黃瓜疫霉菌拮抗菌的篩選及鑒定

周 珍，向 陽(yáng)，解 娜，易圖永,3

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 永順縣農(nóng)業(yè)局，湖南 永順 416700；3. 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128）

黃瓜疫病是由黃瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）引起的黃瓜主要病害之一，在黃瓜種植區(qū)的發(fā)生日趨嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，青海[1]、海南[2]、江蘇[3]等地的黃瓜栽培區(qū)都曾大面積發(fā)生黃瓜疫病，造成黃瓜的產(chǎn)量減少和口感下降，嚴(yán)重打擊了農(nóng)民種植黃瓜的積極性[4]。目前，對(duì)該病的防治以化學(xué)農(nóng)藥為主[5]，但某些藥劑存在毒性大、殘留時(shí)間長(zhǎng)、容易誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)[6-7]，不宜長(zhǎng)期大量使用。而生物防治具有低殘留、高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為防治植物病害的發(fā)展趨勢(shì)[8]。在諸多生物防治策略中，利用拮抗微生物或其次級(jí)代謝產(chǎn)物防治作物病害的報(bào)道較多[9-10]。其中，放線菌因來(lái)源廣、代謝產(chǎn)物活性高等優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注[11]。據(jù)報(bào)道，由微生物產(chǎn)生的20 000 多種活性物質(zhì)中近一半來(lái)源于放線菌[12]。但目前放線菌應(yīng)用于黃瓜疫病防治的報(bào)道還比較少見(jiàn)。研究采用平板稀釋法[13-14]、平板對(duì)峙法[15-16]等從土壤中篩選到5 株對(duì)黃瓜疫霉菌有較好拮抗作用的放線菌株，并對(duì)拮抗作用最強(qiáng)的菌株No.2 做了發(fā)酵液的初步拮抗試驗(yàn)及生理生化特性的研究，以期為黃瓜疫病的生物防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2011～2013年進(jìn)行。黃瓜疫霉菌TX-8（Phytophthora melonis）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。土壤樣品分別從貴州黃果樹(shù)國(guó)家重點(diǎn)風(fēng)景名勝區(qū)、湖南新寧崀山風(fēng)景區(qū)、張家界國(guó)家森林公園收集200～250 g，放置在4℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤放線菌的分離 將土壤樣品干燥、研磨后，采用平板稀釋法分離。稱量10 g 土樣裝入含90 m L 無(wú)菌水的300 m L 錐形燒瓶中，用小玻璃珠均勻振蕩30 min，即為10-1稀釋液。靜置數(shù)秒后，以10-1稀釋液為母液依次制備10-2～10-6稀釋液。分別取0.1 m L 各濃度稀釋液滴加到高氏一號(hào)培養(yǎng)基上28℃倒置培養(yǎng)，設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.2 拮抗放線菌的篩選 采用平板對(duì)峙法。將直徑為7 mm 的黃瓜疫霉菌塊放置于PDA 平板中央，菌塊四周對(duì)稱接種平板稀釋法分離得到的放線菌，28℃倒置培養(yǎng)。7 d 后觀察抑菌帶長(zhǎng)度，保存拮抗作用明顯的菌株。

1.2.3 發(fā)酵液對(duì)黃瓜疫霉菌的拮抗作用 將上一步保存的菌株接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃、180 r/m in 在搖床上培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液用0.22 μm 細(xì)菌濾液器過(guò)濾。取5 m L 濾液與20 m L 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基混勻后倒板，平板中央放置直徑為7 mm 病原菌，放入28℃溫箱倒置培養(yǎng)，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。抑制率計(jì)算公式如下：

病原菌菌絲直徑=交叉垂直直徑的平均值

抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

1.2.4 抑菌譜測(cè)定 以拮抗效果最好的放線菌為材料，將直徑為7 mm 的黃瓜疫霉病菌塊，放置在PDA平板中央，兩邊對(duì)稱接種拮抗菌置于28℃溫箱培養(yǎng)6～8 d。采用相同方法對(duì)水稻瘟稻病菌（Magnaporthe oryzae）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioides）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）進(jìn)行抑菌測(cè)定。

