一株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素菌株的篩選與鑒定

嚴(yán)曉娟，宋勇強(qiáng)*，?！?，胡先望

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

一株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素菌株的篩選與鑒定

嚴(yán)曉娟，宋勇強(qiáng)*，牛犇，胡先望

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

采用梯度稀釋平板分離法從土壤中分離菌種，并通過與研究中心實驗室購買和保存的其他11株菌株進(jìn)行比較，最終篩選出了一株香蘭素摩爾轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率相對較高的菌株B7，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗結(jié)果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

阿魏酸；香蘭素；篩選；鑒定

香蘭素（vanillin）又名香草醛、香草素、香蘭醛或香茅醛、甲基原兒茶醛、凡尼林［1］?；瘜W(xué)名稱4-羥基-3-甲氧基苯甲醛。香蘭素具有香莢蘭豆的香氣，白色至黃色針狀或粉末狀結(jié)晶，微溶于水（1 g/100 mL，20℃），易溶于乙醇、苯甲基苯甲酸酯、冰醋酸、二硫化碳、吡啶、脂肪和芳香酯等有機(jī)溶劑和強(qiáng)堿溶液中。易受光化作用的影響，在空氣中逐漸氧化。香蘭素具有較低的氣味識別閾值，在生產(chǎn)和儲存過程中容易攜帶其他氣味［2-3］。無毒、對人和動物無害，對皮膚和黏膜有局部的刺激［4］。香蘭素是一種具有代表性的廣譜香料，有“香料之王”的美稱，也是重要的有機(jī)化學(xué)品中間體，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、日化工業(yè)、煙草工業(yè)、電鍍工業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［5］。

香蘭素是目前世界上產(chǎn)量最大的合成香料，需求量逐年遞增。目前，市場上供應(yīng)的香蘭素有三種來源，即：（1）從香子蘭花莢中提取的天然香蘭素；（2）用化學(xué)合成法（如愈創(chuàng)木酚法、木質(zhì)素法、黃樟素法等）生產(chǎn)的香蘭素［6-8］；（3）用微生物法生產(chǎn)的香蘭素［9-11］?；瘜W(xué)方法生產(chǎn)香蘭素產(chǎn)率高，處于香蘭素合成主導(dǎo)地位。但是大多數(shù)化學(xué)合成的香蘭素在純度、香氣、安全性等方面都低于天然提取的香蘭素，并且化學(xué)工藝產(chǎn)生的廢棄物污染環(huán)境。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素，在生產(chǎn)過程中轉(zhuǎn)化率較高，生產(chǎn)成本較低，清潔環(huán)保，產(chǎn)品安全［12］。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素逐漸成為研究焦點［13-14］。

目前，能夠利用阿魏酸為底物生產(chǎn)香蘭素的菌株有枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、鏈霉菌（Streptomycetaceae）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、擬無枝酸菌（Amycolatopsis）、食醋叢毛單胞菌（Pseudomonas acidovrans）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）等，其中擬無枝酸菌（Amycolatopsis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）能夠?qū)⒌孜锇⑽核徂D(zhuǎn)化生成較高產(chǎn)量的香蘭素［15］。為降低生產(chǎn)成本，近些年，采用基因工程手段或誘變育種選育高產(chǎn)菌株可以降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化率。

本研究從化妝品廠排污口處深層土壤中篩選分離出了5株可以轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)生產(chǎn)香蘭素的菌株，通過初篩、復(fù)篩并和實驗室其他購買和保藏的供試菌株進(jìn)行對比之后，得到一株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素效率較高且高產(chǎn)香蘭素的菌株B7，通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗及16S rRNA序列方法對所獲得菌株進(jìn)行鑒定，為工業(yè)化生物法合成香蘭素提供新的菌種資源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

分離樣品取自甘肅省某化妝品廠排污口處深層土壤；部分試驗菌種來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC）、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（Guangdong institute of microbiology ofmicrobialculturecollectioncenter，GIM）、甘肅省商業(yè)科技研究所（Gansu Institute of Business and Technology，GIBT）保藏的菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，1.0 g/L阿魏酸，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

富集培養(yǎng)基：15 g/L淀粉，0.3 g/L氯化鈉，0.5 g/L硝酸鉀，0.01 g/L七水硫酸亞鐵，0.3 g/L磷酸氫二鉀，0.3 g/L七水硫酸鎂。

純化培養(yǎng)基：20g/L瓊脂粉，15g/L淀粉，0.3g/L氯化鈉，0.5 g/L硝酸鉀，0.01 g/L七水硫酸亞鐵，0.3 g/L磷酸氫二鉀，0.3 g/L七水硫酸鎂。

