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    加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

    2015-10-14 08:38:14胡麗娟
    新中醫(yī) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:金丸成瘤大腸癌

    胡麗娟

    廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 廣州510006

    加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

    胡麗娟

    廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 廣州510006

    目的:探討加味左金丸通過MAPK信號通路對人大腸癌裸鼠移植瘤的影響。方法:建立人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型,采用皮下注射HT29大腸癌細胞株制作大腸癌裸鼠模型。45只實驗裸鼠隨機分為3組:生理鹽水組、加味左金丸高劑量組、加味左金丸低劑量組;觀察不同組別對裸鼠致瘤的影響,動態(tài)觀察各組裸鼠腫瘤體積變化,繪制腫瘤生長曲線。采用免疫印記法(Western blot)檢測移植瘤ERK/MAPK活性及RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK mRNA的表達。結(jié)果:移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3~5天,最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié),成瘤早期癌體基本成橢圓形,表面光滑,2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié),邊界清,略可活動,觸之質(zhì)中,逐漸不規(guī)則,表面凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi),生理鹽水組瘤體生長較快,加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期,生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦,擁擠少動,飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1cm以后,生長速度較慢,荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤,大部分呈類圓形,個別形態(tài)不規(guī)則,色灰白,質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。加味左金丸各劑量組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論:加味左金丸抑制人大腸癌裸鼠移植瘤的增殖,延緩腫瘤的生長,其機制之一可能是與抑制MAPK信號通路相關(guān)的ERK/MAPK的表達有關(guān)。

    加味左金丸;裸鼠;移植瘤;ERK/MAPK信號通路

    MAPK信號通路的失調(diào)出現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)展的早期,很多證據(jù)顯示MAPK通路涉及結(jié)直腸癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。筆者采用人大腸癌細胞株HT29裸小鼠皮下移植瘤模型,觀察含黃連、吳茱萸等中藥組成的加味左金丸對裸鼠移植瘤的作用,并初步揭示其作用機制,為臨床更好應(yīng)用中藥抗腫瘤提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 癌細胞株HT29 HT29培養(yǎng)于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)液為含10%FBS的RPM I 1640。隔天更換培養(yǎng)液一次,每周傳代1~2次,傳代時用0.25%的胰酶消化處理和PBS洗滌。

    1.2 藥品與試劑 加味左金丸由黃連、吳茱萸、青黛組成,藥物購自廣東省中醫(yī)院。中藥煎煮過程:每次煎煮好一周劑量,先煮黃連和吳茱萸,用紗布濾出藥液,裝入大號研鉑中,倒入青黛慢慢研磨,盡量使青黛慢慢溶入藥液中,最后煎取所需藥液量,放入4℃冰箱備用。

    1.3 人大腸癌細胞株HT29裸小鼠移植瘤模型的制備HT29細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶80%~90%,用0.25%的胰酶消化后收集,制成單細胞懸液,懸浮于生理鹽水中。BALB/C裸鼠45只,飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院科學(xué)研究中心無菌飼養(yǎng)間內(nèi)(SPF級),裸鼠所用水、飼料、籠具一切器具均經(jīng)高壓蒸汽消毒法滅菌。

    1.4 動物分組及處理BALB/C裸小鼠(購自廣州維柏鑫生物科技有限公司,合格證號:1215708),4~6周齡,重量:18~22 g,45只,雌雄各半。觀察裸鼠均健康,取腫瘤細胞懸液,于每只裸鼠左側(cè)或右側(cè)脅腹部皮下注射0.2m L,細胞量為2×106/只。將人大腸癌皮下移植的裸小鼠隨機分為3組,盡量做到雌雄各半。①生理鹽水組:15只,生理鹽水0.5m L灌胃;②加味左金丸低劑量組:15只,以中藥湯藥0.67 g/kg灌胃,相當于60 kg成人用量;③加味左金丸高劑量組:15只,2 g/kg灌胃,相當于60 kg成人用量3倍。7天造模成功后,每組均連續(xù)灌胃1月。

