鈉離子依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體2特性、表達調(diào)控及功能

李光燃 譚碧娥 管桂萍 印遇龍

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，長沙 410125;2.中國科學院大學，北京 100049;3.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，長沙 410128)

氨基酸是機體重要功能物質(zhì)合成的必需前體物，在維持機體正常的生長、發(fā)育和繁殖方面發(fā)揮重要作用。機體每天都需要補充大量的氨基酸作為底物參與細胞蛋白質(zhì)的合成以及為細胞生長提供能量。氨基酸主要通過需鈉耗能的主動轉(zhuǎn)運方式在小腸吸收。腸黏膜細胞膜上轉(zhuǎn)運氨基酸的載體利用細胞內(nèi)外的鈉離子(Na+)濃度梯度將氨基酸和Na+轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，而Na+則利用鈉泵主動排到胞外。哺乳動物細胞中廣泛存在氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，依據(jù)轉(zhuǎn)運是否依賴Na+可分為Na+依賴轉(zhuǎn)運載體和非Na+依賴轉(zhuǎn)運載體［1］。其中Na+依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體(sodium dependent neutral amino acid transporter，SNAT)2作為體內(nèi)主要的氮轉(zhuǎn)運載體，成為近年來發(fā)現(xiàn)的氨基酸轉(zhuǎn)運感受體(transceptor)的典型代表。本文圍繞SNAT2的分子特性、生物學特性、表達調(diào)控及其介導(dǎo)的氨基酸感應(yīng)信號的研究進展進行綜述。

1 分子特性

SNAT2以前被稱為 ATA2、SAT2或 SA1，是溶質(zhì)載體家族38(solute carrier family 38，SLC38)的第2個成員，該家族中的SNAT1和SNAT3最先被克隆，隨后SNAT2的基因序列及SNAT2分子結(jié)構(gòu)也被探明［2］。SNAT2蛋白由506個氨基酸組成，理論分子質(zhì)量約為56 ku。采用ClustalW 對SLC38家族各成員蛋白序列進行多序列比對后，再用MEGA6對其做同源性分析，結(jié)果表明:SNAT2與SNAT4的氨基酸序列相似度最高，達到58%;與 SNAT6氨基酸序列的相似度最低，為45%(圖1)［2］。各個成員之間的氨基酸相似性分析結(jié)果可以看出，SLC38家族成員間蛋白結(jié)構(gòu)及功能的相似性，對于進一步認識家族各成員的結(jié)構(gòu)、功能、分布與表達都有重要的參考價值。

圖1 SLC38家族各成員蛋白序列發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of SLC38 family［2］

由于SNAT2的晶體結(jié)構(gòu)目前還沒有報道，目前的研究多是基于和已知晶體結(jié)構(gòu)的同源性高的蛋白質(zhì)比較分析。Yao等［2］運用親水性分析預(yù)測了SNAT2具有11個跨膜區(qū)(transmembrane domain，TMD)，且由于其氨基酸序列N端缺少膜插入信號肽從而推測N端位于細胞內(nèi)側(cè)，C端在細胞外側(cè)，預(yù)測的TMD5與TMD6之間存在2個糖基化位點(圖2)［2］。也有研究構(gòu)建的拓撲模型顯示SNAT2有12個跨膜區(qū)且C末端位于胞內(nèi)［3-4］，Hyde等［5］通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)SNAT2的C末端抗原表位在在胞外區(qū)域是很容易被找到的，有力地支持了11跨膜區(qū)模型。有研究預(yù)測，SNAT2在膜螺旋區(qū)1和8的中央具有1個保守的Na+結(jié)合位點，其中蘇氨酸-384(Thr-384)被認為是Na+結(jié)合位點的一部分，Thr-384位點的突變不僅可以抑制陰離子流動(該過程需要Na+結(jié)合到SNAT2上)，也可以顯著降低 SNAT2對 Na+的親和力［6］。此外，研究表明，TMD1上的保守氨基酸——天冬酰胺-82(Asn-82)直接或間接的涉及到SNAT2對Na+的協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運，推測TMD1對于 SLC38家族的轉(zhuǎn)運體的功能都是至關(guān)重要的［7］。

圖2 SNAT2的拓撲結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of topology structure of SNAT2［2］

