不同低溫脅迫下葡萄枝條抗寒生理指標(biāo)的分析

肖東明等

摘要：為了探究低溫脅迫對葡萄（Vitis L.）枝條相關(guān)生理指標(biāo)的影響，試驗以抗寒山葡萄左優(yōu)紅（V. amurensis Rupr. cv. Zuoyouhong）與不抗寒歐洲葡萄赤霞珠（V. vinifera L.cv. Cabernet Sauvignon）枝條為試材，比較了不同溫度（25、5、-5、-15 ℃）對葡萄枝條內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶與谷胱甘肽過氧化物酶活性以及總酚、木質(zhì)素與纖維素含量的影響。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，枝條中的超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢；總酚含量呈逐步減少的趨勢，且2種葡萄之間存在差異；纖維素含量呈先上升后下降的趨勢，與超氧化物歧化酶變化規(guī)律基本一致，木質(zhì)素含量變化無明顯規(guī)律，谷胱甘肽過氧化物酶經(jīng)過低溫處理后酶活性得到明顯提高。

關(guān)鍵詞：葡萄（Vitis L.）；枝條；溫度；抗寒力；生理指標(biāo)

中圖分類號：S663.1；Q944.55；Q948.112+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4509-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.030

葡萄（Vitis L.）是全球重要的果樹種類之一，主要分布于北緯30°～50°區(qū)間，被廣泛用于釀酒、制汁、制干與鮮食。中國的葡萄產(chǎn)區(qū)主要集中在北方地區(qū)，低溫冷害是北方葡萄生產(chǎn)中存在的主要問題，發(fā)生凍害的樹體需要一年或者多年才能恢復(fù)，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致樹體死亡，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的波動，致使生產(chǎn)者蒙受經(jīng)濟(jì)損失[1]。寧夏回族自治區(qū)葡萄產(chǎn)區(qū)作為全國最大的釀酒葡萄產(chǎn)地，其釀酒葡萄面積高達(dá)3萬hm2。該地區(qū)晝夜溫差大，光照充足，葡萄產(chǎn)量高、品質(zhì)好，在中國葡萄產(chǎn)地中具有獨特的優(yōu)勢；但是當(dāng)?shù)氐膰?yán)寒氣候是制約鮮食葡萄及釀酒葡萄大規(guī)模生產(chǎn)的重要限制因子。在葡萄的生長過程中，防止葡萄在低溫氣候中發(fā)生凍害是葡萄種植中最關(guān)鍵的一步。目前，寧夏葡萄產(chǎn)區(qū)越冬防寒的主要措施是采用埋土來防寒，盡管這樣做取得了一定的效果，但是冬季埋土防寒、春季出土上架造成了勞動力與財力的大量消耗，不僅增加了果農(nóng)的生產(chǎn)成本，并且在一定程度上破壞了葡萄園的生態(tài)環(huán)境。

因此，有必要對葡萄自身的抗寒性能進(jìn)行系統(tǒng)深入研究。國內(nèi)外有關(guān)葡萄抗寒性的研究已有很多報道，在低溫脅迫下，葡萄體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶活性、丙二醛、脯氨酸等生理生化產(chǎn)物均會產(chǎn)生變化，并被作為葡萄抗寒性鑒定的篩選指標(biāo)。試驗以不抗寒的歐洲釀酒葡萄品種赤霞珠（V. vinifera L.cv. Cabernet Sauvignon）與抗寒山葡萄品種左優(yōu)紅（V. amurensis Rupr. cv. Zuoyouhong）為研究對象，通過模擬不同低溫脅迫條件，測定一年生葡萄枝條的有關(guān)抗寒生理指標(biāo)，包括總酚、木質(zhì)素、纖維素含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性，旨在比較分析低溫脅迫下葡萄枝條相關(guān)抗寒生理指標(biāo)的變化規(guī)律，了解這些調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗寒性的關(guān)系，從而探索它們與低溫脅迫、抗寒能力的相關(guān)性，并對葡萄抗寒性鑒定的生理生化指標(biāo)進(jìn)行篩選，同時為培養(yǎng)葡萄抗寒新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗在寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒工程研究中心玉泉營實驗基地進(jìn)行采樣，該地位于北緯38°12′，東經(jīng)105°99′；參試的赤霞珠和左優(yōu)紅植株都為定植于園內(nèi)的五年生成年樹。在2013年9月3日進(jìn)行采樣，從生長勢一致的植株上收集一年生枝條，從基部第六節(jié)開始，每株剪取長40～50 cm、粗0.9～1.1 cm的枝條若干，剪取后用自來水、蒸餾水先后沖洗數(shù)次，用潔凈的紗布擦干，兩端封蠟，塑封后置于冰盒帶回實驗室。

