MK－2206阻斷PI3K/AKT通路對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖及侵襲性的影響

何德喜，童 嵐，何汝暢，李曉琴，潘海峰，靳 陽(yáng)

（1.成武縣人民醫(yī)院，山東 成武274200；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272000；4.一汽總醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130011；5.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272011）

骨肉瘤（Osteosarcoma）也稱(chēng)成骨肉瘤，是常見(jiàn)的骨原發(fā)性惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)［1］。隨著新輔助化療、手術(shù)、術(shù)后化療的開(kāi)展，骨肉瘤5年生存率提高到近80%，但仍有半數(shù)以上的患者死于骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［2］。有效控制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移對(duì)延長(zhǎng)患者生存期有著深遠(yuǎn)意義。

PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、耐藥等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。AKT是PI3K下游的靶蛋白，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白激酶，在多種腫瘤中如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和口腔鱗癌等腫瘤細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)［3］?；罨腁kt通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用。因此AKT成為研究腫瘤生物學(xué)行為的重要靶點(diǎn)，MK－2206是一種強(qiáng)效的，高特異性及非ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的Akt變構(gòu)抑制劑［4］，本研究以骨肉瘤細(xì)胞 MG63為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)MK－2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，為骨肉瘤的藥物治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞株MG－63購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至體積比約90%時(shí)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主 要 試 劑 MK－2206 購(gòu) 自 美 國(guó) Selleck Chemicals公司；RT－PCR 反應(yīng)試劑盒和 DNA Marker購(gòu)自日本Takara公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗β－actin、兔抗p－Akt、兔抗 MMP9、兔抗 TIMP、兔抗 VEGF多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG購(gòu)自北京博奧森公司。

1.1.3 分組 未經(jīng)處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組、加入等量DMSO的細(xì)胞為溶媒對(duì)照組，加入 MK－2206的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備濃度為4×105/L的細(xì)胞懸液，接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)12h。實(shí)驗(yàn)組分別給予1、2.5、5、10、20μM/L的 MK－2206。每組的每個(gè)濃度下設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入20μl的噻唑藍(lán)（MTT 5g/L）。孵育4h后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl。微振蕩10min后，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度（A）值。以上各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.2.2 RT－PCR法檢測(cè) mRNA 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按2×106/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組給予10μM/L的 MK－2206，培養(yǎng)24h。Trizol裂解各組MG63細(xì)胞提取總RNA，半定量RTPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中的CyclinD1、CDk4、VEGF、內(nèi)參照GAPDH，引物見(jiàn)表1。

1.2.3 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞用冷PBS沖洗3次，吸凈PBS液體。在培養(yǎng)瓶中加入400μl蛋白裂解液及4μl苯甲基磺酰氟（PMSF）提取蛋白，喹啉二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量。加入上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，每孔蛋白含量約為30 μg。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，麗春紅染色，含5% 脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液（TBST）4℃封閉過(guò)夜。在PVDF膜上加入1∶250稀釋的兔抗p－Akt、MMP9、VEGF抗體，1∶500兔抗β－actin雜交2h，PBS洗膜；加入1∶1 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃ 孵育2h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。觀察各條帶深淺變化并加以分析，β－actin作內(nèi)參照。測(cè)量條帶灰度值，與β－actin比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK－2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞MG63在不同濃度MK－2206作用24h后，細(xì)胞增值率均受到了抑制。1，2.5，5，10，20μM/L濃度時(shí)均明顯抑制了骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖，抑制率分別為7.98±4.24%，15.07±3.55%，29.36±3.15%，47.78±3.94%，65.32±3.25%，P＜0.05，并且呈劑量依賴性（見(jiàn)圖1）。10μM/L MK－2206組的增殖抑制率最接近IC50，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用10μM/L濃度。

圖1 MK－2206抑制了骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖

2.2 MK－2206有效阻斷了Akt的磷酸化

10μM/L MK－2206 作 用 MG63 細(xì) 胞 24h，Western－blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中的p－Akt，實(shí)驗(yàn)組中的p－Akt水平較對(duì)照組明顯降低，測(cè)得灰度值MK－2206組0.45±0.05，P＜0.01。

