鯉魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的初步研究

楊書婷等

摘要：利用凝膠層析法從鯉魚（Cyprinus carpio）卵中分離純化得到一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。選擇胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及其特異底物，建立比色法檢測，對初步分離的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性進行了分析。結(jié)果表明，絲氨酸蛋白酶抑制除對胰凝乳蛋白酶無抑制作用外，對其他的蛋白酶均有抑制效果；當溫度超過70 ℃時，絲氨酸蛋白酶抑制劑失活，但在pH 2～11均保持活性，具有較強的酸堿穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：絲氨酸蛋白酶抑制劑；比色法；酸堿穩(wěn)定性

中圖分類號：S917.4；TS254.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4556-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.041

蛋白酶抑制劑（Proteinase inhibitor，PI） 泛指對蛋白水解酶具有抑制活性的蛋白質(zhì)，由于其分子量相對較小，廣泛存在于植物、動物和微生物中[1，2]。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine protease inhibitory，SPI）首先在動物血清中被發(fā)現(xiàn)[3]，蛋白酶抑制劑因子的活性中心可與蛋白酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體從而發(fā)揮作用，防止不必要的蛋白酶水解。它們在調(diào)節(jié)蛋白酶活性及機體免疫調(diào)控方面發(fā)揮重要的功能，如纖維蛋白溶解作用、血淋巴凝結(jié)，細胞活素類、腫瘤調(diào)控機制及激素的轉(zhuǎn)運[4，5]。

中國淡水魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，動物蛋白資源仍有待開發(fā)[6]。目前，已有大量的報道針對魚類的下腳料如魚鱗中提取膠原蛋白和明膠[7]、魚內(nèi)臟中提取消化蛋白酶[8]和魚腦中提取磷脂[9]進行研究。然而對于魚卵的研究涉及較少，本試驗從鯉魚卵中分離純化出絲氨酸蛋白酶抑制劑，并對其酶動力學(xué)性質(zhì)進行初步研究，旨在為淡水魚和該蛋白酶抑制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚（Cyprinus carpio） 購于農(nóng)貿(mào)市場，體長20～30 cm，體重0.3～0.5 kg，為性成熟雌體；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及凝血酶均購自Sigma公司，發(fā)色底物Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride （B3133）、N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA（S4760）、N-CBZ-Gly-Gly-Leu-pNA （C3022）、N-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester（BTEE）、N-（p-Tosyl）-Gly-Pro-Arg pNA （T1637）均購自Sigma公司，其他試劑均為分析純，符合試驗要求。

主要儀器：pH計、SephadexG50層析柱（2.6 cm×100 cm）、TU-1901 紫外可見分光光度計、高速冷凍離心機、LGJ-10冷凍干燥機、酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶抑制劑的提取與純化 從新鮮鯉魚腹腔中取出魚卵，蒸餾水洗凈后加適量的純水，按1∶1（m∶V）的比例用研缽研磨至勻漿，離心30 min（10 000 r/min，4 ℃），收集上清液，重復(fù)3次，合并上清液，冷凍干燥備用。將凍干粉溶解于適量的pH 6.0的0.1 mol/L磷酸氫鹽緩沖液溶液中，10 000 r/min，4 ℃離心30 min，取上清液利用0.22 μm的濾膜過濾后加樣至SephadexG50層析柱（2.6 cm×100 cm）中，用pH 6.0的0.1 mol/L磷酸氫鹽緩沖液溶液（PBS）洗脫，流速為3.0 mL/min，收集活性組分，將收集的活性蛋白組分處理后加樣至SephadexG75層析柱（2.6 cm×100 cm）中，用0.1 mol/L PBS洗脫，收集其活性成分，冷凍干燥備用。

通過微量樣本多指標流式蛋白定量技術(shù)（BCA）試劑盒法測定蛋白質(zhì)的含量，以牛血清為標準品，酶標儀法在562 nm處測定收集樣品的吸光度。

1.2.2 蛋白酶抑制劑檢測及胰蛋白酶抑制常數(shù)的測定 在pH 7.8含有1 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-Hcl緩沖液反應(yīng)體系中，測定待測樣品于25 ℃對絲氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶水解生色底物的抑制影響。對枯草桿菌蛋白酶水解生色底物的抑制影響于pH 8.45含有1 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液反應(yīng)體系中進行。將不同含量的待測樣品（終濃度2.5～50 mg/mL）與蛋白酶（胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶濃度均為2 mg/mL，凝血酶濃度為100 U/mL）于25 ℃保溫15 min，加入濃度為1 mg/mL的底物（胰凝乳蛋白酶底物質(zhì)量濃度為5 mg/mL）起始反應(yīng)。于410 nm （胰凝乳蛋白酶253 nm）處連續(xù)2 min檢測吸光度的變化，通過比較添加抑制劑前后蛋白酶活力的變化來檢測抑制劑的抑制活性。1單位的酶活力定義為：在25 ℃酶催化底物產(chǎn)生1 nmol的硝基苯胺所需的酶量。