初篩培養(yǎng)基：1 g/L阿魏酸，蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0。

梯度誘導(dǎo)馴化培養(yǎng)基：配制阿魏酸質(zhì)量濃度分別為0.2 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L、2.0 g/L的種子培養(yǎng)基。

營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，自然pH，將馬鈴薯洗凈去皮，切片后稱取200.0 g，加水煮沸30 min，用紗布過濾后，加入葡萄糖和瓊脂補(bǔ)足至1.0 L。充分加熱溶解分裝，121℃滅菌20 min。

1.1.3試劑

無水葡萄糖：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酵母膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉：南京化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂：成都化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀：西安化學(xué)試劑廠；阿魏酸：2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；香蘭素：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Mettler ToledoAL204分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZM型立式智能壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱、DZG-6050型真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：江蘇常州市國立試驗設(shè)備研究所；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-1800PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-21M湘儀離心機(jī)：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)有限公司；PHS-3C型酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；Eppendorf移液槍：德國艾本德股份公司；THZ-82N臺式恒溫振蕩器培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；2720 Thermal CyclerPCR儀：美國ABI公司；DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)香蘭素菌種的分離

稱取10 g土壤置于250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水，搖勻。取混合后溶液的上清液，梯度稀釋獲得最終濃度分別為10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL的菌懸液。從中任意選取3個稀釋度，用無菌移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL梯度稀釋液于干凈無菌的培養(yǎng)皿中，并且每一個稀釋梯度做2個平行，然后將溫度冷卻至45℃左右的平板分離培養(yǎng)基溶液倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿倒入12～15 mL，搖勻，待培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基凝固后，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中30℃倒置培養(yǎng)48 h。

1.3.2香蘭素的定性［16-18］

香蘭素的定性檢測采用薄層色譜法：將待測菌株發(fā)酵液、香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用管口平整的毛細(xì)管滴加于薄層板一端約1 cm處的起點線上，置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5 cm，待展開劑前沿離原點約8cm處時，將色譜板取出，干燥后在波長254 nm的紫外照射燈下觀察熒光條帶。薄層層析展開劑為乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）。若展開的發(fā)酵液條帶中出現(xiàn)和香蘭素標(biāo)準(zhǔn)液條帶上紫色熒光點位置相同（即具有相同比移值Rf）的熒光點，則說明該菌株能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)生香蘭素。

1.3.3菌種初篩

將平板分離得到的菌株分別接種到初篩培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器上150 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)24 h后，取各菌株發(fā)酵液，采用1.3.2中香蘭素定性方法并根據(jù)薄層色譜試驗結(jié)果淘汰部分不轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的菌株。

1.3.4香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

20∶1鹽酸溶液（V/V）配制：精確量取濃鹽酸10.0 mL，加入去離子水200 mL，混勻后備用。

0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液：準(zhǔn)確稱取2-硫代巴比妥酸0.5 g，加入少量無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取香蘭素0.02 g，用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容作為母液。將母液稀釋配制成20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L梯度濃度香蘭素溶液。取11支25 mL比色管，按表2混合溶液，待定容后，振蕩搖勻，于55℃水浴保溫10 min。然后于室溫放置20 min，在波長440 nm處測定吸光度值，繪制香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5菌種復(fù)篩

將經(jīng)過初篩得到的各菌種活化后分別接種于種子培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器上150r/min、30℃培養(yǎng)24h后，再加入10mL底物質(zhì)量濃度為1g/L的阿魏酸溶液繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，測定各菌株發(fā)酵液中的香蘭素含量（mg/L），通過比較其發(fā)酵液中的香蘭素含量的高低進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.6供試菌株

其他供試菌株為在各菌種保藏機(jī)構(gòu)所購買及本研究實驗室保藏菌種見表1。

表1　用于篩選試驗的保藏菌種信息Table 1 The information of preserved strains for screening tests

1.3.7菌株轉(zhuǎn)化香蘭素能力測定

取試管加入5mL20∶1（V/V）的鹽酸溶液、2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液、1mL發(fā)酵液，2mL蒸餾水。搖勻，于55℃水浴保溫10 min，立即使用冷卻水沖洗管外壁終止反應(yīng)，室溫放置20min，在波長440nm處測定吸光度值，以加入阿魏酸不含菌液的液體培養(yǎng)基作為參比，測定吸光度值。按照香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算發(fā)酵液中香蘭素含量，香蘭素摩爾轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率的計算公式如下：

