• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

    2015-10-14 08:38:14胡麗娟
    新中醫(yī) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:金丸成瘤大腸癌

    胡麗娟

    廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 廣州510006

    加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

    胡麗娟

    廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 廣州510006

    目的:探討加味左金丸通過MAPK信號通路對人大腸癌裸鼠移植瘤的影響。方法:建立人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型,采用皮下注射HT29大腸癌細胞株制作大腸癌裸鼠模型。45只實驗裸鼠隨機分為3組:生理鹽水組、加味左金丸高劑量組、加味左金丸低劑量組;觀察不同組別對裸鼠致瘤的影響,動態(tài)觀察各組裸鼠腫瘤體積變化,繪制腫瘤生長曲線。采用免疫印記法(Western blot)檢測移植瘤ERK/MAPK活性及RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK mRNA的表達。結(jié)果:移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3~5天,最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié),成瘤早期癌體基本成橢圓形,表面光滑,2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié),邊界清,略可活動,觸之質(zhì)中,逐漸不規(guī)則,表面凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi),生理鹽水組瘤體生長較快,加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期,生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦,擁擠少動,飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1cm以后,生長速度較慢,荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤,大部分呈類圓形,個別形態(tài)不規(guī)則,色灰白,質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。加味左金丸各劑量組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論:加味左金丸抑制人大腸癌裸鼠移植瘤的增殖,延緩腫瘤的生長,其機制之一可能是與抑制MAPK信號通路相關(guān)的ERK/MAPK的表達有關(guān)。

    加味左金丸;裸鼠;移植瘤;ERK/MAPK信號通路

    MAPK信號通路的失調(diào)出現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)展的早期,很多證據(jù)顯示MAPK通路涉及結(jié)直腸癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。筆者采用人大腸癌細胞株HT29裸小鼠皮下移植瘤模型,觀察含黃連、吳茱萸等中藥組成的加味左金丸對裸鼠移植瘤的作用,并初步揭示其作用機制,為臨床更好應(yīng)用中藥抗腫瘤提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 癌細胞株HT29 HT29培養(yǎng)于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)液為含10%FBS的RPM I 1640。隔天更換培養(yǎng)液一次,每周傳代1~2次,傳代時用0.25%的胰酶消化處理和PBS洗滌。

    1.2 藥品與試劑 加味左金丸由黃連、吳茱萸、青黛組成,藥物購自廣東省中醫(yī)院。中藥煎煮過程:每次煎煮好一周劑量,先煮黃連和吳茱萸,用紗布濾出藥液,裝入大號研鉑中,倒入青黛慢慢研磨,盡量使青黛慢慢溶入藥液中,最后煎取所需藥液量,放入4℃冰箱備用。

    1.3 人大腸癌細胞株HT29裸小鼠移植瘤模型的制備HT29細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶80%~90%,用0.25%的胰酶消化后收集,制成單細胞懸液,懸浮于生理鹽水中。BALB/C裸鼠45只,飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院科學(xué)研究中心無菌飼養(yǎng)間內(nèi)(SPF級),裸鼠所用水、飼料、籠具一切器具均經(jīng)高壓蒸汽消毒法滅菌。

    1.4 動物分組及處理BALB/C裸小鼠(購自廣州維柏鑫生物科技有限公司,合格證號:1215708),4~6周齡,重量:18~22 g,45只,雌雄各半。觀察裸鼠均健康,取腫瘤細胞懸液,于每只裸鼠左側(cè)或右側(cè)脅腹部皮下注射0.2m L,細胞量為2×106/只。將人大腸癌皮下移植的裸小鼠隨機分為3組,盡量做到雌雄各半。①生理鹽水組:15只,生理鹽水0.5m L灌胃;②加味左金丸低劑量組:15只,以中藥湯藥0.67 g/kg灌胃,相當于60 kg成人用量;③加味左金丸高劑量組:15只,2 g/kg灌胃,相當于60 kg成人用量3倍。7天造模成功后,每組均連續(xù)灌胃1月。

