牛蒡子質(zhì)量檢驗方法研究△

李彤彤，金燕清，王秋玲，王文全，，3*，侯俊玲*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

·中藥農(nóng)業(yè)·

牛蒡子質(zhì)量檢驗方法研究△

李彤彤1，金燕清1，王秋玲2，王文全1，2，3*，侯俊玲1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

目的：研究牛蒡種子質(zhì)量檢驗方法，為牛蒡種子質(zhì)量檢驗規(guī)程及質(zhì)量分級的制定提供依據(jù)。方法：參照中國《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》對牛蒡種子的扦樣、凈度分析、真實性鑒定、千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)進行了測定。結(jié)果與結(jié)論：通過對牛蒡種子7項指標(biāo)的測定，初步建立了牛蒡種子質(zhì)量檢驗方法。

牛蒡子；種子；質(zhì)量檢驗方法

牛蒡ArctiumlappaL.為菊科植物，其干燥成熟的果實入藥，稱為牛蒡子，是我國臨床常用中藥，具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽的功效；用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛、痄腮丹毒、癰腫瘡毒的病癥[1]。目前我國牛蒡子藥材主要來源于東北野生和西北栽培品，隨著野生資源的日益匱乏，以及人工采收野生資源成本的增加，人工栽培牛蒡子已成為趨勢。然而商品牛蒡種子質(zhì)量參差不齊，其優(yōu)劣直接影響藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量；且目前尚缺乏質(zhì)量檢測標(biāo)準，無法對市場流通種子進行質(zhì)量檢驗和規(guī)范。本文為制定牛蒡種子檢驗規(guī)程和質(zhì)量分級標(biāo)準提供依據(jù)。

1 材料

牛蒡種子于2013年9月分別收集于甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)(WY)，甘肅省岷縣當(dāng)歸城(MX)陜西省南縣合陽市(HY)栽培牛蒡子產(chǎn)地，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為牛蒡A.lappa的種子。

2 方法

2.1 扦樣

2.1.1 種子批 根據(jù)牛蒡種子的市場流通情況和單次可能的交易量及凈度分析試驗樣品不少于2500粒種子，送驗樣品為試驗樣品10倍量確定牛蒡種子批的最大質(zhì)量和樣品最小質(zhì)量。

2.1.2 扦取送驗樣品和試驗樣品 按GB/T3543.2——“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程”扦樣執(zhí)行。

2.2 種子凈度分析

按GB/T3543.3——“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程”凈度分析執(zhí)行。在不損傷發(fā)芽力的基礎(chǔ)上進行檢查，直接挑選純凈種子。

2.3 種子真實性鑒定

觀察測量種子形態(tài)、大小、表面特征和種子顏色，采用種子外觀形態(tài)法，隨機數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，逐粒觀察牛蒡種子形態(tài)特征，并與標(biāo)準種子樣品或鑒定圖片和有關(guān)資料對照，同時做好記錄。

2.4 千粒重測定

分別考察百粒法、五百粒法及千粒法。①百粒法：隨機從凈種子中數(shù)取100粒，重復(fù)8次，分別記錄百粒重，計算標(biāo)準差及變異系數(shù)；②五百粒法：隨機從凈種子中數(shù)取500粒，重復(fù)3次，分別記錄五百粒重，計算標(biāo)準差及變異系數(shù)；③千粒法：隨機從凈種子中數(shù)取1000粒，重復(fù)2次，分別記錄千粒重，計算標(biāo)準差及變異系數(shù)。

2.5 發(fā)芽率測定

2.5.1 發(fā)芽前種子的處理 將牛蒡種子在水中浸泡12 h后，用0.2%高錳酸鉀溶液消毒20 min，用清水沖洗5次用于置種。

2.5.2 適宜發(fā)芽床的確定 發(fā)芽床試驗設(shè)3個處理：①在發(fā)芽盒中鋪3層濕潤的濾紙，然后置種；②在發(fā)芽盒中鋪3層濕潤的紗布，然后置種；③發(fā)芽盒中鋪4 cm厚0.05～0.8 mm的濕細砂(砂水比為4∶1)，然后置種。培養(yǎng)條件為25 ℃光照培養(yǎng)。每個處理300粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

2.5.3 適宜發(fā)芽溫度的確定 將沖洗過的種子置于發(fā)芽床上(濾紙上)，于20 ℃、25 ℃、30 ℃中培養(yǎng)，每個溫度3個重復(fù)，每個重復(fù)100粒。每天記錄、觀察發(fā)芽情況，注意保持培養(yǎng)皿內(nèi)水分。

2.5.4 發(fā)芽計數(shù)時間的確定 根據(jù)種子發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次計數(shù)和末次計數(shù)時間。以胚根伸出種皮2 mm時的天數(shù)為初次計數(shù)時間，以種子萌發(fā)數(shù)達到最高時，以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時的天數(shù)為末次計數(shù)時間。

2.5.5 結(jié)果統(tǒng)計 發(fā)芽率以發(fā)芽終期的全部正常發(fā)芽種子粒數(shù)占供檢種子粒數(shù)的百分率表示。發(fā)芽指數(shù)(GI)以下列公式進行計算：GI=Σ(Gt/Dt)。式中，Gt為在t日后的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。采用 Excel 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.6 含水量測定