取胰蛋白酶分別與不同濃度的底物（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）于25 ℃，pH 7.8的條件下反應(yīng)，405 nm處連續(xù)檢測5 min測定蛋白酶的活力。根據(jù)底物的濃度、酶活力，利用公式Ki=[I]/（V0/V1+1）計算動力學(xué)常數(shù)，其中，[I]為鯉魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的濃度，V0為空白對照測定的反應(yīng)速度，V1為加入蛋白抑制劑的反應(yīng)速度。每組做3個平行試驗取平均值。

1.2.3 蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性檢測 參考Tzeng等[10]方法將純化后的樣品（終濃度為50 mg/mL）溶液于溫度梯度為30、40、50、60、70、80、90、100 ℃中加熱10 min，取出立即放置于冰上冷卻，并測定其殘留抑制劑活性；同時將樣品pH 2.0～5.0的50 mmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液；pH 6.0～8.0的50 mmol/L磷酸緩沖液；pH 9.0～10.0的50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液；pH 10.0～11.0的50 mmol/L磷酸-NaOH緩沖液。在25 ℃條件下反應(yīng)10 min，通過比較各pH條件下抑制劑的活性以反應(yīng)抑制劑的酸堿穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶抑制劑的分離純化

通過凝膠過濾層析可以使目的蛋白與魚卵中其他大量雜蛋白質(zhì)及一些酶類的結(jié)合狀態(tài)打開，達到快速、有效分離。結(jié)果顯示，經(jīng)SephadexG50分離純化，洗脫曲線出現(xiàn)了兩個相似的蛋白峰（圖1），通過胰蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶活性分析結(jié)果顯示，第一個蛋白峰具有蛋白酶活。合并收集具有酶活的蛋白洗出液。經(jīng)SephadexG75分離純化，洗脫結(jié)果顯示只出現(xiàn)1條曲線（圖2），其蛋白濃度為222.08 μg/mL。通過胰蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶活性檢測其峰值具有抑制活性，收集并冷凍干燥備用。

2.2 蛋白酶抑制劑活性及抑制常數(shù)的確定

魚卵中存在天然絲氨酸蛋白酶抑制劑。不同濃度的蛋白酶抑制劑，其抑制活性差別很大。如圖3所示，除對胰凝乳蛋白酶（BTEE）無明顯的抑制活性外，對胰蛋白酶（T1426）、枯草桿菌蛋白酶（P5380）、彈性蛋白酶（S4760）、凝血酶（T4648）均有不同程度的抑制。當?shù)鞍酌敢种苿舛葹?.5、5、10、25、50 mg/mL時，剩余酶活力分別達到80%、60%、40%、20%、10%以上。隨著蛋白酶抑制劑濃度的增加，其抑制活性逐漸增強。根據(jù)Ki公式計算得出，鯉魚卵蛋白酶抑制劑的抑制常數(shù)Ki為12.1 nmol/mL（n=3）。

2.3 魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑的pH及熱穩(wěn)定性

根據(jù)純化后的蛋白酶抑制劑的基本特性研究表明（圖4），該抑制劑的熱穩(wěn)定性溫度在30～70 ℃時，鯉魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑保持在85%以上，但溫度超過70 ℃時，則失去對特異性底物的水解活性。而鯉魚卵具有廣泛的酸堿穩(wěn)定性，在pH 2～11抑制劑的活性始終保持在85%以上，表明該蛋白酶抑制劑具有較好的pH穩(wěn)定性。溫度會影響蛋白酶抑制劑與蛋白酶的有效結(jié)合，而高溫會引起蛋白酶抑制劑發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)變化甚至使其活性喪失。

