肉的克氏耶爾森菌Y18對9種抗生素耐藥。2株分離自超市散裝雞肉的中間型耶爾森菌對所有測試抗生素均敏感。

表3 北京市17株耶爾森菌耐藥譜Tab.3 Drug resistance spectrum of 17 Yersinia strains in Beijing

2.3PFGE分型 對17株耶爾森菌基因組經(jīng)NotI酶切后進(jìn)行PFGE分子分型，采用BioNumerics 軟件對電泳條帶進(jìn)行聚類分析。分離自同一件樣品的2株中間耶爾森菌Y7、Y10不能被NotI酶切。其他15株耶爾森菌得到14種PFGE帶型(圖1)，相似度為0～100%。分離自同一件生禽肉樣品的2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌帶型一致。

3 討 論

作為一種近年來受到全球關(guān)注的人獸共患病病原體，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌廣泛存在于自然環(huán)境中，近年主要通過借助流行病學(xué)與分子分型手段識別暴發(fā)、開展分子流行病學(xué)研究。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病目前在我國主要以低水平散發(fā)為主。由于其在低溫環(huán)境下易于生長，所以是現(xiàn)代“冰箱病”的重要致病菌。本研究對2018年北京市市售生禽及社區(qū)居民冰箱耶爾森菌污染狀況監(jiān)測結(jié)果表明，生禽肉和居民冰箱耶爾森菌檢出率分別為21.67%(13/60)和6.67%(4/60)。相關(guān)資料顯示[7,11]，我國小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病的流行菌型主要是血清型O∶3型和O∶9型。本研究僅檢出了2株O∶9和1株O∶8血清型，未檢出O∶3血清型，但需加強監(jiān)測和防范，以便更客觀掌握北京市小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要血清型。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可分為生物1A、1B、2、3、4、5型[12]。典型的致病性菌株為生物1B、2、3、4或5型，其中生物1B型為高致病性菌株，生物2型-5型為低致病性菌株。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致瀉作用普遍認(rèn)為由耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxin A)引起。近年來，部分產(chǎn)生類似耐熱腸毒素A——耐熱腸毒素B(heat-stable enterotoxin，Y-STb)的生物1A型菌株在腹瀉病人中有較多報道，并在多起食源性疾病暴發(fā)與院內(nèi)感染事件中被確定為病原[13]?；谌巳旱牧餍胁W(xué)研究與動物實驗表明，生物1A型菌株具有潛在的致病性。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶3、O∶5、O∶8、O∶9血清型為常見致病血清型。本研究分離的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中除1株不攜帶ystB基因外，其他8株生禽肉分離株和1株居民冰箱分離株均攜帶ystB基因，而其他基因均陰性，其中2株為生物1A/O∶9型、3株為生物1A/UN型、2株為非生物1A型、1株為生物1A/O∶8型，說明北京市市售生禽肉及居民冰箱均是耶爾森菌屬所致食源性疾病的潛在傳染源，應(yīng)引起重視。

17株耶爾森菌分離株對頭孢唑林、氨芐西林耐藥率較高，分別達(dá)76.47%和52.94%，可能與這些菌株表達(dá)的 β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)。所有測試菌株對環(huán)丙沙星等10種抗生素均敏感。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對氨芐西林和一代頭孢類抗生素天然耐藥，對其他抗生素有不同程度耐藥性。對測試菌株耐藥譜分析，發(fā)現(xiàn)2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對多達(dá)11種抗生素耐藥，其中1株為攜帶ystB的生物1A/O∶9生禽肉分離株Y12，對第一、二、三、四代頭孢均耐藥，Y8對第一、三、四代頭孢均耐藥。另外，1株社區(qū)居民冰箱冷藏室涂抹克氏耶爾森菌分離株對9種抗生素耐藥，在表型上表現(xiàn)為較強的耐藥性。對于沒有判別標(biāo)準(zhǔn)的吉米沙星、阿奇霉素、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶-克拉維酸，本研究未做SIR判別，但是長期監(jiān)測MIC50、MIC90，對于判斷北京市耶爾森菌的耐藥趨勢具有重要意義。

值得的關(guān)注的是，我們在生禽肉樣品SQ1中同時分離出3株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，其中2株菌Y3、Y4為非生物1A型，PFGE帶型完全一致，而另1株菌Y5則為生物1A/O∶9型，與Y3、Y4的PFGE帶型不同。另外，生禽肉樣品SQ6同時分離出魯氏、克氏和中間型耶爾森各1株，均為毒力基因全陰性。不同種、不同生物型別、不同血清型耶爾森菌的檢出，也說明北京市市售生禽肉和居民冰箱中該菌的感染菌型并不完全相同，應(yīng)引起我們更多關(guān)注。

利益沖突：無