2 生物學特性

轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A是哺乳動物細胞中受胰島素調(diào)控的重要氨基酸轉(zhuǎn)運載體，且分布廣泛，SNAT基本分布于吸收性上皮細胞的基底外側(cè)膜上，其中SNAT2對底物表現(xiàn)出廣泛的親和性，除了偏好轉(zhuǎn)運谷氨酰胺之外，還轉(zhuǎn)運蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和組氨酸［8］。N-(甲基氨基)-異丁酸(methylamino-isobutyric acid，MeAIB)是 A類氨基酸轉(zhuǎn)運載體的特異性底物，運用MeAIB的競爭性抑制試驗檢測SNAT2對各種不同底物的轉(zhuǎn)運親和力，發(fā)現(xiàn)SNAT2對丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和絲氨酸親和力較高，而基本上不轉(zhuǎn)運帶電氨基酸(谷氨酸、賴氨酸)以及分子質(zhì)量較大的氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等)［9］。胰腺α和β細胞中SNAT之間會發(fā)生互相轉(zhuǎn)運底物的情況，比如當血漿中谷氨酰胺的濃度很低的時候，SNAT3會釋放谷氨酰胺供應(yīng)給SNAT2作為底物，以此刺激胰高血糖素的分泌［10］。

有研究表明，SNAT2可介導(dǎo)某些陰離子的跨膜流動，當SNAT2轉(zhuǎn)運某些底物如丙氨酸、谷氨酰胺或MeAIB時，其陰離子電流通道可以被不同程度的抑制，尤其是轉(zhuǎn)運MeAIB時表現(xiàn)出最大的抑制效應(yīng)［11］。SNAT2蛋白跨膜區(qū)域1的Asn-82和跨膜區(qū)域8的Thr-384與Na+的結(jié)合有關(guān)，C端可以通過電壓依賴性過程調(diào)節(jié)氨基酸的轉(zhuǎn)運［7，12］。SNAT2蛋白的組氨酸-304(His-304)如果突變?yōu)楸彼釙r，SNAT2介導(dǎo)的陰離子電流的能力會增強，此時若轉(zhuǎn)運底物為丙氨酸，其能力則受到強烈的抑制;且SNAT2對硫酸氫根離子的滲透性比氯離子高。因此，認為SNAT2更偏向轉(zhuǎn)運疏水性陰離子，Na+可以增加電流幅度，但Na+與SNAT2的結(jié)合并不是陰離子電流產(chǎn)生的必要條件［11］。

研究表明，SNAT2可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)參與合成代謝的氨基酸濃度，調(diào)控核苷酸/核酸代謝和細胞生長的氨基酸信號。SNAT2作為重要的氨基酸轉(zhuǎn)運載體可以通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)氨基酸含量間接調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達以此來影響胞內(nèi)總體mRNA水平，進而影響整個細胞的生長情況［13］。抑制SNAT2影響哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白到核糖體蛋白 S6激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)、核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6，rpS6)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1)的信號通路，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程受到抑制。已經(jīng)有研究證實，支鏈氨基酸能通過SNAT2誘導(dǎo)激活mTOR，表現(xiàn)為磷酸化S6K1蛋白表達量升高［13］。SNAT2也可通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PIK3)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)等mTOR通路的重要調(diào)控因子，發(fā)揮更重要的調(diào)控作用［14］。此外，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病或胰高血糖素處理都會使SNAT2表達顯著上調(diào)，表明SNAT2可能在供應(yīng)氨基酸進入糖異生途徑方面發(fā)揮了一定的作用［15］。