1.2.5 拮抗菌的鑒定 （1）菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征鑒定。將供試菌株劃線接種在多種基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基上于28℃恒溫箱培養(yǎng)，分別在5、7、10、14 d 時(shí)于光學(xué)顯微鏡下觀察拮抗菌的形態(tài)、氣生菌絲、基質(zhì)菌絲和有無(wú)色素；觀察孢子的形態(tài)、特征及是否有橫向斷裂橫隔。（2）生理生化鑒定。參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》分別對(duì)拮抗菌進(jìn)行碳源利用、淀粉水解、明膠液化、牛奶胨化和凝固、纖維素上生長(zhǎng)、硫化氫的生成等各項(xiàng)試驗(yàn)。（3）分子生物學(xué)鑒定。采用改良的SDS 法提取放線菌的基因組DNA，采用16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1 492R：5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）為10×PCR Buffer 2 μL，1.25 mmol/L dNTPs 0.8 μL，引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，TaqDNA 酶0.5 μL，用去離子水補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為94℃5 m in；94℃40 s，51℃40 s，72℃90 s，30 次循環(huán)；72℃5 m in。PCR 產(chǎn)物膠回收后連入pGM-T 載體，并轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞。挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR 鑒定后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。所得序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，利用Mega5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的篩選

收集土壤樣品經(jīng)過(guò)處理后，采用稀釋法分離得到放線菌菌株106 株，細(xì)菌菌株126 株。采用平板對(duì)峙法，以黃瓜疫霉菌為指示菌進(jìn)行拮抗活性測(cè)定，獲得26 株對(duì)黃瓜疫霉菌有拮抗作用的菌株，占總菌株的11.2%，其中抑菌帶達(dá)到5 mm 及以上的拮抗菌有5 株。

2.2 發(fā)酵液對(duì)黃瓜疫霉菌的拮抗作用

對(duì)上一步篩選到的5個(gè)菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，5 倍稀釋發(fā)酵濾液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 號(hào)菌株對(duì)黃瓜疫霉菌的抑制率高達(dá)76%（圖1）。

2.3 抑菌譜檢測(cè)

為進(jìn)一步研究2 號(hào)菌的生物防治價(jià)值，采用對(duì)峙法對(duì)其他病原菌進(jìn)行拮抗效果測(cè)定。其中，對(duì)煙草黑脛病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、柑橘炭疽病菌和稻瘟病菌等都表現(xiàn)出不同程度的拮抗效果，抑菌率為55%～75%。

2.4 拮抗菌的分離鑒定

2.4.1 形態(tài)特征 2 號(hào)菌在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上最初呈白色，7 d 后菌落呈煙灰色（圖2），單菌落圓形，表面干燥。通過(guò)光學(xué)和電子顯微鏡觀察到孢子絲長(zhǎng)而直，邊緣有成叢的趨勢(shì)，不產(chǎn)生螺旋孢子絲，孢子柱形或長(zhǎng)圓形，表面光滑，不透明，常在氣生菌絲上形成長(zhǎng)孢子鏈（圖3）。

表1 有效菌株對(duì)黃瓜疫霉菌的抑制作用

圖1 2 號(hào)菌株對(duì)黃瓜疫霉菌的抑制效果

圖2 拮抗菌株2 號(hào)菌的培養(yǎng)特征

圖3 電鏡下2 號(hào)菌的孢子形態(tài)

2.4.2 培養(yǎng)特征 不同培養(yǎng)基上2 號(hào)菌氣生菌絲顏色不一致，在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)后菌絲變厚，呈煙灰白。在察氏、PDA 培養(yǎng)基上氣生菌絲分別呈灰色、白色，有可溶性色素（表2）。