1.3.8生長量的測定

以加入阿魏酸不含菌液的液體培養(yǎng)基作為參比，在波長660 nm處測定菌株發(fā)酵液的吸光度值。

1.3.9形態(tài)及生理生化鑒定

將分離篩選得到的轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的菌株依據(jù)東秀珠等主編的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》［20］進(jìn)行初步鑒定。

1.3.10菌株16S RNA序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建［21］

挑取純化后的菌株B7的單菌落接種于裝有10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h。用移液槍準(zhǔn)確的吸取2 mL菌液，在低溫高速冷凍離心機(jī)中以12 000 r/min離心2 min后，去除上清液，再按照生工SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書的試驗步驟提取菌株的基因組DNA，作為模板。

首先進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增，采用引物（上游：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；下游：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），建立聚合酶鏈反應(yīng)（polymerse chain reaction，PCR）體系（25 μL）：上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；Template（基因組）1 μL；脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL；Taq（5 U/μL）0.2 μL；10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL；最后加水補(bǔ)充至25 μL。

設(shè)定PCR程序：在94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)程序：94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，共計35個循環(huán)，最后在72℃保溫8 min。

精密吸取50 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶，純化以后進(jìn)行后續(xù)DNA的測序工作，將提取的基因組DNA委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增序列測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中提交測序結(jié)果，通過BLAST程序提交得到的16S rRNA序列，最后在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列檢索。將目標(biāo)菌株的16S rDNA和在BLAST程序中檢索到的與之有較高同源性的模式菌株的16SrDNA作最大同源性比較分析，并利用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA 4.0采用鄰位相鄰法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進(jìn)行重復(fù)次數(shù)為1 000次的Bootstrap測試，最終確定目標(biāo)菌株的分類地位。

2　結(jié)果與分析

2.1香蘭素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以香蘭素含量（x，mg/L）為橫坐標(biāo)、OD440nm（y）為縱坐標(biāo)繪制香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of vanillin

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.001 1x-0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。表明香蘭素含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2菌種篩選結(jié)果

本實驗通過初篩在土壤中得到14株菌落B3～B16，并通過添加底物阿魏酸發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選純化出5株能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的菌株B5、B7、B11、B14、B15，比較其摩爾轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖2所示。

圖2　五株菌株香蘭素轉(zhuǎn)化能力比較Fig.2 The comparison of conversion capability of vanillin among five strains

由圖2可知，菌株B5、B11、B15的摩爾轉(zhuǎn)化率均＜10%，只有菌株B7和B14的摩爾轉(zhuǎn)化率＞10%，且菌株B7的摩爾轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了29.01%。從轉(zhuǎn)化效率的結(jié)果看，菌株B7（49.66%）和B14（32.3%）的轉(zhuǎn)化效率均高于其余3株菌株，菌株B7的轉(zhuǎn)化效率是5株菌株中最高的，所以選取B7作為供試菌株進(jìn)行后續(xù)試驗研究。

2.3不同菌種轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素能力的比較

將篩選得到的菌株B7和研究中心實驗室購買和保藏的其他11株菌種分別接種于種子培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器上150 r/min、30℃培養(yǎng)24 h后，加入10 mL底物質(zhì)量濃度為1 g/L的阿魏酸溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，對各菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的能力進(jìn)行測定和比較，并計算出各自的香蘭素摩爾轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見表2。

表212　株菌株香蘭素轉(zhuǎn)化能力的比較Table 2 Comparison of conversion ability of ferulic acid by twelve strains

由表2可知，從香蘭素的產(chǎn)量看，細(xì)菌轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)生的香蘭素質(zhì)量濃度均高于真菌（酵母菌、絲狀真菌），其中B7和陰溝腸桿菌E1所產(chǎn)生的香蘭素質(zhì)量濃度最高，而絲狀真菌中除了黑曲霉A1以外，杯珊瑚菌C2、美味牛肝菌B2和雞油菌C3所產(chǎn)生的香蘭素質(zhì)量濃度均較低；從摩爾轉(zhuǎn)化率分析，除B7、黑曲霉和陰溝腸桿菌外，其他菌株的摩爾轉(zhuǎn)化率均＜10%；從轉(zhuǎn)化效率看，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率均高于真菌的轉(zhuǎn)化效率，其中B7、黑曲霉、嗜熱脂肪芽孢桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化效率高于其他菌株，而B7的轉(zhuǎn)化效率是所有12株菌株中最高的。因此，通過篩選和比較，最終確定B7為目標(biāo)菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗并對其進(jìn)行純化、鑒定及保藏。