1.1.2 試劑 試劑主要有福林肖卡溶液、飽和碳酸鈉、磷酸緩沖液、重鉻酸鉀、愈創(chuàng)木酚、甲基氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素、乙二胺四乙酸、乙醇、酸性茚三酮、冰醋酸、濃硫酸、硝酸、鹽酸、雙氧水、偏磷酸、丙酮、乙醚、硫代硫酸鈉、碘化鉀、磺基水楊酸等。

1.2 處理

在寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒工程研究中心實驗室將樣枝用蒸餾水沖洗干凈，均勻分為4份，其中3份分別在-15、-5、5 ℃的冰箱中進(jìn)行冷凍（藏）處理。降溫至設(shè)定溫度后持續(xù)24 h，之后將-5、-15 ℃處理的樣品統(tǒng)一放置在5 ℃環(huán)境中解凍4 h；另外1 份作為對照，在室溫（25 ℃）下放置24 h；然后選取不同處理的枝條進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3 抗寒生理指標(biāo)測定

將參試樣品分為兩部分，其中一部分枝條放置于通風(fēng)口處使其自然脫水，直至枝條干重不再發(fā)生變化，用組織破碎機(jī)粉碎，得到的粉末狀物過40 mm篩后，低溫儲存?zhèn)溆谩Ａ硗庖徊糠制咸阎l用蒸餾水沖洗干凈，避開芽眼，剪成薄片，混合均勻，取材料2.0 g切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿，低溫離心之后，取上清液測定有關(guān)生理指標(biāo)?？偡雍坎捎酶Ａ中たǚ╗2-4]測定，纖維素含量采用硫酸與重鉻酸鉀氧化法測定[5]，木質(zhì)素含量采用醋酸分離與硫酸水解法測定[6]，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[7]，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測定[7]，GSH-Px活性采用DTNB法測定[8]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行處理和繪圖，采用DPS 7.05統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對不同葡萄品種枝條總酚含量的影響

植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)是一類天然的自由基清除劑，具有很強(qiáng)的抗氧化活性；在嚴(yán)寒惡劣的環(huán)境里，這些酚含量會增加，以抵御或減少低溫脅迫使植物體內(nèi)所產(chǎn)生的自由基和活性氧對植物組織的傷害[9]。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條總酚含量的影響情況見圖1。從圖1可見，低溫脅迫明顯抑制了葡萄枝條內(nèi)可溶性總酚物質(zhì)的積累，隨著低溫脅迫強(qiáng)度的加大，2個品種的可溶性總酚含量呈現(xiàn)出逐步降低的變化趨勢，在常溫對照中，赤霞珠與左優(yōu)紅枝條內(nèi)的總酚含量達(dá)到最高值，分別為26.60、38.94 mg/g，隨后一路下降，且在-15 ℃的低溫脅迫下達(dá)到最低值，此時2個品種與常溫處理相比，枝條內(nèi)的總酚含量都降低了50%以上，并且2個品種在5、-5、-15 ℃處理后的總酚含量與對照相比多數(shù)處理差異極顯著（P<0.01），只有赤霞珠在5 ℃處理后的可溶性總酚含量與對照相比差異顯著（P<0.05）。通過以上數(shù)據(jù)可以看出，外界溫度對葡萄植株體內(nèi)總酚含量的影響還是較為明顯的，而且品種之間存在差異，左優(yōu)紅的可溶性總酚含量一直高于赤霞珠。

2.2 低溫處理對不同葡萄品種枝條纖維素含量的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條纖維素含量的影響情況見圖2。從圖2可見，赤霞珠與左優(yōu)紅枝條的纖維素含量均表現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢，并在-5 ℃處理后達(dá)到高值（-15 ℃處理后稍有回落），其纖維素含量分別從常溫處理的26.43%、27.19%升至-5 ℃處理的40.81%、43.73%。其中赤霞珠、左優(yōu)紅在5 ℃處理后枝條纖維素含量與對照相比差異顯著（P<0.05），而2個品種在-5、-15 ℃處理后枝條纖維素含量與對照相比差異極顯著（P<0.01）。

