TLR3在宮頸HPV16持續(xù)性感染及宮頸病變中的作用

唐榮榮，劉佳佳，劉榮，張麗志，羅遠(yuǎn)材，瞿全新

TLR3在宮頸HPV16持續(xù)性感染及宮頸病變中的作用

唐榮榮，劉佳佳，劉榮，張麗志，羅遠(yuǎn)材，瞿全新

目的：探討Toll樣受體3（TLR3）在宮頸人乳頭瘤病毒16（HPV16）持續(xù)性感染及宮頸病變中的作用。方法：選取宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查正常的HPV16陽性者157例，其中40例6個月后復(fù)查仍為HPV16陽性（HPV16持續(xù)感染組），117例6個月后復(fù)查轉(zhuǎn)為陰性（HPV16非持續(xù)感染組）。同時選擇同期就診的宮頸HPV16陽性、臨床病理資料完整的宮頸疾病患者共206例，其中A組119例（慢性宮頸炎102例、CINⅠ17例）、B組66例（宮頸CINⅡ～Ⅲ57例，原位癌9例）和C組21例（宮頸浸潤癌）。以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測TLR3及β干擾素（IFN-β）DNA相對表達(dá)量，應(yīng)用基因測序方法進(jìn)行TLR3基因突變分析。結(jié)果：HPV16持續(xù)感染組TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量低于HPV16非持續(xù)感染組（均P＜0.05）。HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量均呈正相關(guān)（均P＜0.001）。在HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組中均未檢測到TLR3擴(kuò)增片段的基因突變。HPV16陽性宮頸病變的3組患者TLR3及IFN-β DNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量均為A組高于B組及C組（均P＜0.05），B組高于C組（P＜0.05）。在不同級別宮頸病變中TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)（均P＜0.001）。結(jié)論：TLR3可能通過調(diào)控IFN-β表達(dá)而調(diào)節(jié)宮頸局部免疫功能，TLR3表達(dá)減低不僅與宮頸HPV16持續(xù)性感染有關(guān)，而且在宮頸癌前病變及宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

宮頸腫瘤；人乳頭瘤病毒16；感染；Toll樣受體3；干擾素β

【Abstract】Objective:To explore the role of TLR3 in HPV16 persistent infection and cervical lesions.Methods：Collected 157 cases HPV 16 infected patients whose liquid-base cervical cytology report is no intraepithelial lesion or malignancy（NILM）. After 6 months observation，among them，40 cases were detected HPV16 persistent infection（persistent infection group），and the other 107 cases turned to be negative（non-persistent infection group），meanwhile selected 206 cases HPV 16 infected patients and split them with different stages of cervical lesions into three groups:group A contains 119 cases（chronic cervicitis 102 cases and CINⅠ17 cases）；group B contains 66 cases（CINⅡ-Ⅲ57 cases and carcinoma in situ 9 cases）；group C contains 21 cases （cervical carcinoma 21 cases）.The expression of DNA TLR3 and IFN-β were detected by PCR.The mutation of TLR3 recycled productions were detected by gene sequencing respectively.Results：The expression levels of TLR3，IFN-β in persistent infection group were lower than those in non-persistent infection group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.TLR3 was positively correlated with IFN-β，which has statistically significant（P＜0.001）.The expressions of TLR3，IFN-β in different cervical lesions groups:in group A，B and C，the expression levels of TLR3 group A was higher than group B and group C（P＜0.05）；the expression levels of group B was higher than group C（P＜0.05）.The expression levels of IFN-β group A was higher than group B and group C（P＜0.05）；the expression levels of group B was higher than group C（P＜0.05）.In three groups TLR3 was positively correlated with IFN-β，which has statistically significant（all P＜0.001）.Conclusions：The low expression level of TLR3 leads to cervical local immune dysfunction by down-regulating the expression of IFN-β.The reduction of TLR3 expression is not only related with the cervical HPV 16 persistent infection but also plays an important role in regulating the occurrence and progression of cervical lesions and cervical cancer.

【Keywords】Uterine cervical neoplasms；Human papillomavirus 16；Infection；Toll-like receptor 3；Interferon-beta

