蠶絲蛋白/PCL共混取向纖維的力學(xué)性質(zhì)與細(xì)胞響應(yīng)

袁 翰 鄭 欣 邱旭升 陳一心*

1(南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210046)2(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,南京 210008)

蠶絲蛋白/PCL共混取向纖維的力學(xué)性質(zhì)與細(xì)胞響應(yīng)

袁 翰1鄭 欣2邱旭升2陳一心2*

1(南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210046)2(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,南京 210008)

蠶絲蛋白因其良好的機械強度、生物相容性和耐滅菌性，是目前骨修復(fù)領(lǐng)域不可多得的天然蛋白支架材料。為提高蠶絲蛋白支架對細(xì)胞定向移動的引導(dǎo)能力和力學(xué)強度，采用靜電紡絲方式制備較高取向度的PCL/蠶絲蛋白共混纖維支架，并與非取向型對比。通過掃描電鏡圖像分析技術(shù)表征靜電紡絲纖維表面的取向度，并比較不同纖維排列結(jié)構(gòu)下的力學(xué)性質(zhì)。間充質(zhì)干細(xì)胞在骨修復(fù)中應(yīng)用廣泛。人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自健康獻髓者，在體外培養(yǎng)條件下，測試不同結(jié)構(gòu)材料對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，并使用活細(xì)胞工作站實時追蹤細(xì)胞在不同材料表面的運動功能。結(jié)果表明，在取向靜電紡絲纖維支架中，91%的纖維分布于10°范圍以內(nèi)，且該支架具有力學(xué)的各向異性，具有較大的軸向拉伸模量。在間充質(zhì)干細(xì)胞增殖96 min后，中取向靜電紡絲纖維支架組的細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生顯著差異。在取向纖維材料表面生長的間充質(zhì)干細(xì)胞展現(xiàn)出最小的細(xì)胞分布夾角，僅為6.57°±4.45°，同時，取向纖維表面的細(xì)胞長度有顯著提高(236.46±82.00) μm。在進一步的實時細(xì)胞追蹤中，在細(xì)胞的主要移動方向上，取向纖維表面的細(xì)胞分解移動速度達6.66 μm/h，遠遠高于其他表面。因而，取向靜電紡絲纖維支架可能在體內(nèi)應(yīng)用中支持成體干細(xì)胞增殖，并加快早期細(xì)胞定向遷移。

靜電紡絲；蠶絲蛋白；間充質(zhì)干細(xì)胞；取向纖維支架；細(xì)胞移動

引言

由于車禍等高能創(chuàng)傷的不斷增多，創(chuàng)傷或繼發(fā)感染導(dǎo)致的骨缺損成為了骨科醫(yī)師面對的一大挑戰(zhàn)。自體骨移植術(shù)是治療骨缺損的有效手段，然而自身骨量有限，且增加了患者多處手術(shù)的風(fēng)險和痛苦[1]。組織工程學(xué)材料結(jié)合多能干細(xì)胞制成的骨修復(fù)材料，可促進植入部位新骨形成，有望降低對自體骨的需要，部分甚至全部替代自體骨組織[2]。

以金屬為基礎(chǔ)的材料首先應(yīng)用于骨組織修復(fù)中，然而金屬的植入物需要二次手術(shù)取出，給患者帶來較大痛苦。多種可吸收材料(如聚丙交酯(PLA)、聚已內(nèi)酯(PCL)和聚乙交酯復(fù)合丙交酯(PLGA)等)在實驗中成功被新生組織替代，得到了廣泛的關(guān)注[3]。其中，聚己內(nèi)酯材料(PCL)延展性良好，可體內(nèi)降解，已制成了多種組織功能材料。以蠶絲蛋白為代表的天然可降解材料則具有較低的免疫原性，且蠶絲蛋白可以耐受高壓高溫滅菌，其力學(xué)強度較好，并且有良好的生物相容性。蠶絲蛋白在體內(nèi)降解的過程以及對骨重建的支持作用已有一定的實驗基礎(chǔ)[6-9]。然而，單純蠶絲蛋白在靜電紡絲的應(yīng)用中延展性較差，通過共混溶液紡絲技術(shù)則可以引入具有良好延展性的聚已內(nèi)酯(PCL)材料。這種共混材料能否獲得更佳的力學(xué)性能，乃是取向納米纖維的制備以及骨科動力固定材料的基礎(chǔ)。