2.3 低溫處理對不同葡萄品種枝條木質(zhì)素含量的影響

在低溫脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)會有所增加，同時這些酚類物質(zhì)隨后會在細(xì)胞壁中轉(zhuǎn)化成為木質(zhì)素或木栓質(zhì)[9]。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條木質(zhì)素含量的影響情況見圖3。從圖3可見，低溫處理后，赤霞珠的枝條木質(zhì)素含量與對照相比，起伏較大，其在-5 ℃處理后枝條木質(zhì)素含量達(dá)到高點（43.28%），此時高于對照，與對照相比差異極顯著（P<0.01），但在5、-15 ℃處理后木質(zhì)素含量都明顯低于對照。而左優(yōu)紅的枝條木質(zhì)素含量在低溫處理后都比對照高，其中在5 ℃處理后枝條木質(zhì)素含量達(dá)到高點（48.19%），與對照相比差異極顯著（P<0.01）。

2.4 低溫處理對不同葡萄品種枝條POD活性的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條POD活性的影響情況見圖4。從圖4可見，低溫處理后，2個品種枝條的POD活性均出現(xiàn)了先上升、后下降的變化趨勢。其中赤霞珠的枝條在5 ℃處理后達(dá)到酶活性的最高點，為16.142 μg/g，與對照相比差異極顯著（P<0.01）；此后POD活性逐漸下降，與對照相比差異不顯著（P>0.05）。左優(yōu)紅的枝條POD活性在5 ℃處理后達(dá)到酶活性高點，與對照相比差異極顯著（P<0.01）；在-5 ℃處理后酶活性下降，與對照相比差異顯著（P<0.05）；在-15 ℃處理后POD活性繼續(xù)下降，與對照差異不顯著（P>0.05）。

2.5 低溫處理對不同葡萄品種枝條SOD活性的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條SOD活性的影響情況見圖5。從圖5可見，低溫處理后，2個品種枝條的SOD活性總體呈現(xiàn)出先上升、后下降的變化趨勢。在常溫條件下，左優(yōu)紅的SOD活性高于赤霞珠。受到5 ℃低溫脅迫后，赤霞珠的SOD活性快速提升，與對照差異極顯著（P<0.01）；而左優(yōu)紅提升的相對緩慢，與對照差異顯著（P<0.05）。在-5 ℃處理后，赤霞珠與左優(yōu)紅的SOD活性都達(dá)到高值，分別為123.34、128.84 U/g，與對照差異極顯著（P<0.01）。在-15 ℃處理后，赤霞珠與左優(yōu)紅的SOD活性都隨之回落，但SOD活性仍維持在高于對照的水平，赤霞珠的酶活性與對照差異顯著（P<0.05），左優(yōu)紅的酶活性與對照差異極顯著（P<0.01），說明低溫處理還是可以提高葡萄的抗寒性能的。

2.6 低溫處理對不同葡萄品種枝條GSH-Px活性的影響

GSH-Px作為一種重要的抗氧化酶，能夠清除植物體內(nèi)的自由基，從而減緩植物在逆境脅迫中所受到的傷害。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條GSH-Px活性的影響情況見圖6。從圖6可見，2個品種對照處理的GSH-Px活性相對較低，隨著溫度的降低，2個品種枝條中的GSH-Px活性表現(xiàn)出跨越式的提升。在5 ℃脅迫后赤霞珠與左優(yōu)紅的GSH-Px活性就達(dá)到高值，分別為18.56、17.81 kU/g，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。此后，在低溫脅迫程度繼續(xù)加劇的情況下，2個品種的GSH-Px活性出現(xiàn)少許回落，但維持在較高的水平，并仍然與比照差異極顯著（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

