丙泊酚對大鼠S1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響

何炯策，張宇，劉興奎，喻田

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院　麻醉科，浙江　溫州　325027；2.遵義醫(yī)學(xué)院　麻醉學(xué)系，貴州　遵義563003）

·論 著·

丙泊酚對大鼠S1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響

何炯策1，張宇2，劉興奎2，喻田2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325027；2.遵義醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，貴州遵義563003）

目的：觀察丙泊酚對大鼠感覺皮層（S1）區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響。方法：制備SD大鼠（鼠齡7～14 d）腦片，采用全細胞膜片鉗技術(shù)測定電流及電壓。加入不同濃度（10、30、100、300 μmol/L）丙泊酚，記錄各組神經(jīng)元鈉電流（INa），繪制電流電壓（IV）曲線、穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線及去失活曲線并計算相關(guān)參數(shù)。向神經(jīng)元施加幅度50 pA、刺激時程30 ms的去極化刺激電流，記錄各組神經(jīng)元動作電位。結(jié)果：丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控性INa，加快鈉通道的失活過程，使穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向移動，延緩鈉通道失活后的恢復(fù)，但并不影響鈉通道的激活過程。丙泊酚呈濃度依賴性（濃度為10、30、100 μmol/L）抑制大鼠S1區(qū)神經(jīng)元動作電位的超射值（P＜0.01），對電位閾值有一定的影響（100 μmol/L，P＜0.01），300 μmol/L的丙泊酚可以完全抑制動作電位的形成。結(jié)論：丙泊酚對大鼠丘腦皮層環(huán)路中的S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位具有抑制作用，可能是其誘導(dǎo)的全身麻醉作用的機制之一。［關(guān)鍵詞］ 丙泊酚；膜片鉗；鈉通道；動作電位；大鼠

相關(guān)研究顯示，全麻藥物通過影響大腦和脊髓關(guān)鍵區(qū)域的突觸傳遞和離子通道發(fā)揮作用［1-2］，且藥物的中樞抑制作用與各腦區(qū)之間信息的傳遞、處理、整合及分離過程密切相關(guān)［3-4］。目前對丙泊酚全麻機制的研究主要集中在其對大鼠海馬、丘腦、脊髓等的影響，對皮層神經(jīng)元電生理學(xué)的作用研究報道則較少，其誘導(dǎo)的全身麻醉作用與皮層電壓門控離子通道是否有關(guān)尚需進一步探討。初級軀體感覺皮層（S1）是大鼠丘腦皮層環(huán)路中軀體感覺信息傳遞的關(guān)鍵腦區(qū)之一，本實驗擬使用腦片膜片鉗技術(shù)，采用全細胞記錄模式，檢測不同濃度丙泊酚對大鼠S1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位的影響。

1　材料和方法

1.1材料 動物：健康SD大鼠，SPF級，鼠齡7～14 d，雌雄不拘。藥品與試劑：丙泊酚（阿斯利康公司），河豚毒素（TTX，Sigma公司），人工腦脊液（ACSF）：126 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl2，2 MgSO4· 7H2O，1.5 NaH2PO4·2H2O，25 NaHCO3，10 Glucose· H2O（mmol/L）；鈉離子通道記錄電極內(nèi)液：140 CsCl，5 NaCl，1 CaCl2，10 HEPES，10 EGTA，2 MgCl2·6H2O，2 Na2-ATP（mmol/L）；動作電位記錄電極內(nèi)液：120 KCl，1 CaCl2，10 HEPES，10 EGTA，2 MgCl2·6H2O，3 Na2-ATP（mmol/L）。儀器：EPC10膜片鉗放大器，德國HEKA公司；PCS-5400微電極操縱器，美國Burleigh公司；BX51W1-IR7顯微鏡，日本Olympus公司；HM 650V全自動振動式切片機，美國Thermo公司；P-97微電極拉制儀，美國Sutter公司。

1.2方法

1.2.1分組方法：設(shè)立對照組（Control組）和實驗組，Control組腦片灌流普通ACSF，實驗組腦片根據(jù)ACSF中所含丙泊酚濃度的不同分為：丙泊酚10 μmol/L（Pro10組），丙泊酚30 μmol/L（Pro30）組，丙泊酚100 μmol/L（Pro100）組及丙泊酚300 μmol/L（Pro300）組，各組腦片例數(shù)為8（n=8）。