3 SNAT2的調(diào)控

3.1 底物

首先，底物濃度的改變會影響SNAT2的mRNA水平。氨基酸饑餓可以提高SNAT2的mRNA水平已經(jīng)在許多組織中被證實。Hyde等［5］證實，在肌管細胞L6和脂肪細胞3T3-L1中SNAT2蛋白含量的升高是由氨基酸饑餓誘導(dǎo)。在BeWo細胞中發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸缺失時，SNAT1的mRNA水平在1 h內(nèi)有明顯下降，SNAT2的mRNA水平在1 h內(nèi)沒有變化而需要3 h或者更長時間上升;當增加氨基酸供應(yīng)時，SNAT2的mRNA水平也有顯著提高［16］。氨基酸饑餓處理引起的SNAT2表達上調(diào)可能是因為加強了SNAT2蛋白的從頭合成途徑，進而使得質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運載體的密度升高［17］。Tanaka等［17］發(fā)現(xiàn)，將人滋養(yǎng)層細胞置于無氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A的活性增加，其刺激作用可以被放線菌素D(RNA合成抑制劑)和放線菌酮(蛋白合成抑制劑)顯著的減弱。轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A底物，包括合成的氨基酸類似物MeAIB，都可以抑制氨基酸饑餓條件下SNAT2表達的增高。同樣，細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A底物的過量累積也會抑制胞外氨基酸的進一步內(nèi)流，SNAT2就受這種反饋抑制的調(diào)節(jié)，不僅控制了氨基酸充足時胞內(nèi)氨基酸濃度的過度升高，也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運載體感應(yīng)胞內(nèi)外氨基酸濃度介導(dǎo)的信號通路［18］。而在果蠅中發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)A底物對SNAT2表達的抑制作用可能并不是通過SNAT2本身起作用的，而是通過質(zhì)子依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運載體(proton-assisted amino acid transporter，PAT)，PAT 屬于 SLC36 家族成員，與 SNAT2共有一些底物，如丙氨酸和脯氨酸［19］。

增加必需氨基酸的含量也可以提高SNAT2的mRNA及蛋白表達水平，且是以一種依賴mTOR通路的途徑，這可能是對于增加的胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運壓力的一種適應(yīng)性機制［20］。氨基酸被轉(zhuǎn)運進入或運出質(zhì)膜可能是分別依賴mTORC1或通用控制蛋白2激酶(general control nonderepressible 2，GCN2)氨基酸感應(yīng)通路的［20］。其中 GCN2 途徑的激活不僅是為了控制胞內(nèi)游離氨基酸的進一步損失，而且可以作為恢復(fù)正常氨基酸水平的調(diào)節(jié)途徑［18］。氨基酸饑餓和氨基酸添加誘導(dǎo)SNAT2的表達都是由轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)介導(dǎo)的，但2種條件下ATF4的激活途徑是不同的。氨基酸饑餓條件下，不帶電的tRNAs累積，GCN2被激活，eIF2α被磷酸化，導(dǎo)致翻譯起始和蛋白合成的下調(diào)［18］。但是，這并不會減少支持轉(zhuǎn)運載體基因表達的蛋白質(zhì)的合成，因為SNAT2 mRNA的5＇-非翻譯區(qū)(URT)含有1個內(nèi)部核糖體進入序列(IRES)，在氨基酸饑餓環(huán)境中總蛋白質(zhì)合成受抑制的情況下，SNAT2的mRNA也會通過帽端依賴機制非常有效地表達［21］。在添加氨基酸的條件下，GCN2增加了ATF4的表達，ATF4作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運體基因的轉(zhuǎn)錄。也就是說，氨基酸充足會刺激胰島素-mTOR信號(表現(xiàn)為同化作用)，氨基酸缺乏會激活GCN2信號(表現(xiàn)為異化作用)，二者共同利用ATF4為靶點來調(diào)節(jié)氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達，轉(zhuǎn)運載體的上調(diào)為滿足胞內(nèi)能量需要提供快捷途徑。但是，目前并不清楚胰島素是通過胰島素受體直接作用于mTORC1而激活A(yù)TF4還是通過SNAT2等轉(zhuǎn)運載體形成氨基酸內(nèi)流間接參與到 mTOR 通路中［18］。

底物種類也會影響SNAT2的表達，底物對SNAT2的抑制作用與底物和SNAT2轉(zhuǎn)運Km系數(shù)正相關(guān)［3］。亮氨酸處理肌管細胞可以增加SNAT2的mRNA水平，這個過程是依賴mTOR信號通路的，可能是以依賴mTORC1的ATF4信號途徑識別并轉(zhuǎn)運胞外的支鏈氨基酸進入胞內(nèi)而導(dǎo)致了 SNAT2 表達的增加［13］。Grewal等［22］研究表明，添加一定濃度的谷氨酰胺可以抑制SNAT2的表達，同時也可以抑制神經(jīng)元細胞內(nèi)SNAT2啟動子中氨基酸反應(yīng)元件與ATF4和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白的結(jié)合。并不是只有轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A的底物抑制SNAT2。?；撬帷ⅵ?氨基丁酸、β-丙氨酸被證實比轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A底物更加強烈的抑制SNAT2，但SNAT2對于它們的響應(yīng)速度較慢［22］。