    1.5 抑瘤率 觀察裸鼠成瘤時間,腫瘤生長特性。待腫瘤生長至15~75mm3時用于下一步實驗。每組灌胃結(jié)束后,用游標卡尺測量每組裸鼠移植瘤的大小。抑瘤率=1-(加味左金丸各劑量組結(jié)束時平均體積-加味左金丸各劑量組開始時平均體積)/(生理鹽水組結(jié)束時平均體積-生理鹽水組開始時平均體積)×100%。

    1.6 移植瘤ERK/MAPK活性 灌胃結(jié)束后的第2天,將裸鼠斷頸處死,快速取下移植瘤體,放入液氮中保存,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。細胞經(jīng)實驗因素處理后,離心收集。使用冰冷的PBS洗滌細胞3次,加入裂解緩沖液振蕩混勻,冰浴30m in,4℃12000 rpm、離心半徑10 cm離心10m in,取上清,即為胞質(zhì)蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進行SDS—PAGE,將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5m in。室溫下用5%脫脂奶粉(PBST溶解)封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗ERK1/2或抗β-actin(1∶2000)4℃孵育過夜。PBST洗脫3次,加入相應(yīng)的二抗,孵育1 h,漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色,暗室中曝光到X光片上,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

    1.7 移植瘤ERK/MAPK mRNA表達量 灌胃結(jié)束后的第2天,將裸鼠斷頸處死,快速取下移植瘤體,放入液氮中保存,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK m RNA的表達。采用Trizol試劑(美國IBCO公司),參照說明對各組組織總RNA進行提取。取2μLRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2m in后,94℃變性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min,35個循環(huán),最后72℃延伸7m in。取3μL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(EB)顯色,目的條帶用圖像分析系統(tǒng)作吸光度測定,以β-actin為內(nèi)參照,ERK/MAPKm RNA與β-actin吸光度的比值作為ERK/MAPKm RNA的相對含量進行半定量分析,比較不同組ERK/MAPKm RNA表達的差異。ERKMAPKm RNA的引物序列按cDNA文庫查獲,引物由上海賽百勝生物技術(shù)公司合成。β-actin的引物序列:上游引物5-GGATCAGCA AGCAGGAGTATGA-3,下游引物5-CGCAAGTTAGGTTTTT GTCAAGAAAGGGT-3,擴增片段長度為116 bp。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀況觀察 見圖1、圖2、圖3。移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3~5天,最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié),成瘤早期癌體基本成橢圓形,表面光滑,2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié),邊界清,略可活動,觸之質(zhì)中,逐漸不規(guī)則,表面凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi),生理鹽水組瘤體生長較快,加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期,生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦,擁擠少動,飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1 cm以后,生長速度較慢,荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤,大部分呈類圓形,個別形態(tài)不規(guī)則,色灰白,質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。

    圖1 2周加味左金丸低劑量組

    圖2 2周加味左金丸高劑量組

    圖3 2周生理鹽水組

    2.2 各組腫瘤生長抑制情況比較 見表1。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s)

    表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s)

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15開始時(cm3)0.095±0.005 0.074±0.004 0.067±0.007用藥第15天(cm3)0.512±0.074①②0.584±0.052①0.678±0.023結(jié)束時(cm3)0.741±0.065①②0.853±0.083①1.254±0.032抑瘤率(%)55.5 58.3

    2.3 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較 見表2。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s)

    表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s)

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15吸光值0.195±0.045①②0.235±0.025①0.364±0.057

    2.4 各組腫瘤組織ERK/MAPK mRNA表達量比較 見表3。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低(P<0.05)。加味左金丸各劑量組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s)×106

    表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s)×106

    與同期生理鹽水組比較,①P<0.05;與同期加味左金丸高劑量組比較,②P>0.05

    組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15 ERK/MAPKmRNA表達量2.344±0.395①②2.613±0.103①4.045±0.200