2.4香蘭素定性試驗結(jié)果

用毛細(xì)管分別吸取香蘭素和阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)液以及發(fā)酵液于制備好的GF254薄板上，放置點好樣的薄層板于裝有展開劑的展缸內(nèi)進(jìn)行層析，層析后取出揮干，在紫外檢出器下觀察藍(lán)紫色斑點。取天然香蘭素標(biāo)準(zhǔn)樣品、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行薄層試驗，得到菌株B7的薄層層析色譜圖見圖3。

圖3　薄層層析結(jié)果Fig.3 Results of thin layer chromatography

薄層層析法可用于定性測定并指示反應(yīng)的進(jìn)程，在展開劑為乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）的層析體系中，發(fā)酵液中的阿魏酸和香蘭素都能夠得到很好地分離。由圖3可知，經(jīng)過測量和計算，Rf香蘭素=0.86；Rf阿魏酸= 0.62。觀察到在發(fā)酵液的條帶上，有兩個熒光點，一個為深紫色，與旁邊香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液條帶上出現(xiàn)的熒光點顏色和位置都一致（即具有相同的Rf值），則說明該發(fā)酵液中有香蘭素生成。

2.5菌株鑒定

2.5.1B7菌株形態(tài)

菌株B7革蘭氏染色呈陽性，其顯微鏡下的鏡檢菌株形態(tài)見圖4，菌落形態(tài)見圖5。由圖4可知，菌體形態(tài)為長桿狀，以成對或鏈狀排列，菌體的大小為（0.8～1.2）×（2.0～3.8）μm，形成芽孢，芽孢中生或近中生，孢子囊不膨大。

圖4　菌株B7的鏡檢形態(tài)Fig.4 The micrograph of strain B7

由圖5可知，在平板培養(yǎng)基上生長的菌株B7的菌落呈白色或微黃色，單個菌落近似圓形，邊緣較整齊，半透明，菌落表面光滑濕潤。

圖5　B7的平板培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.5 Colonial morphology of strain B7

2.5.2生理生化試驗結(jié)果

表3　菌株B7的生理生化特征Table 3 The physiological and biochemical characteristics of strain B7

由表3可知，菌株B7芽孢染色和革蘭氏染色均呈陽性；5%的過氧化氫溶液的載玻片上，觀察有大量的氣泡產(chǎn)生，反應(yīng)呈陽性；將B7分別于葡萄糖、蔗糖、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基上穿刺培養(yǎng)，觀察結(jié)果顯示乳糖培養(yǎng)基仍為藍(lán)色，而葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，說明該菌株可以利用葡萄糖和蔗糖，但不能利用乳糖；將B7接種于水解淀粉試驗培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，向固體平板培養(yǎng)基表面滴加盧哥氏碘液，使碘液鋪滿平板，平板呈藍(lán)色，說明該菌可以水解淀粉；在V-P試驗中，B7接種培養(yǎng)后，培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，說明該菌可以利用檸檬酸鹽；菌株其他生理生化試驗結(jié)果見表3。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，參考對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》分類系統(tǒng)中的描述，初步鑒定B7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.5.3菌株16S rRNA基因序列鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，其PCR產(chǎn)物為一個大小約為1 400 bp的特異性片段，菌株B7的16S rRNA全長序列大小為1 437 bp。之后在NCBI在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對的過程中發(fā)現(xiàn)，其與Bacillus屬中編號為DQ923483.1的菌株Bacillus subtilis的同源性達(dá)到99.7%，然后借助構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育MEGA 4.0軟件生成直觀清晰的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。

圖6　菌株B7的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.6 The electrophoresis pattern of PCR products of strain B7

圖7　菌株B7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain B7

由圖7可知，菌株B7與Bacillus subtilis（DQ923483.1）處在同一個分支上，通過1 000次bootstrap測試分析支持該分支；并且在GenBank數(shù)據(jù)庫比對過程中發(fā)現(xiàn)，菌株B7與模式菌株Bacillus subtilis（DQ923483.1）的16S rRNA基因序列相似度為99.7%，由此推斷菌株B7為Bacillus屬中的Bacillus subtilis。

綜上所述，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗結(jié)果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終將菌株B7鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3　結(jié)論

本研究從化妝品廠排污口處深層土壤中篩選能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的菌株，從中篩選到14株菌株，其中5株具有轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的能力，并通過與研究中心實驗室購買和保存的其他11株菌株進(jìn)行比較，最終篩選出了一株香蘭素摩爾轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率相對較高的菌株B7，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗結(jié)果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

