厚樸揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC指紋圖譜建立△

雷咪，楊敏，張林碧*，王華清，劉義梅，黃傳奇，廖朝林

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000)

·基礎(chǔ)研究·

厚樸揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC指紋圖譜建立△

雷咪1，楊敏1，張林碧1*，王華清1，劉義梅1，黃傳奇1，廖朝林2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000)

目的：應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜(HS-SPME-GC)技術(shù)，建立厚樸揮發(fā)性成分的指紋圖譜。方法：篩選了固相微萃取(SPME)的3種不同萃取涂層的萃取頭：100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)和85 μm聚丙烯酸酯(PA)；優(yōu)化了萃取溫度、萃取時(shí)間和萃取量；采用HP-50毛細(xì)管GC色譜柱，對(duì)13批厚樸藥材進(jìn)行比較分析，建立了厚樸揮發(fā)性成分的指紋圖譜。結(jié)果：選定其中10批優(yōu)質(zhì)樣品建立共有模式，相似度均在0.9以上，其重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合有關(guān)規(guī)定。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、環(huán)保，無(wú)需溶劑樣品前處理，樣品用量小，可作為中藥材質(zhì)量控制的又一手段，其試驗(yàn)數(shù)據(jù)為厚樸的質(zhì)量控制提供了參考。

厚樸；頂空固相微萃取；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；氣相色譜法；指紋圖譜

厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.及凹葉厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、枝皮和根皮，主產(chǎn)于四川、湖北[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，厚樸揮發(fā)油具有增加胃液、唾液分泌，加快腸胃蠕動(dòng)以及健胃等藥理活性[2]。

中藥材揮發(fā)性成分的GC指紋圖譜研究中，常采用水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法、超聲提取法提取揮發(fā)油[3-6]。水蒸氣蒸餾法的高溫易引起熱不穩(wěn)定化合物的分解[7]；超臨界CO2流體萃取法的設(shè)備昂貴、操作步驟繁瑣，還易引入塑料增塑劑或提取出蠟質(zhì)等成分[8]；超聲提取法的影響因素較多，藥材粒度、超聲波頻率等設(shè)置不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致提取效果差異較大[9]。固相微萃取(SPME)是集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，無(wú)溶劑樣品前處理的新技術(shù)，適合對(duì)揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的分析[10]。目前已有大量運(yùn)用頂空固相微萃取(HS-SPME)技術(shù)分析鑒定中藥材揮發(fā)性成分的報(bào)道[11-14]，可見(jiàn)采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法可為中藥材指紋圖譜的建立提供有效的方法。本研究采用HS-SPME-GC技術(shù)，對(duì)13批厚樸藥材的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析，建立了厚樸揮發(fā)性成分的指紋圖譜，為厚樸的內(nèi)在質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 6890N氣相色譜儀、Chemstation色譜工作站、Agilent 6890/5973氣質(zhì)聯(lián)用儀、Nist譜庫(kù)(美國(guó)Agilent公司)；BP-211D 型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Satorius)；手動(dòng)SPME裝置、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、85 μm聚丙烯酸酯(PA)萃取頭(美國(guó)Supelco公司)；PC-220溫度調(diào)節(jié)式磁力攪拌器(美國(guó)Corning公司)；BP-211D電子天平(北京Sartorius公司)。

“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版”軟件(國(guó)家藥典委員會(huì))。

13批厚樸藥材直接從產(chǎn)地采集或購(gòu)于各地藥店，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張林碧教授鑒定，2個(gè)批次為凹葉厚樸，其他均為厚樸。藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 13批厚樸樣品情況

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-50毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣：高純He；恒流：1.3 mL·min-1；程序升溫：50 ℃(1 min)，以4 ℃·min-1上升到140 ℃(2 min)，以2 ℃·min-1上升到180 ℃，以12 ℃·min-1上升到280 ℃，恒溫5 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；分流比為15∶1；氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度：280 ℃；尾吹氣(高純氮)：35 mL·min-1。

2.1.2 質(zhì)譜條件 倍增器電壓為1800 V；接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃；電離方式為EI，電子能量為70 eV；掃描質(zhì)量范圍：35～550 amu。

2.1.3 HS-SPME萃取方法 精密稱取一定質(zhì)量的厚樸藥材粉末(過(guò)60目篩)，于12 mL頂空瓶中加蓋密封，插入SPME萃取頭，在一定溫度下，頂空萃取一定時(shí)間后拔出，立刻插入GC進(jìn)樣口，260 ℃解析3 min，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行GC分析。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

——進(jìn)一步增強(qiáng)醫(yī)療救助托底保障能力，確保年度救助限額內(nèi)農(nóng)村貧困人口政策范圍內(nèi)個(gè)人自付住院醫(yī)療費(fèi)用救助比例不低于70%，對(duì)特殊困難的進(jìn)一步加大傾斜救助力度。