    3 討論

    近年來研究發(fā)現(xiàn),MAPK信號傳導(dǎo)通路是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的重要信號傳導(dǎo)通路之一,MAPK信號傳導(dǎo)通路及機制的闡明對于靶向干預(yù)相關(guān)疾病藥物的研究具有重要意義,必將為惡性腫瘤等重大疾病的治療提供新的思路[1]。雖然并行存在5條MAPK信號通路,其中ERK/MAPK途徑是細胞增殖調(diào)節(jié)最主要的途徑之一,該通路的活化在腸上皮細胞的分化中起了重要作用。ERK/MAPK信號通路的激活涉及結(jié)直腸癌的發(fā)病、進展和致瘤行為的證據(jù)越來越多[2]。ERK/MAPK途徑所有的激酶可能都是治療結(jié)直腸癌的有效靶點,現(xiàn)在許多研究小組在研制新的抑制劑。各條MAPK通路在結(jié)直腸癌中的精確作用成為研究熱點。

    加味左金丸為左金丸加青黛,青黛雖為后增藥物,但在處方配伍關(guān)系中居臣藥之位,黃連為君,青黛為臣,吳茱英為佐使。黃連性味苦寒,功效清熱、解毒、燥濕;青黛性味苦寒,功效清熱、解毒、瀉火;吳茱英性味辛溫,功效降逆止嘔、散寒止痛。方中重用黃連入胃、大腸經(jīng)以清熱毒、祛濕熱;青黛與之相須為用,更能增強君藥之功效;少佐辛溫之吳茱英以制君臣藥之過于寒涼,并降逆止嘔、止痛,以兼治惡心嘔吐、疼痛之癥狀。在本研究中,加味左金丸低劑量組對裸鼠移植瘤大腸癌的抑瘤率與高劑量組比較,差異不明顯;加味左金丸各劑量均能使ERK/MAPK的活性降低,抑制ERK/MAPK m RNA的表達,使大腸移植瘤的生長受到抑制。

    既往研究表明,在離體的條件下,黃連小檗堿和吳茱萸堿可以誘導(dǎo)大腸癌HT29細胞的凋亡,對HT29細胞生長有明顯的抑制作用,對HT29細胞端粒酶催化亞基(hTERT)表達有抑制作用[3~5];1,2-DMH誘導(dǎo)大腸癌實驗?zāi)P椭?,加味左金丸可以有效阻礙早期癌癥的發(fā)生和發(fā)展;在DMH誘導(dǎo)大腸癌的過程中,加味左金丸可以很顯著地干預(yù)癌癥的發(fā)生,在癌癥發(fā)展的進程中,加味左金丸可以有效地延緩癌癥的進程[6]。

    加味左金丸在本次試驗中對裸鼠腫瘤組織大小及腫瘤相關(guān)因子有較好的抑制作用,提示中醫(yī)藥防治療大腸具有一定優(yōu)勢,為中醫(yī)藥治療大腸癌提供新的思路與方法,為加味左金丸的臨床應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù),為大腸癌患者的中藥防治、阻斷癌前病變、改善預(yù)后和提高生活質(zhì)量開辟了一條新途徑,拓寬了中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的領(lǐng)域。

    [1]季宇彬,胡哲清,鄒翔.MAPK信號通路及其研究進展[J].中國藥理通訊,2010,27(2):17-18.

    [2]徐偉麗,孫文廣,馬鶯.MAPK信號通路與結(jié)直腸癌[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(2):389-392.

    [3]譚宇蕙,陳冠林,郭淑杰,等.小檗堿對人胃癌MGC-803細胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用[J].中國藥理學(xué)通報,2001,17:40-43.

    [4]常金榮,文彬,王汝俊,等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞凋亡及端粒酶催化亞基(hTERT)表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2008,24(2):6-8.

    [5]常金榮,文彬,王汝俊,等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞生長抑制和凋亡作用的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(3):191-195.

    [6]文彬,熊曼利,戴偉怡.左金丸及反左金丸對實驗性大腸癌不同時期甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(20):2074-2078.