表2 各類(lèi)培養(yǎng)基上拮抗菌株2 號(hào)菌的培養(yǎng)特征

2.4.3 生理生化特性 對(duì)2 號(hào)菌株的生理生化特性測(cè)定結(jié)果表明（表3），該菌株能利用D-半乳糖、乳糖、甘露糖、山梨糖、麥芽糖、D-木糖、蔗糖，但不能利用鼠李唐、山梨醇、甘露醇，對(duì)L-阿拉伯糖的利用還有待進(jìn)一步確認(rèn)；2 號(hào)菌株能使明膠液化，不能分解纖維素，但能在纖維素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，淀粉水解能力較強(qiáng)，不能使牛奶胨化凝固，不產(chǎn)生硫化氫，能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，吲哚試驗(yàn)中未出現(xiàn)紅色環(huán)狀物。

2.4.4 分子生物學(xué)鑒定 2 號(hào)菌株16S rDNA 擴(kuò)增獲得一條1 500 bp 左右的單一帶，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，選取10 株模式鏈霉菌屬菌株用Mega5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4），結(jié)果顯示，2 號(hào)菌株與絳紅褐鏈霉菌（S. purpeofuscus）在同一分支，同源性高達(dá)99%。同時(shí)結(jié)合培養(yǎng)特征習(xí)性、生理生化特征分析及分子測(cè)定結(jié)果。

表3 2 號(hào)菌株的生理生化特征

圖4 16S rDNA 序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰近法）

3 結(jié)論與討論

黃瓜疫病俗稱死藤、瘟病等，在黃瓜整個(gè)生育周期均可發(fā)生。此病常造成黃瓜大面積死亡，輕者減產(chǎn)30%～40%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。目前，對(duì)黃瓜疫病的防治主要以化學(xué)防治為主，但其對(duì)人畜的毒副作用和殘留問(wèn)題至今難以有效解決。為解決化學(xué)藥劑帶來(lái)的諸多問(wèn)題，生防菌對(duì)植物病原菌的抑制研究已成為熱點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)植物病害具有防治作用的生防細(xì)菌，其中以假單胞桿菌[17]（Pseudomonas spp.）、芽孢桿菌[18-19]（Bacillus spp.）和鏈霉菌[20-21]（Streptomyces spp.）等居多。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)黃瓜疫病的生防菌研究較少，在眾多已發(fā)現(xiàn)的生防菌中，目前僅發(fā)現(xiàn)華麗黃鏈霉菌[22]（Streptomyces flaveus）、枯 草 芽 孢 桿 菌[23]（Bacillus subtilis）等少數(shù)菌株對(duì)黃瓜疫霉菌有較好抑制作用。

研究通過(guò)平板對(duì)峙法及發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)，從土壤中篩選到5 株對(duì)黃瓜疫霉菌有較好拮抗作用的放線菌株，其中拮抗菌No.2 對(duì)黃瓜疫霉菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的拮抗活性，發(fā)酵液稀釋5 倍后對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率仍高達(dá)76%。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化、16S rDNA 分子鑒定等方法，發(fā)現(xiàn)No.2 菌株具有典型的鏈霉菌屬特征，初步確定為絳紅褐鏈霉菌（Streptomyces purpeofuscus）。目前，還未發(fā)現(xiàn)有將絳紅褐鏈霉菌用于黃瓜疫病防治方面的報(bào)道，表明No.2 是一株新發(fā)現(xiàn)的對(duì)黃瓜疫霉菌具有較好防效的放線菌株。作為應(yīng)用到生產(chǎn)中最早的生防菌[24]，放線菌及其代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為農(nóng)藥研發(fā)的新主體之一[25]。目前，拮抗菌No.2還只進(jìn)行了發(fā)酵液的一些抑菌試驗(yàn)及生理生化特性的試驗(yàn)，要應(yīng)用到生產(chǎn)及新農(nóng)藥的研發(fā)中還需進(jìn)一步研究。

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