    1.5 抑瘤率 觀察裸鼠成瘤時間,腫瘤生長特性。待腫瘤生長至15~75mm3時用于下一步實驗。每組灌胃結(jié)束后,用游標卡尺測量每組裸鼠移植瘤的大小。抑瘤率=1-(加味左金丸各劑量組結(jié)束時平均體積-加味左金丸各劑量組開始時平均體積)/(生理鹽水組結(jié)束時平均體積-生理鹽水組開始時平均體積)×100%。

    1.6 移植瘤ERK/MAPK活性 灌胃結(jié)束后的第2天,將裸鼠斷頸處死,快速取下移植瘤體,放入液氮中保存,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。細胞經(jīng)實驗因素處理后,離心收集。使用冰冷的PBS洗滌細胞3次,加入裂解緩沖液振蕩混勻,冰浴30m in,4℃12000 rpm、離心半徑10 cm離心10m in,取上清,即為胞質(zhì)蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進行SDS—PAGE,將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5m in。室溫下用5%脫脂奶粉(PBST溶解)封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗ERK1/2或抗β-actin(1∶2000)4℃孵育過夜。PBST洗脫3次,加入相應(yīng)的二抗,孵育1 h,漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色,暗室中曝光到X光片上,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

    1.7 移植瘤ERK/MAPK mRNA表達量 灌胃結(jié)束后的第2天,將裸鼠斷頸處死,快速取下移植瘤體,放入液氮中保存,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK m RNA的表達。采用Trizol試劑(美國IBCO公司),參照說明對各組組織總RNA進行提取。取2μLRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2m in后,94℃變性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min,35個循環(huán),最后72℃延伸7m in。取3μL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(EB)顯色,目的條帶用圖像分析系統(tǒng)作吸光度測定,以β-actin為內(nèi)參照,ERK/MAPKm RNA與β-actin吸光度的比值作為ERK/MAPKm RNA的相對含量進行半定量分析,比較不同組ERK/MAPKm RNA表達的差異。ERKMAPKm RNA的引物序列按cDNA文庫查獲,引物由上海賽百勝生物技術(shù)公司合成。β-actin的引物序列:上游引物5-GGATCAGCA AGCAGGAGTATGA-3,下游引物5-CGCAAGTTAGGTTTTT GTCAAGAAAGGGT-3,擴增片段長度為116 bp。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀況觀察 見圖1、圖2、圖3。移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3~5天,最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié),成瘤早期癌體基本成橢圓形,表面光滑,2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié),邊界清,略可活動,觸之質(zhì)中,逐漸不規(guī)則,表面凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi),生理鹽水組瘤體生長較快,加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期,生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦,擁擠少動,飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1 cm以后,生長速度較慢,荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤,大部分呈類圓形,個別形態(tài)不規(guī)則,色灰白,質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。

    圖1 2周加味左金丸低劑量組

    圖2 2周加味左金丸高劑量組

    圖3 2周生理鹽水組

    2.2 各組腫瘤生長抑制情況比較 見表1。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s)

    表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s)

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15開始時(cm3)0.095±0.005 0.074±0.004 0.067±0.007用藥第15天(cm3)0.512±0.074①②0.584±0.052①0.678±0.023結(jié)束時(cm3)0.741±0.065①②0.853±0.083①1.254±0.032抑瘤率(%)55.5 58.3

    2.3 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較 見表2。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s)

    表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s)

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15吸光值0.195±0.045①②0.235±0.025①0.364±0.057

    2.4 各組腫瘤組織ERK/MAPK mRNA表達量比較 見表3。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s)×106

    表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s)×106

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15 ERK/MAPKmRNA表達量2.344±0.395①②2.613±0.103①4.045±0.200