    (責(zé)任編輯:駱歡歡)

    R285.5

    A

    0256-7415(2015)02-0230-03

    10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.107

    2014-09-11

    廣東省中醫(yī)藥局資助項目(20111209)

    胡麗娟(1978-),女,副主任中醫(yī)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合脾胃病學(xué)。

    猜你喜歡
    金丸成瘤大腸癌
    姜黃提取物對腎癌細胞炎癥反應(yīng)及體內(nèi)成瘤的調(diào)控作用研究
    楊云中
    說說三個“金丸”的功效和特點
    6齡黏蟲幼蟲受球孢白僵菌侵染后生長發(fā)育及體內(nèi)成瘤反應(yīng)的變化
    植物保護(2021年5期)2021-10-12 14:52:03
    腹水來源胃癌原代細胞的建立及鑒定*
    表達單純皰疹病毒受體HVEM的黑色素瘤B16-ova-HVEM細胞系的構(gòu)建及成瘤后oHSV2治療效果初探
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:42
    大腸癌組織中EGFR蛋白的表達及臨床意義
    FAP與E-cadherinN-cadherin在大腸癌中的表達及相關(guān)性研究
    左金丸及其加味藥在消化系統(tǒng)疾病防治中的研究進展*
    裴正學(xué)教授治療大腸癌經(jīng)驗
    99热国产这里只有精品6| 窝窝影院91人妻| 脱女人内裤的视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲专区字幕在线| 激情视频va一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| av天堂在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 最新的欧美精品一区二区| 国产成人av教育| 大码成人一级视频| av一本久久久久| 在线观看舔阴道视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费在线观看完整版高清| 亚洲九九香蕉| a级毛片在线看网站| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲五月色婷婷综合| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜精品国产一区二区电影| 村上凉子中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| aaaaa片日本免费| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人操中国人逼视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美黄色淫秽网站| 制服人妻中文乱码| 欧美性长视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产真人三级小视频在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品福利观看| 国产97色在线日韩免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产有黄有色有爽视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久天堂一区二区三区四区| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲专区字幕在线| 久久 成人 亚洲| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品欧美亚洲77777| 午夜老司机福利片| 免费在线观看亚洲国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 捣出白浆h1v1| 国产高清激情床上av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 香蕉久久夜色| 欧美激情久久久久久爽电影 | 成人国产一区最新在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品1区2区在线观看. | 久久精品91无色码中文字幕| 午夜福利在线观看吧| 一区在线观看完整版| 在线天堂中文资源库| 身体一侧抽搐| 在线观看舔阴道视频| 看片在线看免费视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 黄色视频,在线免费观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品电影一区二区在线| 99re在线观看精品视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av美国av| 国产精品久久视频播放| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产一区二区三区视频了| 在线观看一区二区三区激情| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 嫩草影视91久久| 国产精品国产av在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久香蕉激情| 国产激情欧美一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 1024香蕉在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 三级毛片av免费| 亚洲综合色网址| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美亚洲日本最大视频资源| 老司机靠b影院| 欧美精品高潮呻吟av久久| 91字幕亚洲| 成人免费观看视频高清| 国产国语露脸激情在线看| 国产高清国产精品国产三级| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 一级a爱片免费观看的视频| 国产午夜精品久久久久久| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 一进一出抽搐动态| 老司机福利观看| 成人18禁在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品一区二区在线观看99| 桃红色精品国产亚洲av| 国产片内射在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲专区中文字幕在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 成人手机av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| netflix在线观看网站| 免费在线观看影片大全网站| 成年动漫av网址| 国产精品一区二区在线观看99| 波多野结衣一区麻豆| √禁漫天堂资源中文www| 午夜两性在线视频| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久精品吃奶| 视频区图区小说| 一级毛片女人18水好多| 黄色 视频免费看| 国产真人三级小视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 大码成人一级视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜福利欧美成人| 欧美在线一区亚洲| 夜夜夜夜夜久久久久| 我的亚洲天堂| 中文字幕制服av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产麻豆69| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲五月色婷婷综合| 国产高清激情床上av| cao死你这个sao货| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99久久人妻综合| 国产精品免费一区二区三区在线 | 桃红色精品国产亚洲av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲中文字幕日韩| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄频高清免费视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久 成人 亚洲| 国产成人系列免费观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 午夜老司机福利片| 久久久久久久久免费视频了| 欧美成人午夜精品| 18禁国产床啪视频网站| 中亚洲国语对白在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产视频一区二区在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美精品av麻豆av| 丝袜美足系列| 新久久久久国产一级毛片| 