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：445-448）

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變及宮頸癌的必要因素，但是導(dǎo)致宮頸高危型HPV持續(xù)感染的原因還不清楚。有研究表明，宮頸局部固有免疫功能降低與高危型HPV持續(xù)感染、宮頸病變密切相關(guān)。女性生殖道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體3（TLR3），參與局部黏膜抗細(xì)菌、病毒等病原感染的固有免疫應(yīng)答。目前TLR3抗病毒機(jī)制尚不明確，可能與其識別HPV并激活宮頸局部抗病毒免疫應(yīng)答、影響β干擾素（IFN-β）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本研究旨在探討TLR3在宮頸HPV16持續(xù)感染及宮頸癌與癌前病變中的作用及其機(jī)制。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2009年1月—2013年12月于天津市第一中心醫(yī)院（簡稱我院）行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查正常的HPV16陽性者157例，年齡27～69歲，未予治療，隨訪觀察6個月后復(fù)查，其中40例HPV16仍呈陽性（HPV16持續(xù)感染組），年齡22～59歲，平均（38.16±10.38）歲；117例轉(zhuǎn)為陰性（HPV16非持續(xù)感染組），年齡27～58歲，平均（40.42±7.13）歲。2組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.298，P=0.776），取宮頸脫落細(xì)胞前均未經(jīng)任何治療。同時選擇同期就診于本院的宮頸HPV16陽性、臨床病理資料完整的宮頸疾病患者共206例，根據(jù)病理檢查結(jié)果分為3組，A組119例（CINⅠ17例、慢性宮頸炎102例）年齡21～60歲，平均（37.50±9.87）歲；B組66例（CINⅡ～Ⅲ57例，原位癌9例）年齡27～69歲，平均（36.94±8.58）歲；C組21例（宮頸浸潤癌）年齡30～61歲，平均（39.39±9.82）歲。3組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.003，P= 0.369），收集宮頸脫落細(xì)胞前各組患者均除外傳染性疾病、肝腎疾病，均未接受手術(shù)、放療、化療及其他治療。

1.2試劑及材料全基因組DNA提取試劑盒為廣東凱普生物科技股份有限公司產(chǎn)品；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、乙二胺四乙酸（EDTA）均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為美國英杰生命技術(shù)有限公司（Invitrogen）產(chǎn)品，PCR所需引物設(shè)計、合成由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，TLR3基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1PCR檢測各組中TLR3、IFN-β DNA表達(dá)宮頸脫落細(xì)胞嚴(yán)格按照試劑盒要求提取DNA。PCR擴(kuò)增體系為2× Goldstar Taq MasterMix 12.5 μL，DNase/RNase-Free H2O 8.5 μL，DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min；循環(huán)擴(kuò)增35次，每個循環(huán)包括變性95℃30 s，退火59℃（β-actin、TLR3）、62℃（IFN-β）30 s，延伸72℃1 min；最后保持72℃5 min。PCR引物序列見表1。制備濃度為1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，用Bio-Rad成像分析軟件分析結(jié)果，目的DNA相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2目的片段純化、測序依照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒附帶的說明書，回收目的DNA片段?；厥蘸笏萌芤褐匦率褂铆傊悄z進(jìn)行電泳，驗證其確為目的片段后送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，定量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較行t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用LSD檢驗分析。TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　PCR引物序列

2　結(jié)果

2.1HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組中TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量HPV16持續(xù)感染組TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量低于HPV16非持續(xù)感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2　HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量?。ā纒）

表2　HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量?。ā纒）

組別　n　TLR3　IFN-β持續(xù)感染組　040　0.622±0.160　0.640±0.169非持續(xù)感染組　117　0.696±0.155　0.735±0.151 t 2.590　3.329 P 0.011　0.001

2.2HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量的相關(guān)性TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量散點圖見圖1，Pearson相關(guān)分析顯示持續(xù)感染組及非持續(xù)感染組中TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)（r分別為0.674及0.659，均P＜0.001）。

2.3HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3測序分析應(yīng)用基因測序方法分析TLR3基因突變情況，結(jié)果顯示TLR3在HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組中的擴(kuò)增片段均未見突變。見圖2、3（見后插二）。

2.43組宮頸病變中TLR3、IFN-β DNA相對表達(dá)量比較HPV16陽性的宮頸病變的3組患者TLR3 及IFN-β DNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。TLR3 DNA相對表達(dá)量A組高于B組及C組（均P＜0.05），B組高于C組（P＜0.05）。IFN-β DNA相對表達(dá)量A組高于B組及C組（均P＜0.05），B組高于C組（P＜0.05）。見表3。

圖1　HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量散點圖

表3　3組宮頸病變中TLR3及IFN-β DNA相對表達(dá)量比較　（±s）

表3　3組宮頸病變中TLR3及IFN-β DNA相對表達(dá)量比較?。ā纒）

組別　n　TLR3　IFN-β A組　119　0.661±0.159　0.722±0.169 B組　066　0.606±0.143　0.659±0.144 C組　021　0.507±0.160　0.483±0.143 F（P）　7.983（＜0.001）　12.163（＜0.001）組間比t（P）A∶B　02.211（0.031）　03.154（0.022）A∶C　10.849（0.000）　09.315（0.000）B∶C　06.097（0.024）　11.498（0.001）

2.5在不同級別宮頸病變中TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量的相關(guān)性宮頸病變中TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量散點圖見圖4，Pearson相關(guān)性分析顯示A組、B組及C組不同級別宮頸病變中TLR3與IFN-β DNA相對表達(dá)量均呈正相關(guān)（r=0.598，P＜0.001；r=0.675，P＜0.001；r=0.619，P＜0.001）。