參照GB/T3543.6——“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程”水分測定執(zhí)行。用小型粉碎機將種子粉碎約15 s。分別考察高溫烘干法和低恒溫烘干法對種子含水量進行測定。① 高溫烘干法：分別在(133±2)℃高溫條件下，設(shè)置1、2、3、4 h計算種子水分損失量；②低恒溫烘干法：分別在(105±2) ℃低恒溫條件下，設(shè)置5、10、15、20 h計算種子水分損失量。以上試驗每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)(5±0.001) g。

2.7 生活力測定

2.7.1 染色的試驗條件確定

2.7.1.1 種子處理和種子胚的暴露方法 預(yù)處理：將種子在室溫下直接泡于自來水中。牛蒡種子如果時間浸泡太長，組織會腐爛，故浸泡時間為12 h。

種子胚的暴露方法：牛蒡種子則縱向二分之一處切成兩半。

2.7.1.2 染色時間、濃度和溫度 采用3因素3水平L9(34)的正交試驗設(shè)計。四唑染色時間為1、3、5 h濃度設(shè)0.1、0.3、0.5%，置于25，30，35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每個處理300粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。染色結(jié)束后，瀝去溶液，用清水沖洗3次，將裸種子擺在培養(yǎng)皿中，逐一檢查，子葉和胚完全染成紅色的表示有生活力的種子。

2.7.2 有無生活力鑒定標(biāo)準的確定 參照種子的發(fā)芽試驗結(jié)果，擬定出有生活力種子中允許出現(xiàn)的不染色、軟弱或壞死組織的最大面積，建立牛蒡種子四唑活力染色的鑒定標(biāo)準。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

經(jīng)分析種子批的最大質(zhì)量為2000 kg，送驗樣品最少為300 g，凈度分析試樣最少為30 g。

3.2 凈度分析

3份牛蒡種子試樣均沒有其他植物種子，所以本次檢驗記錄這一項為零。使用此方法作凈度分析，各試樣增失差距均沒有偏離原始質(zhì)量的 5%，所以此方法和程序切實可行，見表 1。

表1 不同產(chǎn)地牛蒡種子凈度測定

3.3 真實性鑒定

種子真實性鑒定結(jié)果如下：瘦果長倒卵形，兩端平截，略扁彎曲，長5～7 mm，直徑2～3 mm。表面灰褐色或淡灰褐色，具多數(shù)細小黑斑，并具有明顯的縱棱線。先端較寬，有一圓環(huán)，中心有點狀凸起的花樣殘跡；基部狹窄，有圓形果柄痕。無臭；種子氣特異，味苦微辛，稍久有麻舌感。千粒重一般為9～12 g。

3.4 千粒重測定

千粒重結(jié)果見表2，各處理間變異系數(shù)均小于4.0%，而千粒法測定變異系數(shù)最小，平均為0.69。對3方法測定的千粒重值進行多重比較，有顯著差異(P<0.05)。綜合比較3方法，選擇千粒法作為牛蒡種子千粒重的測定方法。

表2 牛蒡種子不同千粒重測定方法比較

3.5 發(fā)芽率測定

3.5.1 發(fā)芽前種子的處理 將牛蒡種子在水中浸泡12 h后，用0.2%高錳酸鉀溶液消毒20 min，用清水沖洗5次用于置種。

3.5.2發(fā)芽床的確定 通過比較 3個產(chǎn)地牛蒡種子在不同發(fā)芽床上的發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，采用濾紙床時，無論從發(fā)芽率還是發(fā)芽指數(shù)都較優(yōu)于紗布床和砂土床，且有顯著差異(P<0.05)，故選擇濾紙床為牛蒡種子發(fā)芽床，見表3。

表3 不同發(fā)芽床間牛蒡種子發(fā)芽情況比較

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取α=0.05水平，同一列中含有不同字母者為差異顯著，下表同。

3.5.3 發(fā)芽溫度的確定 不同發(fā)芽溫度下，牛蒡種子發(fā)芽率表現(xiàn)出一定的差異。通過比較3個產(chǎn)地牛蒡種子在不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，結(jié)果表明(見表4)：當(dāng)溫度為25 ℃時，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)都較高，和其他溫度比較差異顯著(P<0.05)。故選擇25 ℃作為牛蒡種子發(fā)芽溫度。

表4 不同發(fā)芽溫度下牛蒡種子發(fā)芽情況比較

3.5.4 發(fā)芽計數(shù)時間的確定 吸脹后的牛蒡種子發(fā)芽速度很快，置發(fā)芽床后第2 d胚根迅速露出種皮，第6 d以后發(fā)芽速度明顯下降，并趨于平緩，第8 d后很少有再發(fā)芽情況，見圖 1。所以，整個發(fā)芽計數(shù)時間在第 2～8 d。第 2 d可作為初次計數(shù)時間，第8d可作為末次計數(shù)時間。