植物在逆境條件下能夠通過調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列生理生化過程來提高對逆境的抵御能力，并且在一定強(qiáng)度的溫度下，通過誘導(dǎo)植株細(xì)胞的代謝活動向著適應(yīng)低溫、增加抗寒性的方向發(fā)展。試驗中，葡萄品種赤霞珠、左優(yōu)紅枝條的POD活性隨著脅迫溫度的降低呈現(xiàn)逐步降低的變化趨勢，而SOD活性則是先上升、后下降，這與魯金星等[8]的研究結(jié)果一致；與未經(jīng)過低溫處理的枝條（對照）相比，經(jīng)過處理的枝條其SOD與POD的活性得到了一定的提升。在低溫脅迫條件下，植物體內(nèi)會超常積累活性氧自由基[10，11]，而這些物質(zhì)的積累加劇了膜脂過氧化，從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，最終破壞植物組織。在植物的保護(hù)酶系統(tǒng)中，SOD的作用是清除超氧自由基·O2-，同時產(chǎn)生歧化性產(chǎn)物H2O2；而POD的主要作用是酶促降解H2O2，使身處逆境脅迫下的植物能夠?qū)Υx過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)進(jìn)行抵御，表現(xiàn)出一定的抗逆性[12]，所以POD活性的高低體現(xiàn)了植物抗寒力的強(qiáng)弱[13]。低溫誘導(dǎo)可使葡萄細(xì)胞內(nèi)防御活性氧的酶促保護(hù)系統(tǒng)能力增強(qiáng)，從而維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高了葡萄的耐寒性。

酚類物質(zhì)是一類作用很強(qiáng)的自由基清除劑，在嚴(yán)寒時節(jié)，酚含量增加可以消除低溫使植物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基和活性氧對植物的傷害[14]；試驗里葡萄枝條中的總酚含量隨著脅迫溫度的降低而逐漸減少；但王麗雪等[15]、王靜[16]在研究植物葉片后發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)會在溫度逐漸降低的條件下大幅增加，并且半致死溫度低，抗寒性強(qiáng)。本試驗結(jié)果與之結(jié)論相悖，推測可能是由于枝條中的總酚轉(zhuǎn)移到了葉片中所致；從理論上說，清除自由基和活性氧有助于提高植物的抗寒性，但酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多[14，17]，具體哪種酚類物質(zhì)在低溫下起保護(hù)作用，是否能作為反映植物抗寒性的一個指標(biāo)，還需要進(jìn)一步試驗論證。

低溫脅迫下植物體內(nèi)的酚類化合物合成加速，這些酚類物質(zhì)隨后會進(jìn)入細(xì)胞壁間而轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素[18]。國外學(xué)者認(rèn)為木質(zhì)化與軟木質(zhì)沉積物能夠充當(dāng)細(xì)胞壁之間的防水隔離層，從而增強(qiáng)植物抵御低溫脅迫的能力[19]。本試驗中，葡萄品種赤霞珠、左優(yōu)紅的枝條纖維素含量隨著溫度的降低呈現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢；但木質(zhì)素含量卻呈現(xiàn)不同的變化。植物的抗寒性是由許多數(shù)量或質(zhì)量遺傳基因綜合作用累加的結(jié)果，每一個與抗寒性有關(guān)的性狀對木本植物的抗寒性都起一定的作用[16]。有研究表明，纖維素的合成與SOD、POD活性存在一定的相關(guān)性[20]，試驗也證明了這一點，纖維素的含量與SOD活性變化趨勢基本一致。在低溫脅迫環(huán)境下部分酶會出現(xiàn)響應(yīng)，比如木質(zhì)素代謝途徑[21]（咖啡酸3-O-甲基）出現(xiàn)變化，由此可以推斷纖維素與木質(zhì)素的合成會受到低溫的影響。但木質(zhì)素的合成是植物體內(nèi)比較復(fù)雜的生化過程，存在多基因、多條代謝途徑交互作用的結(jié)果，其中不乏抗寒基因表達(dá)途徑的關(guān)聯(lián)部分。

GSH（谷胱甘肽）作為一種重要的抗氧化劑，能夠清除生物體內(nèi)的自由基，從而減緩植物在逆境脅迫中所受到的傷害。而GSH-Px的作用就是將GSH轉(zhuǎn)化為GSSG（GSH的氧化形態(tài)）。從試驗結(jié)果可以看出，低溫脅迫能明顯誘導(dǎo)GSH-Px的活性，低溫處理與對照相比，前者的GSH-Px活性明顯高于后者。Logan等[19]將GR基因轉(zhuǎn)入棉花（Gossypium hirsutum L.）內(nèi)，在室內(nèi)模擬條件下將溫度由28 ℃降至14 ℃，使轉(zhuǎn)基因棉花的GSH活性比野生型棉花高30～40倍，表明轉(zhuǎn)基因棉花的抗逆境脅迫能力得到提高。康國章等[18]在自然低溫環(huán)境下對小麥（Triticum aestivum L.）葉片的抗凍生理指標(biāo)進(jìn)行測定，得出了GSH在葉片中只是一種應(yīng)激性物質(zhì)，并不宜作為評價植株受凍程度的指標(biāo)。目前，雖然認(rèn)為GSH-Px在植物的逆境生理中發(fā)揮著很重要的作用，但仍存在爭議。一種觀點認(rèn)為GSH-Px活性在逆境脅迫過程中的變化反映的是作物對逆境脅迫的積極適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程；另一種觀點認(rèn)為這種表現(xiàn)只是一種被動的受害癥狀。本研究初步探尋了低溫脅迫與GSH-Px的關(guān)系，得到了它們之間的一些規(guī)律，但其內(nèi)部作用機(jī)理還不很明晰，還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李玉梅，陳艷秋，李 莉.梨品種枝條膜透性和水分狀態(tài)與抗寒性的關(guān)系[J].北方果樹，2005（1）：3-5.