3 討論

魚卵中存在著高效的蛋白酶抑制劑[10-12]。而本研究通過凝膠色譜柱技術(shù)從鯉魚卵中分離出SPI，通過對該抑制劑的溫度和酸堿穩(wěn)定性的研究表明，鯉魚卵SPI在30～70 ℃有較好的穩(wěn)定性，在pH 3～11含有較好的酸堿穩(wěn)定性。溫度會影響蛋白酶抑制劑與蛋白酶的有效結(jié)合，而高溫會引起蛋白酶抑制劑發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)變化甚至使其活性喪失，根據(jù)蛋白酶抑制劑具有較好的耐溫及耐酸堿的特性，可以合理的控制魚類養(yǎng)殖的生存環(huán)境，以避免因惡劣環(huán)境的影響而造成養(yǎng)殖經(jīng)濟的損失。

胰蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶以及彈性蛋白酶都是先天免疫防御系統(tǒng)中占重要地位的體液免疫因子[13]。目前有Ustadi等[14]等在玻璃魚卵中提取蛋白酶抑制劑進行研究；郭強等[15]研究了四種魚卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑酶學(xué)活性比較。本試驗通過對這些蛋白酶的活性研究表明該抑制劑具有較好的專一抑制作用。其可針對病原性分泌的蛋白酶，選擇性消化病原體，改變真菌和細菌的生長速率來調(diào)控魚類的防御系統(tǒng)并重新構(gòu)建宿主防御體系。因此，可通過進一步純化技術(shù)得到純的SPI，通過生化分子技術(shù)分析其蛋白結(jié)構(gòu)序列及功能，以提高鯉魚魚卵的綜合利用效率。

參考文獻：

[1] KNIGHT P J K，CRICKMORE N，ELLAR D J. The receptor for Bacilius thuringiensis CryIA（c） deltaendotoxin in the brushborder membrane of the lepidopteran Manduca sexta is a minopeptiase[J].N Mol Microbiol，1994（11）：429-436.

[2] SANGADALA S，WALTERS F S，ENGLISH L H，et al.A mixture of Manduca sexta aninopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal CryIA（c） toxin binding and 86Rb+-K+ efflux in vitro[J]. J Biol Chen，1994，269：10088-10092.

[3] IRVING J A，STEENBAKKERS P J，LESK A M，et al. Serpins in prokaryotes[J].Mol Biol Evol， 2002，19：1881-1890.

[4] OPDENAKKER G ，VAN D J.Cytokines and proteases in invasive processes： Molecular similarities between in ammation and cancer[J].Cytokine， 1992（4）：251-258.

[5] KREM M M，CERA E D.Evolution of enzyme cascades from embryonic development to blood coagulation[J]. Trends in Biochemical Sciences，2002，27（2）：67-74.

[6] 張俊杰，曾慶孝.我國淡水魚魚糜的研究情況[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（9）：57-63.

[7] 盧 航，胡建恩，張 麗，等.羅非魚鱗明膠的制備及其酶解產(chǎn)物活性研究[J].食品科技，2013 （2）：75-79.

[8] 吳燕燕，李來好，郝志明，等.羅非魚肝臟中超氧化物歧化酶的提取、純化與分析[J].水產(chǎn)學(xué)報，2007，31（4）：83-90.

[9] 張 麗，胡建恩，劉 迪，等.超聲波輔助魚腦磷脂的方法研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2014，29（1）：66-69.

[10] TZENG S S，CHEN G H，JIANG S T.Expression of soluble thioredoxin fused-carp（Cyprinus Carpio） ovarian cystatin in Escherichia coli[J].Food Sci，2002，67：2309-2316.

[11] YAMASHITA M，KONAGAYA S.A novel cysteine protease inhibitor of the egg of chum salmon，containing a cystein erich thyroglobulin-like motif[J]. J Biol Chem，1996，271（3）：1282-1284.

[12] CHOI J H，PARK P J，KIM S K. Purification and characterization of a trypsin inhibitor from the egg of skipjack tuna Katsuwonus pelamis[J].Fisheries Science，2002，68：1367-1373.

[13]HOMVISES T，TASSANAKAJON A，SOMBOONWIW K.Penaeus monodon SERPIN，PmSERPIN6，is implicated in the shrimp innate immunity[J]. Fish&Shellfish Immunology，2010，29（5）：890-898.

[14] USTADI，KIM K Y，KIM S M. Purification and identification of a protease inhibitor from glassfish（Liparis tanakai） eggs[J]. J Agric Food Chem，2005，53（20）：7667-7672.

[15] 郭 強，歐 雪，周 平，等.四種常見魚卵對絲氨酸蛋白酶抑制劑活性比較[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（1）：221-229.