圖1 牛蒡種子發(fā)芽率與發(fā)芽時間的關(guān)系

3.6 含水量測定

牛蒡種子在高溫下烘干4 h 后，失水量基本保持穩(wěn)定，并且在4～5 h失水量無顯著差異。此后數(shù)小時重量不變，綜合2個產(chǎn)地種子情況，選擇烘干時間4 h為宜；在低恒溫烘干后15 h內(nèi)失水量差異不顯著。15～20 h差異性顯著，20 h后失水量幾乎不變，重量基本恒定，綜合2個產(chǎn)地種子情況，選擇烘干時間20 h為宜，見表5。同時，對高溫烘干4時和低溫烘干20 h間測定牛蒡種子含水量進行比較發(fā)現(xiàn)，2種烘干方法間測定值差異不顯著。鑒于低恒溫烘干法所需時間較長，所以選擇高溫烘干4 h為宜。

表5 不同烘干時間下牛蒡種子失水量變化

3.7 生活力測定

3.7.1 染色試驗條件的確定 由表6可知，牛蒡種子染色情況與染色的時間、濃度、溫度均有密切聯(lián)系。試驗結(jié)果表明，處理5，9染色情況較好，著色率都在90%以上。但由于四唑有毒性，從染色時間和濃度綜合考慮，選擇處理5，即染色3 h，0.4%四唑濃度，35 ℃作為牛蒡種子生活力檢測的染色條件為宜。

3.7.2 有無生活力鑒定標(biāo)準的確定 有活力的牛蒡種子被染成有光亮的紅色，且染色均勻。符合下列任意一條的列為有生活力種子：①胚完全著色；②子葉端小于1/3不染色，其余全部染色。無生活力的種子染色情況：①胚完全不著色；②胚根不染色。

表6 四唑不同處理對牛蒡種子染色著色率的影響

本研究從扦樣、凈度分析、真實性鑒定、千粒重、發(fā)芽率、含水量及生活力7方面對甘草種子質(zhì)量檢驗方法進行研究，確定適宜甘草種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗方法，見表7。

表7 牛蒡種子質(zhì)量檢驗方法

4 討論

不同產(chǎn)地牛蒡種子有一定差異，在進行質(zhì)量檢驗方法建立時需考慮種子材料的代表性。本研究試驗用種取自牛蒡種子 3個主產(chǎn)地，能較好的代表生產(chǎn)上牛蒡用種的質(zhì)量[2]。

在牛蒡種子生活力快速檢測過程中，曾應(yīng)用溴麝香草酚蘭(BTB)法，但 BTB 瓊脂制作麻煩、冷凝時間快，是否染色不容易觀察，規(guī)律性不強，不能準確反映種子的生活力狀況。由實驗分析可知，四唑染色法測定的牛蒡種子生活力是真實的，并且與發(fā)芽率存在極大的相關(guān)性。

種子的優(yōu)劣是保障中藥材種植后能否獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)和達到國家法定部門規(guī)定可控指標(biāo)的關(guān)鍵，特別是純天然、無公害的中藥材生產(chǎn)，更離不開種子的質(zhì)量監(jiān)控[3]。目前，在發(fā)達國家種子質(zhì)量評價中，對種子健康度、種子活力和品種純度檢驗的要求日益增多[4]。但我國目前尚不具備全面開展健康檢驗的條件，同時大多數(shù)中藥材種源混雜，沒有品種之分，使得這些方面檢測指標(biāo)推廣受到限制[3]。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2010：66.

[2] 于福來，王文全，方玉強，等.甘草種子質(zhì)量檢驗方法研究[J].中國中藥雜志，2011，36(6)：746.

[3] 陳君，楊世林.不同來源黃芩種子的質(zhì)量比較[J].中藥材，2002，25(9)：617.

[4] 淡紅梅，祁建軍，周麗莉，等.丹參種子質(zhì)量檢驗方法的研究[J].中國中藥雜志，2008，33(17)：2093.

StudyontheMethodofQualityTestfortheSeedofFructusarctii

LITongtong1，JINYanqing1，WANGQiuling2，WANGWenquan1，2，3*，HOUJunling1*

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijinguniversityofChinesemedicine，Beijing100102，China；2.InstituteofMedicinalPlants，ChineseAcademyofMedicalSciences，Pekingunionmedicalcollege，Beijing100193，China；3.EngineeringResearchCenterofGAPforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China)

Objective：The aim of this study was to optimize the testing methods for seed quality，and to provide a basis for establishing seed testing rules and quality grading standard ofArctiumlappa.Methods：The effect of pre-treatment methods，illumination condition，germination bed and culture temperature on the germination ofA.lappa.seeds was compared.ResultsandConclusion：The seed testing methods for quality items ofA.lappahad been initially established.

Arctiumlappa；seed；quality testing methods

2014-11-27)

國家“中藥材種子種苗和種植(養(yǎng)殖)標(biāo)準平臺”科技重大專項(2012ZX09304006)

*

王文全，教授，研究方向：中藥材質(zhì)量評價及其產(chǎn)品開發(fā)；Tel：(010)84738334，Email：wwq57@126.com； 侯俊玲，教授，研究方向：中藥材質(zhì)量評價；Tel：(010)84738334，E-mail：mshjl@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.018