高產(chǎn)菌株以阿魏酸為底物生物法合成香蘭素的生產(chǎn)工藝潛力巨大，利用麥麩、谷糠等價格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品得到的阿魏酸轉(zhuǎn)化香蘭素，不但轉(zhuǎn)化速率快，而且可以降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)副產(chǎn)品的利用率。隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，一旦微生物發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素實現(xiàn)工業(yè)化，必將推動香蘭素產(chǎn)業(yè)跨上一個新臺階。

［1］WALTON N J，MAYER M J，NARBAD A.Vanillin［J］.Phytochemistry，2003，63（5）:505-515.

［2］KRINGS，U，BERGER R G.Biotechnological production of flavours and fragrances［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1998，49（1）:1-8.

［3］LI T，ROSAZZA J P.Biocatalytic synthesis of vanillin［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66（2）:684-687.

［4］李士煉.香蘭素的生物轉(zhuǎn)化與提取工藝研究［D］.天津：天津科技大學(xué)碩士論文，2005.

［5］陳朋，李紅玉，劉超群.微生物轉(zhuǎn)化合成香蘭素［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（2）：385-388.

［6］張瑞峰.愈創(chuàng)木酚法合成香蘭素工藝綜述［J］.廣東化工，2012，39（8）：192-193.

［7］周艷青，索隴寧，伍家衛(wèi)，等.對甲酚合成香蘭素研究進(jìn)展［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2014，43（4）：42-43.

［8］李云，史哲，關(guān)瑾，等.電解氧化法合成香蘭素的研究［J］.沈陽化工大學(xué)學(xué)報，2010，24（4）：289-293.

［9］鄭波濤.香蘭素的合成工藝進(jìn)展［J］.化工之友，2007（9）：51-53.

［10］鎮(zhèn)達(dá)，吳小剛，鄧貝，等.香蘭素微生物合成技術(shù)的應(yīng)用研究［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：144-149.

［11］喻林，魏敏，陳義坤，等.桑腸桿菌VL4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素［J］.湖北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，34（3）：286-291.

［12］PRIEFER H，RABENHORST J，STEINBUCHEL A.Biotechnological production of vanillin［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56（3-4），296-314.

［13］陳秀清，楊潤賢.香蘭素合成方法研究探討［J］.廣州化工，2010，38（6）：40-41.

［14］杜毅，張兆斌，曾義勇，等.發(fā)酵法制備天然香蘭素的研究［J］.香料香精化妝品，2011（3）：1-5.

［15］羅誠浩，喻林，魏敏，等.微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2011，28（12）：11-16.

［16］顏曉航.薄層色譜法操作技術(shù)控制要點分析［J］.安徽醫(yī)藥，2012（9）：1271-1272.

［17］馮雅斌，杜靚，溫靜.薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用及研究進(jìn)展［J］.疾病監(jiān)測與控制，2011（1）：60-62.

［18］任群翔，孟祥軍，葛欣，等.薄層色譜法在香蘭素合成中的應(yīng)用［J］.理化檢驗-化學(xué)分冊，2002，38（8）：389-393.

［19］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［20］R.E.布坎南，N.E.吉布斯.1984.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯、組譯，伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1984.

［21］宋勇強(qiáng).甘肅傳統(tǒng)釀造食醋中醋酸菌多樣性研究及優(yōu)良醋酸菌的篩選［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2013.

Screening and identification of a strain transforming ferulic acid to vanillin

YAN Xiaojuan，SONG Yongqiang*，NIU Ben，HU Xianwang
（Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，China）

The bacteria were isolated from soil by gradient dilution plate separation method.In final，a strain B7 with relatively high conversion capability of vanillin was screened by comparing with other 11 strains purchased and preserved in laboratory of research center.Through strain morphological characteristics，physiological and biochemical test results，16S rRNA sequence identification and phylogenetic analysis results，the strain B7 was inditified asBacillus subtilis.

ferulic acid；vanillin；screening；identification

TS252.54

A

0254-5071（2015）10-0047-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.011

2015-09-12

甘肅省食品酶制劑共性關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊（098TTCA013）；甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃（1205TCYA034）；甘肅省重點實驗室建設(shè)計劃項目（1309RTSA025）

嚴(yán)曉娟（1983-），女，工程師，碩士，研究方向為應(yīng)用微生物。

宋勇強(qiáng)（1988-），男，工程師，碩士，研究方向為食品微生物學(xué)與發(fā)酵工程。