3.2 激素

SNAT2的活性受到胰島素和胰高血糖素的調(diào)節(jié)。研究表明，鼠骨骼肌L6細胞在胰島素刺激下，轉(zhuǎn)運載體匯集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有PIK3的參與［23］，而添加胰高血糖素導(dǎo)致SNAT2活性的升高可能是由環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)介導(dǎo)的［15］。運用 Northern blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，添加雌性激素(17β-雌二醇)能使具有陽性受體的腫瘤細胞或乳腺癌細胞中SNAT2的mRNA水平提高，但添加雌激素受體拮抗劑ICI182780可以抵消這種效應(yīng)［24］。分析SNAT2啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游的1 471和1 486堿基之間存在1個假定的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)［25］。泌 乳 期 間17β-雌二醇通過SNAT2啟動子內(nèi)的ERE結(jié)合到一個含特異的聚(二磷酸腺苷-核糖)合酶1、狼瘡Ku抗原蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的復(fù)合體上，起到激活 SNAT2的作用。Jones等［26］在人胎盤細胞系細胞BeWo中發(fā)現(xiàn)，較低濃度(20～50 nmol/L)的皮質(zhì)醇對SNAT2的mRNA和SNAT2蛋白水平無影響，但可以調(diào)控SNAT2蛋白從胞內(nèi)重新定位到質(zhì)膜上;當濃度增加為1 000 nmol/L時，mRNA和蛋白水平都增加。

3.3 細胞環(huán)境

高滲透壓可引起SNAT2 mRNA水平的提高已在多種組織中證實。高滲透壓刺激下，轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A活動的增加主要依賴新的SNAT2合成［21］，依靠激活的T細胞5的核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5)，NFAT5 與高滲透壓激活的上游調(diào)控基因的滲透壓反應(yīng)元件相結(jié)合發(fā)揮作用。滲透壓應(yīng)激可以激活分裂酶原蛋白激酶(mitogen actvated protein kinases，MAPK)下的級聯(lián)反應(yīng)，其中ERK作為一個促進有絲分裂信號的傳感器在滲透壓應(yīng)激下的鼠嗜鉻瘤細胞PC12中被大量激活。ERK還參與到SNAT2應(yīng)對氨基酸缺乏的適應(yīng)性信號傳導(dǎo)途徑，通過使結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物 2(tuberous sclerosis complex2，TSC2)轉(zhuǎn)錄后失活參與到mTOR信號通路中［27］。

SNAT2對酸環(huán)境非常敏感。當胞外pH高于7.5時SNAT2的活性會顯著增加，當胞外pH低于7.5時SNAT2活性會顯著降低。SNAT2與Na+共轉(zhuǎn)運比例為1∶1，即使SNAT2對pH高度敏感的，H+不大可能是一個可移動的與SNAT2偶聯(lián)的離子［4］。SNAT2對酸環(huán)境的敏感性可能與組氨酸殘基有關(guān)，轉(zhuǎn)運載體在細胞質(zhì)區(qū)域具有一個對pH敏感的結(jié)構(gòu)域，可能是由組氨酸殘基負責胞內(nèi)pH誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運載體功能的改變，組氨酸修飾劑焦碳酸二乙酯(DEPC)可以顯著降低SNAT2對pH環(huán)境的敏感度［28］。因此，SNAT2可能是治療尿毒癥、急性酸中毒等疾病的理想藥物靶點。

不同因素對SNAT2表達的調(diào)控作用的強弱無法判定，因組織或細胞的種屬和部位不同而影響不同。鼠骨骼肌細胞L6在添加胰島素、高滲透壓和氨基酸缺乏3種培養(yǎng)條件下比較發(fā)現(xiàn)，3種處理都使SNAT2的表達上調(diào)，其上調(diào)作用從強到弱依次為高滲透壓、氨基酸缺乏和添加胰島素［29］?？傊?，SNAT2的表達長期的上調(diào)是該基因轉(zhuǎn)錄增加的結(jié)果，而短期迅速的上調(diào)則是SNAT2蛋白從細胞內(nèi)重新定位分布到質(zhì)膜導(dǎo)致的，這樣的調(diào)節(jié)方式與胰島素誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(glucose transporter 4，GLUT4)的機制十分相似［15，23］。