1.2.2腦片的制備方法：健康SD大鼠乳鼠快速斷頭，快速剝出全腦置于氧混合氣（95% O2+5% CO2）飽和的0～4 ℃的ACSF中5 min。使用Thermo HM 650V全自動振動式切片機沿冠狀面制備出包含S1區(qū)厚度為300 μm的腦切片，置于腦片孵育槽中。在控制32 ℃下平衡孵育30 min，復(fù)溫30 min。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用PatchMaster軟件記錄電信號，F(xiàn)itMaster、SPSS 19.0、Origin7.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)提取、統(tǒng)計分析和圖表繪制。所得數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較用單因素方差分析。鈉通道的激活：利用公式G=I/（V-Vrev）將所得的鈉電流峰值轉(zhuǎn)換成電導(dǎo)值，以電導(dǎo)值與最大電導(dǎo)值的比值及對應(yīng)膜電位繪制出各組鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線。用Boltzmann方程G/Gmax=1/｛1+exp［V-V1/2］/κ｝進行擬合，式中G為電導(dǎo)，V為膜電位，V1/2為半數(shù)激活電壓，κ為曲線斜率因子。鈉通道的失活使用Boltzmann方程I/Imax=1/｛1+exp［V-V1/2］/κ｝進行擬合，求得半數(shù)失活電壓和曲線斜率因子。鈉通道去失活根據(jù)單指數(shù)方程I/Imax=1-exp（-t/γ）進行擬合，式中I和Imax分別為不同恢復(fù)時間的電流大小和條件脈沖誘發(fā)的電流，t為恢復(fù)時間，γ為通道恢復(fù)的時間常數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1S1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道電流圖

采用鈉通道的細胞外液和電極內(nèi)液，全細胞記錄模式形成后，置鉗制電位于-80 mV，給予神經(jīng)元一幅度-30 mV，刺激時程20 ms的去極化脈沖刺激電壓可誘發(fā)一快速激活與失活的內(nèi)向電流，該電流可被1 μmol/L的鈉通道阻斷劑TTX所阻斷，證實其為TTX敏感的INa，見圖1。

圖1　TTX對大鼠S1區(qū)錐體神經(jīng)元INa的阻斷作用

2.2丙泊酚對電壓門控鈉通道IV曲線的影響 置鉗制電位于-80 mV，給予脈沖幅度為-80 mV～+60 mV，脈沖寬度20 ms，步幅+10 mV的去極化脈沖刺激電壓，可激發(fā)一系列INa，見圖2。以不同膜電位為橫軸，該膜電位下的INa峰值為縱軸，繪制INa的IV曲線。丙泊酚作用穩(wěn)定后，INa的IV曲線顯著上移，但INa的激活閾電位沒有明顯變化（約-60 mV），且在-30 mV能夠激發(fā)最大INa，見圖3。隨著丙泊酚濃度的升高，INa峰值呈濃度依賴性下降，見圖4。

圖2　鈉通道電流的刺激方波和記錄的電流曲線

圖3　各組電壓門控鈉通道電流IV曲線

圖4　各組對鈉通道電流峰值的抑制

2.3丙泊酚對電壓門控鈉通道激活及失活的影響

置鉗制電位于-80 mV，預(yù)置-120 mV超極化電壓500 ms，然后從-80 mV起給予10 mV步幅遞增，12 ms脈寬的去極化脈沖刺激至0 mV，記錄各組神經(jīng)元INa變化，見圖5。以電導(dǎo)值與最大電導(dǎo)值的比值及對應(yīng)膜電位繪制出各組鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線，見圖6。INa穩(wěn)態(tài)激活曲線均呈S型，與正常組曲線相比，其他各組曲線沒有明顯的移位，INa的半數(shù)激活電壓V1/2及斜率因子κ也未發(fā)生顯著變化，見表1。置鉗制電位-100 mV，先給予-100～-10 mV，步幅10 mV，刺激波寬500 ms的階梯鉗制預(yù)脈沖刺激，間隔1 ms之后，再給予-30 mV的測試脈沖刺激，刺激波寬12 ms，記錄各組測試脈沖下鈉通道電流，見圖7。以電流值與最大電流值的比值及對應(yīng)膜電位繪制出各組INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線，見圖8。各組鈉通道電流穩(wěn)態(tài)失活曲線均呈反S型，與正常組曲線相比，其他各組曲線向左（超極化方向）移位。丙泊酚呈濃度依賴性加快鈉通道電流的失活，使失活曲線向超級化方向移動，除Pro300組外基本上不改變曲線斜率因子。