2.2.1 萃取頭的選擇 分別選擇PDMS/DVB(65 μm)、PDMS(100 μm)和PA(85 μm)3種不同涂層的萃取頭，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件、2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行GC分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。氣相色譜圖顯示：PA萃取的峰個(gè)數(shù)太少；不論是出峰數(shù)目還是總峰面積，PDMS/DVB的萃取效率都優(yōu)于PDMS。綜合考慮以上因素，選擇PDMS/DVB萃取頭。

2.2.2 萃取溫度的選擇 加熱溫度分別選擇50、60、70、80、90 ℃，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，見(jiàn)圖2～3。結(jié)果表明，隨著萃取溫度的升高，保留時(shí)間在30 min后各色譜峰峰面積明顯增大，但30 min前的各色譜峰峰面積則有所減少。在90 ℃時(shí)雖然總峰面積與峰個(gè)數(shù)有所增加，但差異性明顯加大，導(dǎo)致部分低沸點(diǎn)物質(zhì)的響應(yīng)值被淹沒(méi)。綜合考慮總色譜峰峰面積及峰個(gè)數(shù)，選定萃取溫度為70 ℃，此時(shí)的峰面積相對(duì)較大且穩(wěn)定，峰個(gè)數(shù)較多。

2.2.3 萃取時(shí)間的選擇 萃取時(shí)間分別選擇30、45、60、75、90 min，按2.1.3項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)圖4～5。在60 min時(shí)，萃取的總峰面積及峰個(gè)數(shù)均較高，而90 min時(shí)峰型較差，所以選定萃取時(shí)間為60 min。

2.2.4 萃取量的選擇 分別選擇0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g的厚樸細(xì)粉，按2.1.3項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)圖6～7。結(jié)果表明，萃取量太低時(shí)，峰個(gè)數(shù)及峰面積都不佳，適當(dāng)增加萃取量后二者均有所提高，量太大導(dǎo)致峰型變差、峰面積有所下降。0.2 g時(shí)出峰個(gè)數(shù)最多，因此選擇0.2 g為萃取量。

圖1 3種SPME萃取頭的GC色譜圖

圖2 萃取溫度對(duì)峰面積的影響

圖3 萃取溫度對(duì)峰個(gè)數(shù)的影響

圖4 萃取時(shí)間對(duì)峰面積的影響

圖5 萃取時(shí)間對(duì)峰個(gè)數(shù)的影響

圖6 取樣量對(duì)峰面積的影響

圖7 取樣量對(duì)峰個(gè)數(shù)的影響

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批厚樸藥材(13號(hào))，按2.1.3項(xiàng)下操作，連續(xù)進(jìn)樣5次，各圖譜的相似度均在0.997以上，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批厚樸藥材(13號(hào))，按2.1.3項(xiàng)下操作，分別在0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣分析，各圖譜的相似度均在0.994以上，表明樣品成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立和分析

表2 13批厚樸樣品中42個(gè)共有峰信息表

表2(續(xù))

表3 揮發(fā)油成分GC-MS結(jié)果表

2.4.2 系統(tǒng)聚類分析 計(jì)算13批不同產(chǎn)地厚樸樣品的指紋圖譜中各共有峰相當(dāng)于內(nèi)參照峰的峰面積比值，得到42×13階的數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用“SPSS”軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用Ward法并利用歐氏距離平方(Squared Euclidean Distance)作為樣品測(cè)度。聚類分析將13批厚樸樣品分為2類，其中樣品1、2、3、4、5、7、13歸為Ⅰ類，其他歸為Ⅱ類。

2.4.3 相似度評(píng)價(jià) 將聚類分析結(jié)果的第Ⅰ類和Ⅱ類中的1、2、3、5、6、7、8、9、12、13號(hào)共10批樣品建立共有模式，將其導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版A”軟件，生成對(duì)照?qǐng)D譜，建立共有模式。生成的10批樣品和對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖8。再將對(duì)照譜圖和13批樣品色譜圖全譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢驗(yàn)版(2004B)”，樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

A.參與共有模式建立的l0批樣品色譜圖；B.生成的GC對(duì)照色譜圖1.鄰聚傘花素；2.對(duì)烯丙基苯酚；3.β-芹子烯；4.α-白菖烯；5-石竹烯氧化物；6.古巴烯；8.白菖烯；9.沉香螺貼醇；12.α-桉葉油醇；13.β-桉葉油醇；14.喇叭茶醇；16.杜松烯；19.對(duì)叔丁基苯甲醚；20.十六酸；21.亞麻油酸。圖8 參與共有模式建立的10批樣品色譜圖和生成的GC對(duì)照色譜圖

樣品編號(hào)相似度樣品編號(hào)相似度樣品編號(hào)相似度10.99760.979110.98820.98870.993120.98230.99080.997130.97040.99790.98650.993100.986

