L—半胱氨酸對酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶催化動力學(xué)

方慶秋

摘 要：L-半胱氨酸對酪氨酸酶活性有抑制作用，隨著L-半胱氨酸濃度的增加而酶活不斷受到抑制，并且延滯時(shí)間也相應(yīng)延長。相對穩(wěn)態(tài)酶活力則隨著L-半胱氨酸濃度的增大而下降。同時(shí)，對酪氨酸酶催化反應(yīng)的影響及作用動力學(xué)機(jī)理進(jìn)行了研究，分析延滯時(shí)間產(chǎn)生的根本原因，提出了酪氨酸酶的單酚酶將醌轉(zhuǎn)化為多巴黑色素的非酶反應(yīng)偶聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理，研究其對酪氨酸酶催化反應(yīng)的影響及作用動力學(xué)機(jī)理，為酪氨酸酶抑制劑的設(shè)計(jì)提供分子模板。

關(guān)鍵詞：酪氨酸酶 L-半胱氨酸 單酚酶 二酚酶 抑制 動力學(xué)

中圖分類號：Q356.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）06（c）-0116-02

酪氨酸酶是合成黑色素的關(guān)鍵酶，是白癜風(fēng)免疫的重要抗原。最近發(fā)現(xiàn)的白癜風(fēng)患者血清中的酪氨酸酶抗體和白癜風(fēng)密切相關(guān)?？梢允蛊つw顏色通過抑制酪氨酸酶的活性，以防止皮膚黑色素的形成，即皮膚脫色劑。將某些酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用于美白化妝品。因此，尋找有效的和人體有無不良反應(yīng)的酪氨酸酶抑制劑已成為醫(yī)藥和化妝品行業(yè)的研究和發(fā)展趨勢。該文以L-半胱氨酸作為效應(yīng)物，研究其對酪氨酸酶催化反應(yīng)的影響及作用動力學(xué)機(jī)理，為酪氨酸酶抑制劑的分子設(shè)計(jì)的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 酪氨酸酶活力測定

酪氨酸酶單酚酶活力測定：1.5mmol/LL-酪氨酸為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的L-半胱氨酸溶液和酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力測定：1.0 mmol/LL-DOPA為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的L-半胱氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸對酪氨酸酶單酚酶的影響

圖1可知，隨著體系中L-半胱氨酸濃度的增加，抑制單酚酶酶活的能力不斷增加。同時(shí)，增加L-半胱氨酸濃度能延長單酚酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間。當(dāng)測活體系中不含L-半胱氨酸時(shí)，酶反應(yīng)的延滯時(shí)間僅為121秒，但當(dāng)L-半胱氨酸濃度為30μmol/L時(shí)，延滯時(shí)間540秒。使酶活力下降50%的L-半胱氨酸濃度（IC50）約為20.3μmol/L。

2.2 L-半胱氨酸對酪氨酸酶二酚酶的影響

圖2可知，隨著體系中L-半胱氨酸濃度的增加，抑制二酚酶酶活的能力不斷增加，導(dǎo)致酶活力下降一半所需的L-半胱氨酸濃度（IC50）為52.0μmol/L。加入L-半胱氨酸后也出現(xiàn)了延滯效應(yīng)，而當(dāng)體系中不含L-半胱氨酸時(shí)，不存在延滯現(xiàn)象，但當(dāng)體系中加入L-半胱氨酸后，延滯現(xiàn)象開始出現(xiàn)，并且延滯時(shí)間隨著L-半胱氨酸濃度的增加而延長，當(dāng)L-半胱氨酸濃度為100μmol/L時(shí)，延滯時(shí)間達(dá)到了284秒。

2.2 催化動力學(xué)模型

由圖1和圖2可知，從協(xié)同效應(yīng)出發(fā)，提出了酪氨酸酶的單酚酶將醌轉(zhuǎn)化為多巴黑色素的非酶反應(yīng)偶聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理（如圖3）。

圖3中，T為單酚；D為二酚；QH和Q分別是鄰半醌和鄰醌；L和DC分別是無色和黑色多巴色素；Emet和Edeoxy分別是活性位點(diǎn)帶Cu22+的氧化型酪氨酸酶和帶Cu2+的還原型酪氨酸酶；Eoxy是氧化酪氨酸酶；kapp為表觀速率常數(shù)。

對單酚作用的酪氨酸酶反應(yīng)體系通過：1、酪氨酸酶的Emet轉(zhuǎn)變?yōu)镋oxy態(tài)；2、由QH生產(chǎn)二酚和多巴黑色素；3、由Eoxy態(tài)返回Emet態(tài)等過程而達(dá)到穩(wěn)態(tài)。這一過程中，消耗單酚，生成二酚和多巴黑色素，根據(jù)由酪氨酸生物合成黑色素的實(shí)驗(yàn)測定和計(jì)算機(jī)模擬得到：

（式1）

式中，和分別為單酚和二酚的最大穩(wěn)態(tài)催化速率，即

，分別為單酚和二酚的Michaelis常數(shù)，即

（式2）

（式3）

式中，，

，，為穩(wěn)態(tài)時(shí)二酚的濃度，為t=0時(shí)的單酚濃度。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測定F，和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以求出從單酚或二酚生成的DC的穩(wěn)態(tài)速率，，和。單酚生成DC的速率的方程是

（式4）

式中，

為t =0時(shí)的O2濃度若寫成表觀Michaelis方程，有

（式5）

這里的：

（式6）

（式7）

應(yīng)注意的是，和都是表觀值，其真實(shí)值由氧氣濃度時(shí)的極限值求出。

對于Emet單純氧化二酚的反應(yīng)機(jī)理，多巴黑色素的穩(wěn)態(tài)積累速率是

（式8）

式中，

類似單酚氧化，式1-8也可以改寫成為

（式9）

式中，表觀，分別是

（式10）

（式11）

根據(jù)對DoxyD和EoxyT的穩(wěn)態(tài)方程和上述動力學(xué)分析，有

（式12）

式中，

（式13）

當(dāng)飽和時(shí)，則式1-11變成

（式14）

由反應(yīng)機(jī)理可以看出，單酚濃度升高，非活化態(tài)的Emet被單酚進(jìn)一步飽和，k2所制約的Emet態(tài)轉(zhuǎn)化為Edeoxy態(tài)的過程受到阻止，使得酶催化反應(yīng)生產(chǎn)產(chǎn)物時(shí)間滯后，這就是延滯時(shí)間產(chǎn)生的根本原因。

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