圖5　鈉通道電流激活的刺激方波和記錄的電流曲線

圖6　各組電壓門控鈉通道電流穩(wěn)態(tài)激活曲線

表1　各組INa半數(shù)激活電壓和激活斜率因子（n=8）

表1　各組INa半數(shù)激活電壓和激活斜率因子（n=8）

分組　　激活　　失活V1/2　　κ　V1/2　　κ Control-48.08±0.65 4.75±0.71　-51.07±2.14b6.73±0.26bPro10　-48.44±1.23 4.43±0.51　-52.63±1.48b6.96±0.57bPro30　-48.58±0.76 4.38±0.60　-56.52±1.39b7.16±0.73bPro100　-49.03±1.41 4.35±0.72　-61.58±1.43b7.71±0.87bPro300　-49.18±1.71 4.13±0.47　-66.92±1.78b8.70±1.19a與Control組比：aP＜0.05，bP＜0.01

2.4丙泊酚對電壓門控鈉通道去失活的影響 置鉗制電位于-80 mV，給予-10 mV的條件脈沖12 ms，然后給予-10 mV的去極化測試脈沖20 ms，兩個刺激間隔保持鉗制在-80 mV，間隔時程從2～20 ms，刺激間隔2 ms，記錄各組INa變化，見圖9。與正常組曲線相比，其他各組曲線下移，曲度逐漸減小，見圖10。各組的通道恢復(fù)時間常數(shù)隨著丙泊酚濃度增加而逐漸延長，見圖11。

圖7　鈉通道電流失活的刺激方波和記錄的電流曲線

圖8　各組電壓門控鈉通道電流穩(wěn)態(tài)失活曲線

圖9　鈉通道去失活的雙脈沖刺激方波和記錄的電流曲線

2.5丙泊酚對神經(jīng)元由單刺激引發(fā)的動作電位的影響 全細胞記錄模式形成后，在電流鉗模式下，給予神經(jīng)元一幅度50 pA，刺激時程30 ms的去極化脈沖刺激電流，誘發(fā)動作電位發(fā)放，見圖12。300 μmol/L組的丙泊酚可以完全抑制動作電位的形成，只形成刺激電流引起的電緊張，因此Pro300組相關(guān)數(shù)據(jù)不予統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示丙泊酚使神經(jīng)元動作電位的幅度（超射值）呈濃度依賴性下降，除Pro100組外基本上不改變其閾值，見表2。

圖10　各組電壓門控鈉通道失活后的恢復(fù)曲線

圖11　各組電壓門控鈉通道失活后恢復(fù)的時間常數(shù)

圖12　丙泊酚對大鼠S1區(qū)神經(jīng)元動作電位的影響

3　討論

全身麻醉藥物在中樞系統(tǒng)存在多個作用靶點，目前認為麻醉藥物通過影響神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸傳遞和離子通道的狀態(tài)，抑制興奮性神經(jīng)元傳遞并加強抑制性神經(jīng)元傳遞［5］。實驗結(jié)果表明，丙泊酚對大鼠S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉通道存在抑制作用，一方面以濃度依賴性的方式抑制鈉通道電導(dǎo)，降低INa，另一方面通過改變通道動力學(xué)特性，加快通道的失活，延緩?fù)ǖ赖娜ナЩ睢１捶与m然不影響鈉通道的激活過程，但各組丙泊酚均使鈉通道失活曲線向左移動，半數(shù)失活電壓逐漸向超級化方向變化，說明丙泊酚能促進鈉通道的失活，減少神經(jīng)元細胞膜上可激活的鈉通道數(shù)量，從而減少神經(jīng)沖動的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，達到中樞抑制作用。同時，丙泊酚呈濃度依賴性延長鈉通道失活后的恢復(fù)時間，通過延緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮幕謴?fù)過程，減弱神經(jīng)元對刺激的反應(yīng)性，使細胞興奮性降低。這些結(jié)果表明丙泊酚可能通過作用于鈉通道的不同位點或者他們的調(diào)節(jié)器發(fā)揮其對通道的不同效應(yīng)，最終產(chǎn)生全麻效應(yīng)。

表2　各組動作電位特性（n=8，mV）

表2　各組動作電位特性（n=8，mV）

與Control組比：aP＜0.01

分組　　超射值　　閾值Control　34.87±1.17b　-42.16±0.55bPro10　29.49±0.48b　-41.79±0.66bPro30　25.56±0.56a　-41.32±0.99bPro100　10.72±0.31a　-37.93±1.30a