视频区欧美日本亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久久久人人人人人| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲国产欧美网| 飞空精品影院首页| 老鸭窝网址在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品国产高清国产av | a在线观看视频网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 色尼玛亚洲综合影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲成人免费av在线播放| 成人亚洲精品一区在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲av成人一区二区三| 国产欧美日韩一区二区三区在线| www.999成人在线观看| 免费看十八禁软件| 欧美日韩一级在线毛片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成人特级黄色片久久久久久久| av视频免费观看在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 三级毛片av免费| 一级毛片高清免费大全| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美黑人精品巨大| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 校园春色视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 丁香欧美五月| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线观看一区二区三区激情| 电影成人av| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品无人区乱码1区二区| 国产1区2区3区精品| 悠悠久久av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 女警被强在线播放| 在线国产一区二区在线| 悠悠久久av| 久久久国产精品麻豆| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av国产精品久久久久影院| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| а√天堂www在线а√下载 | 少妇 在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品国产高清国产av | 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品国产区一区二| 香蕉丝袜av| 国产麻豆69| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久久精品免费免费高清| 男人的好看免费观看在线视频 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜久久久在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人妻 亚洲 视频| 一级片免费观看大全| 国产精品欧美亚洲77777| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产亚洲在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 天堂中文最新版在线下载| 香蕉久久夜色| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成伊人成综合网2020| 激情在线观看视频在线高清 | 国产激情久久老熟女| 午夜激情av网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 精品国产亚洲在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩免费高清中文字幕av| av在线播放免费不卡| a在线观看视频网站| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲成人免费av在线播放| 国产av精品麻豆| 国产成人av激情在线播放| 一区福利在线观看| 高清av免费在线| 乱人伦中国视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| 国产在视频线精品| 成在线人永久免费视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 久久青草综合色| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品偷伦视频观看了| 一级毛片高清免费大全| 国产在线观看jvid| 精品福利永久在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品一区二区三卡| 欧美日韩视频精品一区| 黑人操中国人逼视频| av视频免费观看在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av不卡在线播放| av视频免费观看在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产高清激情床上av| 欧美日韩福利视频一区二区| www日本在线高清视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美成狂野欧美在线观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 一级作爱视频免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品国产av在线观看| 视频区图区小说| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费日韩欧美在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 视频区图区小说| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品第一国产精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩大码丰满熟妇| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产成人精品在线电影| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 欧美 日韩 精品 国产| 国产午夜精品久久久久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久亚洲精品不卡| 免费在线观看亚洲国产| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产激情欧美一区二区| 国产真人三级小视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 人成视频在线观看免费观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲综合色网址| 一级黄色大片毛片| 宅男免费午夜| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩av久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久精品成人免费网站| av网站在线播放免费| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 男女床上黄色一级片免费看| 99热国产这里只有精品6| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品一二三| 热99re8久久精品国产| 9热在线视频观看99| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美黄色淫秽网站| 男女免费视频国产| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕色久视频| 国产亚洲欧美精品永久| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美激情在线| 国产成人系列免费观看| 成人免费观看视频高清| 久久久国产成人免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 成人影院久久| 美国免费a级毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 999精品在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 人妻久久中文字幕网| 国产在视频线精品| 天堂动漫精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产在线一区二区三区精| 亚洲一区二区三区欧美精品| 