3 討論

3.1通過(guò)SPME的3種不同萃取頭選擇試驗(yàn)可見(jiàn)：萃取頭對(duì)揮發(fā)性成分的吸附差異性取決于其涂層材料，PDMS涂層呈非極性、PA涂層呈極性、而PDMS/DVB涂層呈雙極性，故后者更適合含多種揮發(fā)性成分中藥材的吸附和分析。而涂層的厚度對(duì)待測(cè)物的吸附量和平衡時(shí)間也有一定的影響。

3.2通過(guò)萃取溫度、萃取時(shí)間和萃取量的優(yōu)化可知：萃取溫度增高能增加頂空揮發(fā)性物質(zhì)的濃度，有利于被測(cè)組分的萃取。但SPME是一個(gè)放熱過(guò)程，當(dāng)溫度高到一定程度后，化合物的萃取量反而減少，考慮到溫度太高某些組分重疊更為嚴(yán)重，不利于樣品的定性分析，所以選擇了總峰面積相對(duì)較大且穩(wěn)定，峰個(gè)數(shù)較多的70 ℃為試驗(yàn)的最佳溫度。萃取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)低、高沸點(diǎn)物質(zhì)的萃取量有顯著的影響，因此對(duì)該因素進(jìn)行考察是必要的。萃取量的不同，對(duì)峰面積和個(gè)數(shù)均有影響，萃取量太低時(shí)峰面積和個(gè)數(shù)都不佳；萃取量適當(dāng)增加后，二者均有所提高；萃取量太大又導(dǎo)致峰型變差、峰面積有所下降。本試驗(yàn)還考察了樣品粒度、進(jìn)樣口的解析溫度等因素，最終確定了樣品制備和GC分析的條件。

3.3本試驗(yàn)還分別考察了OV-1、HP-5、HP-50和DB-WAX柱的分離效果，結(jié)果表明OV-1柱對(duì)低沸點(diǎn)物質(zhì)的響應(yīng)較低；HP-5柱對(duì)12、13號(hào)色譜峰的分離效果不佳；DB-WAX柱的最高耐受溫度為250 ℃，在程序升溫至后半段時(shí)基線出現(xiàn)明顯的漂移，故最終選擇分離效果理想、基線平穩(wěn)的HP-50柱。

3.4建立共有模式需要不少于10批有代表性且經(jīng)專家鑒定的藥材樣品，本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示13批樣品的相似度均在0.9以上，未發(fā)現(xiàn)離群樣本?？煽紤]增大樣本批次，進(jìn)行系統(tǒng)分析。

3.5厚樸中揮發(fā)油主要含醇、酮、酯及烯等成分，其中以桉葉油及其異構(gòu)體為主。用GC-MS對(duì)部分成分進(jìn)行了鑒定，根據(jù)樣品的譜庫(kù)檢索結(jié)果和質(zhì)譜圖分析，α-桉葉油醇、β-桉葉油醇是厚樸的主要揮發(fā)性成分，鄰聚傘花素、杜松烯、β-芹子烯、杜松烯也是厚樸的共有成分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和結(jié)構(gòu)分析，成分中對(duì)烯丙基苯酚可能是厚樸的主要成分厚樸酚的降解產(chǎn)物。

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EstablishmentofFingerprintofVolatileCompoundsinMagnoliaeofficinalisCortexbyHS-SPME-GC

LEIMi1，YANGMin1，ZHANGLinbi1*，WANGHuaqing，LIUYimei，HUANGChuanqi，LIAOChaolin2

(1.CollegeofPharmacy，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.InstituteofChineseHebalMedicines，HubeiAcademyofAgriculturalScience，Enshi445000，China)

Objective：To establish the fingerprint of the volatile compounds in Magnoliae officinalis Cortex by headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography(HS-SPME-GC).Methods：The different three SPME fibers were screened and the conditions including extraction temperature，extraction time，sample quantity were optimized through the optimization of GC conditions.13 batches of samples were analyzed and compared using HP-50 capillary gas chromatographic column，the volatile components were identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Result：The samples were classified as 2 grades by cluster analysis and 10 superior samples were selected to establish the mutual models.The similarities were all above 0.9.The repeatability and stability of the method met the requirment.Conclusion：The method is simple，fast，envirnment-friendliness，less consumption of sample and can be used for the quality control.It is also reliable to evaluate the quality of Magnoliae officinalis Cortex.

Magnoliae officinalis Cortex；HS-SPME；GC-MS；GC；fingerprint

2014-08-28)

全國(guó)第四次中藥資源普查(15801448584)；湖北省衛(wèi)生廳科研基金資助重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Z-Y27)

*

張林碧，教授，研究方向：中藥資源與品質(zhì)研究；E mail：diqing2001putin@foxmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.005