離子通道是生物體內(nèi)信息傳遞的基本單位，是細胞興奮性的基礎(chǔ)。動作電位是可興奮性細胞興奮標(biāo)志，是細胞生命活動的基礎(chǔ)。鈉通道開放引起去極化內(nèi)向電流是動作電位產(chǎn)生和傳遞的基礎(chǔ)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元之間、各腦區(qū)間進行信息交流和調(diào)控的必要條件。本研究結(jié)果顯示丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區(qū)神經(jīng)元動作的超射值并對電位閾值產(chǎn)生了一定的影響，這種抑制則是通過影響鈉通道來實現(xiàn)的。丙泊酚能抑制鈉通道電流，INa的強度則決定動作電位的幅值，因此動作電位的超射值隨丙泊酚濃度的增加而顯著下降。另一方面丙泊酚通過加快通道失活和對電流的抑制共同影響動作電位的去極化。動作電位的傳導(dǎo)速度和幅度與鈉通道的功能狀態(tài)和鈉離子驅(qū)動力等因素有關(guān)，丙泊酚可改變動作電位的傳導(dǎo)特性并使神經(jīng)元興奮性下降。

目前的神經(jīng)生物學(xué)理論認為，意識的產(chǎn)生是大范圍、各層次的腦神經(jīng)共同參與的結(jié)果，包括皮層、丘腦和中腦（主要為腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)）在內(nèi)的各腦區(qū)必須共同參與對外界信號刺激的識別和處理，而最終產(chǎn)生意識。感覺信息的處理加工在意識的形成過程中起著至關(guān)重要的作用［6］，各種感覺信息需要經(jīng)過腦干的相應(yīng)核團傳輸?shù)角鹉X腹側(cè)基底復(fù)合體，然后傳遞到初級感覺皮質(zhì)區(qū)，最后擴散到鄰近的感覺聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)及額葉聯(lián)合皮質(zhì)［7］。中樞整體整合的觀點認為意識覺醒的狀態(tài)與整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)整合活動有關(guān)［8］。全麻藥物對這種整合活動的抑制或阻斷可能最終導(dǎo)致了意識的消失。整個神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部存在著神經(jīng)元之間、各腦區(qū)間復(fù)雜的信息交流方式，提示藥物的作用位點應(yīng)該是多水平、多方面的，任何單一的位點或作用機制不能解釋麻醉的整體效應(yīng)［9］。本研究顯示丙泊酚對皮層神經(jīng)元電壓門控鈉通道及動作電位存在抑制作用，該抑制效應(yīng)可能通過傳入、傳出神經(jīng)纖維各種方式的級聯(lián)、整合而影響相關(guān)的腦區(qū)，發(fā)揮更廣泛的中樞效應(yīng)。

綜上所述，丙泊酚對大鼠丘腦皮層環(huán)路中的S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道及動作電位具有抑制作用，可能是其誘導(dǎo)的全身麻醉作用的機制之一。

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（本文編輯：吳彬）

Effects of propofol on voltage-gated sodium channels and single action potention of S1 neurons in rats

HE Jiongce1， ZHANG Yu2， LIU Xingkui2， YU Tian2. 1.Department of Anesthesia， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Anaesthesiology， Zunyi Medical College，Zunyi， 563003

Objective: The aim of this study is to investigate the effects of propofol on voltage-gated sodium channels and single action potention （AP） of primary S1 neurons in rats. Methods: Brain slices were prepared from SD rats of 7 to 14 days old， and whole-cell patch clamp technique was used to record currents and voltages. After application with propofol at different concentrations （10-300 μmol/L）， the sodium currents （INa） were recorded. Data were used to make current-voltage curve， steady-state activation curve， steady-state inactivation curve，deinactivation curve and account characteristic parameters. AP was activated by a 30 mspulse of 50 pA， the data of each group were taken for analysis. Results: Propofol inhibited INA of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner （10-300 μmol/L）. It also inhibited the inactivation of sodium channels， shifted the inactivation curve towards the hyperpolarzating potential， and prolonged the recovery of sodium channels from their deinactivation，however it did not affect activation of sodium channels. Propofol inhibited the overshoot of single AP of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner （10-100 μmol/L， P＜0.01）， and also depressed the overshoot （100 μmol/L，P＜0.01）， there was no AP be activated at 300 μmol/L. Conclusion: Propofol shows an inhibitory effect on voltage-gated sodium channels and AP of S1 neurons in the thalamocortical circuit， which may play a role in the mechanisms of propofol-induced general anesthesia.

propofol； patch clamp； sodium channel； action potention； rats

R614.1

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.001

2015-04-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（81060266）。

何炯策（1986-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

劉興奎，教授，Email：xkliu@zmc.edu.cn。