中文字幕最新亚洲高清| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99国产精品99久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲av第一区精品v没综合| 国产aⅴ精品一区二区三区波| tube8黄色片| 99香蕉大伊视频| 一本大道久久a久久精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 日韩欧美在线二视频 | 又大又爽又粗| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久香蕉激情| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品一区二区在线观看99| 黄色丝袜av网址大全| 免费黄频网站在线观看国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 色综合婷婷激情| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成电影免费在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 高清毛片免费观看视频网站 | 黄色视频不卡| 成人影院久久| 成年动漫av网址| 操美女的视频在线观看| 黄色 视频免费看| av网站免费在线观看视频| 91九色精品人成在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 一级片'在线观看视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 搡老熟女国产l中国老女人| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲综合色网址| 久热爱精品视频在线9| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲国产欧美网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久国产精品久久久| 丝袜在线中文字幕| 国产成人影院久久av| 91大片在线观看| 色在线成人网| 一级,二级,三级黄色视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久久久精品人妻al黑| 操美女的视频在线观看| 国产精品免费视频内射| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品人妻1区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 免费在线观看黄色视频的| 新久久久久国产一级毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品第一国产精品| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 国产一区二区三区视频了| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 99re在线观看精品视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久视频综合| 少妇被粗大的猛进出69影院| av天堂久久9| 丰满的人妻完整版| 日韩欧美在线二视频 | 在线播放国产精品三级| 国产一区在线观看成人免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲熟女毛片儿| 大型av网站在线播放| 一级毛片精品| 高清视频免费观看一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 美女午夜性视频免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品在线观看二区| 无人区码免费观看不卡| 丝袜在线中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲一区二区精品| 久久精品成人免费网站| 国产精品免费视频内射| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲一区中文字幕在线| 99国产精品一区二区蜜桃av | 18禁美女被吸乳视频| 精品福利观看| 一区在线观看完整版| 久久久国产欧美日韩av| 伦理电影免费视频| 国产精品一区二区在线观看99| 激情在线观看视频在线高清 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费观看a级毛片全部| 新久久久久国产一级毛片| 校园春色视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲专区字幕在线| 青草久久国产| 日韩成人在线观看一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | av国产精品久久久久影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧美激情在线| av片东京热男人的天堂| 午夜福利一区二区在线看| av国产精品久久久久影院| 51午夜福利影视在线观看| 国产视频一区二区在线看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品久久久人人做人人爽| 在线观看免费高清a一片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品国产美女av久久久久小说| 热re99久久国产66热| 一级片免费观看大全| 亚洲专区中文字幕在线| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲中文av在线| 岛国在线观看网站| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜福利乱码中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品在线观看二区| svipshipincom国产片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 制服诱惑二区| tube8黄色片| 黄色a级毛片大全视频| 午夜亚洲福利在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线永久观看黄色视频| 在线国产一区二区在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 黄片大片在线免费观看| 精品久久久久久,| 国产成人av激情在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 老司机靠b影院| 久久久久国产一级毛片高清牌| 捣出白浆h1v1| 精品福利观看| 亚洲欧美激情综合另类| 久久精品国产清高在天天线| av电影中文网址| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看66精品国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线免费观看的www视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区二区三区精品91| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美最黄视频在线播放免费 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av成人一区二区三| 十八禁人妻一区二区| 国产野战对白在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 电影成人av| 午夜免费成人在线视频| 黄片播放在线免费| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲五月天丁香| 久久 成人 亚洲| 精品久久久久久久毛片微露脸| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线看a的网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲黑人精品在线| 国产亚洲精品一区二区www | 中国美女看黄片| 91在线观看av| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费观看精品视频网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜免费观看网址| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 多毛熟女@视频| 三上悠亚av全集在线观看| 99riav亚洲国产免费| 女性被躁到高潮视频| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产欧美网| 丝袜美腿诱惑在线| 真人做人爱边吃奶动态| 美女高潮到喷水免费观看| 99国产精品99久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 大型av网站在线播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人手机av| 久久久精品区二区三区| 成人手机av| 午夜免费成人在线视频| 老司机福利观看|