圖2 MK－2206阻斷AKT磷酸化

2.3 RT－PCR法檢測(cè)增殖相關(guān)基因的表達(dá)

RT－PCR結(jié)果顯示 MK－2206可以抑制 MG63細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因CD1、CDK4的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了 VEGF的表達(dá)。MK－2206組CyclinD1mRNA 0.87±0.05，P＜0.01；CDk4mRNA 1.04±0.04，P＜0.01和 VEGF mRNA 0.96±0.01，P＜0.01表達(dá)量顯著降低。

圖3 MK－2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖相關(guān)基因的影響

2.4 Western Blot法檢測(cè)侵襲相關(guān)基因的表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因 MMP9表達(dá)下降，VEGF表達(dá)也下降，MMP9 0.57±0.05，VEGF 0.81±0.06，P＜0.01，說(shuō)明了MK－2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有抑制侵襲的作用。

圖4 MK－2206抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63侵襲

3 討論

骨肉瘤好發(fā)于青少年，發(fā)病率居原發(fā)骨惡性腫瘤的第1位，在截肢術(shù)作為主要治療方案的年代，其5年生存率不及20%，預(yù)后極差。隨著手術(shù)操作技術(shù)的提高、術(shù)前術(shù)后放化療、新化療藥物的研發(fā)、新輔助化療聯(lián)合保肢治療的發(fā)展，不僅使患者避免了截肢帶來(lái)的殘疾，而且將5年生存率提高到80%，明顯延長(zhǎng)了骨肉瘤的生存期［5］。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是骨肉瘤患者死亡的主要原因，有效抑制腫瘤侵襲對(duì)防治骨肉瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后具有重要意義。

PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)達(dá)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，PI3K通過(guò)磷酸化激活A(yù)KT調(diào)控下游基因，誘導(dǎo)系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)腫瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲、耐藥等生物過(guò)程發(fā)揮重要作用［3］。AKT是PI3K/AKT通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用高選擇性AKT抑制劑MK－2206阻斷AKT磷酸化激活，研究骨肉瘤細(xì)胞GM63增殖及侵襲能力的變化。Western blot結(jié)果表明 MK－2206可以有效阻斷AKT的磷酸化，并且通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MK－2206抑制骨肉瘤細(xì)胞 MG63的增殖，隨著MK－2206的濃度升高，抑制作用愈加明顯，具有劑量依賴特點(diǎn)。細(xì)胞周期蛋白CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一，CyclinD1表達(dá)增高意味著腫瘤細(xì)胞增值能力增強(qiáng)，其可阻斷相應(yīng)的CDks，消除Rb蛋白對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT－PCR檢測(cè)到MK－2206組細(xì)胞的CyclinD1、CDk4表達(dá)降低，說(shuō)明骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖能力下降。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)新生血管形成，提供腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)［7，8］。同時(shí)VEGF還具有增強(qiáng)血管內(nèi)皮通透性的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。本研究分別檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞MG63中VEGF mRNA和蛋白水平的變化，實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出了VEGF表達(dá)的明顯減少，說(shuō)明MK－2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力起到了抑制作用。Western blot還檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組MG63細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP9的下調(diào)表達(dá)。MMP9是腫瘤細(xì)胞分解破壞基底膜的主要蛋白酶之一，在腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，MMP9的下調(diào)表達(dá)說(shuō)明腫瘤細(xì)胞侵襲能力的降低。

綜上所述，AKT抑制劑 MK－2206通過(guò)阻斷AKT磷酸化阻斷了PI3K/AKT細(xì)胞通路對(duì)MG63骨肉瘤細(xì)胞的影響，下調(diào)表達(dá)了增殖相關(guān)基因CyclinD1、CDk4、VEGF和侵襲相關(guān)基因 MMP9，說(shuō)明MK－2206可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞 MG63的增殖和侵襲能力，為骨肉瘤的新輔助化療提供了新的理論依據(jù)。

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