[2] 楊秀平，尉 芹，辛轉(zhuǎn)霞，等.單寧提取與測定實驗的改進(jìn)[J].科教文匯，2007（2）：26-30.

[3] 高 園，房玉林，張 昂，等.葡萄枝條中多酚類物質(zhì)的超聲波輔助提取[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，37（9）：77-82.

[4] 汪成東，張振文，宋士任.葡萄多酚物質(zhì)提取方法的研究[J].西北植物學(xué)報，2004，24（11）：2131-2135.

[5] 王金主，王元秀，李 峰，等.玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定[J].山東食品發(fā)酵，2010（3）：44-47.

[6] 郝建軍，康宗利，于 洋.植物生理實驗技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.101-178.

[7] 鄒 琦.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.163-165.

[8] 魯金星，姜寒玉，李 維.低溫脅迫對砧木及釀酒葡萄枝條抗寒性的影響[J].果樹學(xué)報，2012，29（6）：1040-1046.

[9] GRIFFITH M，YAISH M W. Antifreeze proteins in overwintering plants：A tale of two activities[J]. Trends Plant Sci，2004， 9（8）：399-405.

[10] 李美如，劉鴻先，王以柔.細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制與植物抗冷性機(jī)理的研究[J].生命科學(xué)，1996（4）：1-6.

[11] WISE R R，NAYLOR A W. Chilling-enhanced photooxidation evidence for the role of singlet oxygen and superoxide in thebreakdown of pigments and endogenous antioxidants[J].Plant Physiol， 1987， 83： 278-282.

[12] 曾超西，王以桑.水稻幼苗的低溫傷害與膜脂過氧化[J].植物學(xué)報，1997，29（5）：506-512.

[13] LEE E H， BENNETT J H. Superoxide dismutase：A possible protective enzyme agaist ozone injury in snapbeans （Phaseolus vulgaris L.）[J]. Plant Physiology，1982，69（6）：1444-1449.

[14] JANSKA A， MARSIK P， ZELENKOVA S， et al. Cold stress and acclimation-what is important for metabolic adjustment[J]. Plant Biol， 2010， 12（3）： 395-405.

[15] WANG L X， LI F R， ZHANG F R. Changes of total protein and peroxidase activity in grape shoots， and their relationships to cold resistance[J]. Journal of Inner Mongolia Insititute of Agriculture & Animal Husbandry，1996，17（1）：45-49.

[16] 王 靜.高寒地區(qū)植物中酚類物質(zhì)含量動態(tài)及其與抗寒性關(guān)系的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[17] CHALKER-SCOTT L， FUCHIGAMI L H. The role of phenolic compounds in plant stress responses[A]. PAUL H L. Low-Temperature Stress Physiology in Crops[M]. Florida： CRC Press Inc. Boca Raton， 1989. 27-40.

[18] 康國章，岳彩鳳，彭慧芳，等.凍害脅迫對小麥葉片抗寒生理生化指標(biāo)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（12）：56-60.

[19] LOGAN B A， MONTEIRO G， KORNYEYEV D， et a1. Transgenic overproduction of glutathione reductase does not protect cotton， Gossypium hirsutum （Malvaceae）， from photoinhibtion during growth under chilling conditions[J]. Am J Bot， 2003， 90：1400-1403.

[20] 徐宇強(qiáng)，胡 軼，付鳳玲，等.干旱脅迫下玉米自交系葉片木質(zhì)素含量變化及其與耐旱性的關(guān)系[J].玉米科學(xué)，2007，15（5）：72-75.

[21] 章霄云，郭安平，賀立卡，等.木質(zhì)素生物合成及其基因調(diào)控的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2006，4（3）：431-437.