4 SNAT2與氨基酸感應(yīng)信號

氨基酸轉(zhuǎn)運載體的底物結(jié)合位點可以被很好的定位，以此來充當膜內(nèi)外側(cè)氨基酸濃度的直接感受器，這為感應(yīng)氨基酸的受體結(jié)合行為轉(zhuǎn)化為下游胞內(nèi)級聯(lián)信號提供了一種可能的機制。SNAT2底物結(jié)合位點的占用可以激發(fā)了一個抑制性信號，以此來減弱氨基酸總體缺乏而發(fā)揮適應(yīng)性調(diào)節(jié)作用［3］。SNAT2載體的結(jié)合位點占據(jù)是如何被感知的，感知后的信號如何調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄過程仍然是未知的。膜內(nèi)底物結(jié)合位點的定位分為信號和非信號2種構(gòu)象，氨基酸底物在胞內(nèi)的結(jié)合把轉(zhuǎn)運載體鎖在向內(nèi)的構(gòu)象即非信號構(gòu)象，這種性質(zhì)與轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A的反式抑制相似［30］，細胞質(zhì)內(nèi)的氨基酸可以抑制轉(zhuǎn)運載體對胞外的氨基酸的吸收［3］。超表達SNAT2發(fā)現(xiàn)，反式抑制能通過細胞質(zhì)內(nèi)氨基酸的結(jié)合把SNAT2鎖定為向內(nèi)的構(gòu)型，以此阻止空載的轉(zhuǎn)運體回到質(zhì)膜的外表面來完成轉(zhuǎn)運循環(huán)。SNAT2的反式抑制會允許質(zhì)膜2側(cè)底物的濃度對氨基酸吸收速率的反饋性動力學調(diào)節(jié)［31］。在飽和的MeAIB環(huán)境中，肌細胞對胰島素誘導(dǎo)的PI3K途徑和蛋白激酶(protein kinase，PKB/Akt)磷酸化過程有激活性作用，相反，用RNA干擾沉默SNAT2表達，對PI3K的脂類激酶活動有抑制性作用［32］。目前并不清楚SNAT2如何調(diào)節(jié)PI3K/PKB信號途徑，但很可能會協(xié)同增強胰島素對 mTOR通路的作用。Hundal等［18］認為SNAT2可能直接調(diào)控mTOR信號通路，在人乳腺癌細胞MCF7培養(yǎng)基中添加MeAIB，盡管可以通過抑制轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A的跨膜轉(zhuǎn)運使得胞內(nèi)氨基酸含量減少，同時也誘導(dǎo) S6K1的磷酸化。但MeAIB處理對mTOR信號通路產(chǎn)生的積極作用，可能是由于對營養(yǎng)物質(zhì)敏感的胞內(nèi)激酶家族的激活，而不是通過 SNAT2本身［33-34］。此外，SNAT2會與其他轉(zhuǎn)運系統(tǒng)如系統(tǒng)L發(fā)生偶聯(lián)作用，例如，如果谷氨酰胺的濃度較高，細胞會加大系統(tǒng)L底物的吸收來增強調(diào)節(jié)mTOR信號通路的能力［18］。

5 小 結(jié)

SNAT2作為體內(nèi)主要的氮轉(zhuǎn)運載體，對底物具有廣泛的親和性，受底物、激素和細胞環(huán)境等因素調(diào)控。SNAT2通過轉(zhuǎn)運過程調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氨基酸的濃度，從而調(diào)控細胞內(nèi)氨基酸感應(yīng)信號，發(fā)揮著氨基酸轉(zhuǎn)運載體和受體的雙重功能。以后研究需進一步了解SNAT2的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，研究其偶聯(lián)作用的動力學特征和胞內(nèi)氨基酸感應(yīng)的分子機制，以全面揭示SNAT2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運機制和感應(yīng)信號通路。

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