3　討論

TLR3是最早發(fā)現(xiàn)的能特異性識別病毒雙鏈RNA（dsRNA）的病原體相關(guān)分子模式識別受體家族成員之一，可激活宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)，清除病毒［1-2］。TLR3主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，也可在上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，在機(jī)體抗感染、炎癥反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［3-4］。TLR3能識別病毒感染及其復(fù)制過程中暴露出來的dsRNA，從而上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子及抗病毒基因表達(dá)，參與抗病毒免疫與病毒清除［5-6］。研究顯示，宮頸上皮細(xì)胞表達(dá)TLR3，TLR3在宮頸HPV感染過程中發(fā)揮重要作用。

圖4　不同級別宮頸病變中TLR 3與IFN-βDNA相對表達(dá)量散點圖

3.1TLR3在宮頸 HPV16持續(xù)感染中的作用TLR3表達(dá)與HPV16清除及其確切作用機(jī)制尚不明確，推測可能是通過某些相關(guān)信號通路激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體IFN-β表達(dá)水平，從而清除HPV16病毒感染。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組相比，TLR3 DNA相對表達(dá)量下降，提示TLR3可能在HPV16病毒清除過程中發(fā)揮積極作用，TLR3表達(dá)水平降低可導(dǎo)致宮頸局部免疫功能異常，從而導(dǎo)致HPV16持續(xù)感染。

IFN-β是由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，具有抗病毒作用，同時還可增強(qiáng)自然殺傷（NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞活力，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組相比，IFN-β DNA相對表達(dá)量下降，而且TLR3表達(dá)水平與IFN-β表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示宮頸TLR3可能通過調(diào)節(jié)IFN-β途徑參與宮頸局部抗HPV免疫反應(yīng)。

Andersen等［4］通過檢測表達(dá)HPV16 E6 E7的宮頸管內(nèi)口、宮頸陰道部及陰道上皮細(xì)胞內(nèi)的TLR3表達(dá)量，證實TLR3可能在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞促炎因子和女性下生殖道局部環(huán)境抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。Daud等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在HPV16隨后被清除的宮頸標(biāo)本中，TLR3表達(dá)升高，而在HPV16持續(xù)感染的宮頸標(biāo)本中，TLR3表達(dá)無升高。經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)，在后來HPV被清除的婦女中，這些TLR3表達(dá)量明顯高于HPV持續(xù)感染的婦女，因此認(rèn)為，TLR3表達(dá)增高對局部病毒清除是必要的。

本研究對HPV16持續(xù)感染組與非持續(xù)感染組所擴(kuò)增的TLR3片段進(jìn)行基因測序，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該片段基因突變，其原因可能是樣本量小或TLR3表達(dá)降低的主要機(jī)制并非基因突變，而是由于甲基化等表觀遺傳學(xué)改變，這將為TLR3相關(guān)研究提供新方向。

3.2TLR3在宮頸病變發(fā)生發(fā)展過程中的作用本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16陽性宮頸病變的3組患者TLR3 及IFN-β DNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示TLR3在宮頸病變發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能與下調(diào)IFN-β表達(dá)有關(guān)。Jiang等［8］研究發(fā)現(xiàn)，TLR3高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞具有清除作用。其可能機(jī)制是宮頸病變可上調(diào)TLR3表達(dá)，通過激活MyD88非依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（如IFN-β等）及其他炎性因子，激活相應(yīng)免疫細(xì)胞，從而殺傷病毒感染、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；當(dāng)TLR3表達(dá)水平異?；蛞蚧颊呦忍煲蛩貙?dǎo)致TLR3無法大量表達(dá)，以致不能引起足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)，無法有效清除病毒感染和異常細(xì)胞，導(dǎo)致宮頸病變進(jìn)一步進(jìn)展。

因此，本研究結(jié)果認(rèn)為，TLR3可能通過調(diào)控IFN-β表達(dá)而調(diào)節(jié)宮頸局部免疫功能，TLR3表達(dá)降低不僅與宮頸HPV16持續(xù)性感染有關(guān)，而且在宮頸癌前病變及宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。但TLR3是否主要通過IFN-β發(fā)揮免疫作用，仍需進(jìn)一步研究。

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Study on the Role of TLR3 in Cervical HPV16 Persistent Infection and Cervical Lesions

TANG Rong-rong，LIU Jia-jia，LIU Rong，ZHANG Li-zhi，LUO Yuan-cai，QU Quan-xin.Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China（TANG Rong-rong，LIU Jia-jia，LIURong，ZHANGLi-zhi，LUOYuan-cai，QUQuan-xin）；TianjinXiqingHospital，Tianjin300380，China（TANGRong-rong）

QU Quan-xin，E-mail：cqjqx@sina.com

2014-12-16）

［本文編輯王琳］

天津市衛(wèi)生局攻關(guān)課題（11KG101）

300192天津市第一中心醫(yī)院（唐榮榮，劉佳佳，劉榮，張麗志，羅遠(yuǎn)材，瞿全新）；天津市西青醫(yī)院（唐榮榮）

瞿全新，E-mail：cqjqx@sina.com