    3 討論

    近年來研究發(fā)現(xiàn),MAPK信號傳導(dǎo)通路是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的重要信號傳導(dǎo)通路之一,MAPK信號傳導(dǎo)通路及機制的闡明對于靶向干預(yù)相關(guān)疾病藥物的研究具有重要意義,必將為惡性腫瘤等重大疾病的治療提供新的思路[1]。雖然并行存在5條MAPK信號通路,其中ERK/MAPK途徑是細胞增殖調(diào)節(jié)最主要的途徑之一,該通路的活化在腸上皮細胞的分化中起了重要作用。ERK/MAPK信號通路的激活涉及結(jié)直腸癌的發(fā)病、進展和致瘤行為的證據(jù)越來越多[2]。ERK/MAPK途徑所有的激酶可能都是治療結(jié)直腸癌的有效靶點,現(xiàn)在許多研究小組在研制新的抑制劑。各條MAPK通路在結(jié)直腸癌中的精確作用成為研究熱點。

    加味左金丸為左金丸加青黛,青黛雖為后增藥物,但在處方配伍關(guān)系中居臣藥之位,黃連為君,青黛為臣,吳茱英為佐使。黃連性味苦寒,功效清熱、解毒、燥濕;青黛性味苦寒,功效清熱、解毒、瀉火;吳茱英性味辛溫,功效降逆止嘔、散寒止痛。方中重用黃連入胃、大腸經(jīng)以清熱毒、祛濕熱;青黛與之相須為用,更能增強君藥之功效;少佐辛溫之吳茱英以制君臣藥之過于寒涼,并降逆止嘔、止痛,以兼治惡心嘔吐、疼痛之癥狀。在本研究中,加味左金丸低劑量組對裸鼠移植瘤大腸癌的抑瘤率與高劑量組比較,差異不明顯;加味左金丸各劑量均能使ERK/MAPK的活性降低,抑制ERK/MAPK m RNA的表達,使大腸移植瘤的生長受到抑制。

    既往研究表明,在離體的條件下,黃連小檗堿和吳茱萸堿可以誘導(dǎo)大腸癌HT29細胞的凋亡,對HT29細胞生長有明顯的抑制作用,對HT29細胞端粒酶催化亞基(hTERT)表達有抑制作用[3~5];1,2-DMH誘導(dǎo)大腸癌實驗?zāi)P椭?,加味左金丸可以有效阻礙早期癌癥的發(fā)生和發(fā)展;在DMH誘導(dǎo)大腸癌的過程中,加味左金丸可以很顯著地干預(yù)癌癥的發(fā)生,在癌癥發(fā)展的進程中,加味左金丸可以有效地延緩癌癥的進程[6]。

    加味左金丸在本次試驗中對裸鼠腫瘤組織大小及腫瘤相關(guān)因子有較好的抑制作用,提示中醫(yī)藥防治療大腸具有一定優(yōu)勢,為中醫(yī)藥治療大腸癌提供新的思路與方法,為加味左金丸的臨床應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù),為大腸癌患者的中藥防治、阻斷癌前病變、改善預(yù)后和提高生活質(zhì)量開辟了一條新途徑,拓寬了中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的領(lǐng)域。

    [1]季宇彬,胡哲清,鄒翔.MAPK信號通路及其研究進展[J].中國藥理通訊,2010,27(2):17-18.

    [2]徐偉麗,孫文廣,馬鶯.MAPK信號通路與結(jié)直腸癌[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(2):389-392.

    [3]譚宇蕙,陳冠林,郭淑杰,等.小檗堿對人胃癌MGC-803細胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用[J].中國藥理學(xué)通報,2001,17:40-43.

    [4]常金榮,文彬,王汝俊,等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞凋亡及端粒酶催化亞基(hTERT)表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2008,24(2):6-8.

    [5]常金榮,文彬,王汝俊,等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞生長抑制和凋亡作用的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(3):191-195.

    [6]文彬,熊曼利,戴偉怡.左金丸及反左金丸對實驗性大腸癌不同時期甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(20):2074-2078.

    (責(zé)任編輯:駱歡歡)

    R285.5

    A

    0256-7415(2015)02-0230-03

    10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.107

    2014-09-11

    廣東省中醫(yī)藥局資助項目(20111209)

    胡麗娟(1978-),女,副主任中醫(yī)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合脾胃病學(xué)。

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