在新近涌現(xiàn)的材料設(shè)計中，保持骨折斷端的微動、形成動態(tài)的固定方式成為關(guān)注的焦點。Goodship等通過動力裝置，在山羊骨折模型中首次觀察到微動可以加速骨缺損愈合[10]。隨后，大量臨床觀察[11]與實驗研究[12-13]證實，骨折端微動不僅有益于骨痂形成，而且加快局部血管化與干細(xì)胞分化，最終縮短了骨折愈合時間。設(shè)計微動固定材料的關(guān)鍵在于提供骨折斷端運動的彈性空間，并且防止骨折線的不穩(wěn)定[11, 14]。本課題組通過靜電紡絲方法，制備出取向纖維支架[16]。取向纖維結(jié)構(gòu)使材料具有力學(xué)各向異性，可令骨折斷端在軸向上擁有更大的彈性固定力，同時提供一定的微動空間。

調(diào)控材料的表面形貌，提高纖維材料的取向性，可以調(diào)控細(xì)胞運動功能[15]。間充質(zhì)干細(xì)胞向骨折端加快集結(jié)后，可以進一步分化為成骨細(xì)胞，因而可以加快骨修復(fù)進程，縮短骨折愈合的時間。本研究的前期實驗已成功制備了蠶絲蛋白纖維支架，證實其生物相容性，而本研究則進一步借助活細(xì)胞工作站，實時原位記錄細(xì)胞的運動過程，以矢量方式進行驗算，從而評價取向纖維材料在加快細(xì)胞定向移動方面的價值。

1 材料和方法

1.1材料制備與表征

蠶絲蛋白購自江蘇省絲綢集團有限公司。蠶絲蛋白支架的靜電紡絲制備采用旋轉(zhuǎn)電極接收法[16]，現(xiàn)簡述如下：以熱堿法脫去蠶絲絲膠，得到純蠶絲蛋白。通過三元溶解溶液——CaCl2/乙醇/H2O混合溶液(摩爾比1∶2∶8)溶解蠶絲蛋白，并經(jīng)純水充分透析除去雜質(zhì)。取向靜電紡絲纖維支架是通過高速旋轉(zhuǎn)的接收電極制備，在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下制得取向纖維支架，而非取向纖維支架在低轉(zhuǎn)速(500 r/min)下取得(裝置結(jié)構(gòu)見圖1)。紡絲液采用蠶絲蛋白1.5 g與PCL 0.5 g，共同溶解于20 g無水甲酸中。兩組材料均在19 kV紡絲電壓、180 min內(nèi)取得。分子生物學(xué)實驗采用24孔板，接種干細(xì)胞于對應(yīng)材料包被的細(xì)胞爬片表面。

圖1 靜電紡絲機裝置Fig.1 The schematic diagram of electrospinning device

在實驗中活細(xì)胞工作站將靜電紡絲原始纖維膜分割，覆蓋于方形載玻片上，使用UV 光固化膠 (LOCTITE?3011)組裝，方式見圖2。掃描電鏡材料采用不同纖維材料，試樣剪切為4 mm×4 mm樣方后，二氧化碳超臨界干燥，真空噴金，并通過掃描電鏡觀察(場發(fā)射掃描電鏡：Hitachi, SU-70, 日本)。

圖2 原位觀察間充質(zhì)干細(xì)胞裝置概覽(A-普通細(xì)胞培養(yǎng)皿； B-沖壓φ15mm 圓孔后的細(xì)胞培養(yǎng)皿；C和E-無涂層 18 mm 和 20 mm 蓋玻片；D-靜電紡絲原始纖維膜，分割為 25 mm×25 mm 方形試樣以張力覆蓋于方形載玻片上，使用UV 光固化膠封裝；F-半透膜滅菌袋封裝滅菌)Fig.2 An overview on petri dishes for in situ observation(A-Regular polystyrene petri dish; B-Punched petri dish with a φ15 mm round hole; C and E-Regular 18mm and 20mm cover slides; D-The electrospinning raw scaffolds which was split into around 25 mm×25 mm pieces fitting to cover on slides and fix with UV glue; F-Sterilized finished devices)

1.2方法

1.2.1不同取向度靜電紡絲纖維支架力學(xué)測試

將兩組材料切成30 mm×30 mm的多個試樣，測量平均厚度，然后在材料拉伸試驗機上測定載荷與伸長。其中，取向纖維材料沿兩個方向測量，夾具分別固定在取向方向(Y軸)和垂直取向方向(Z軸)上；無序纖維材料以隨機方向測量，且通過試樣中心的軸線測量。這樣，得到力-伸長曲線及有關(guān)力學(xué)指標(biāo)，每種材料各測定5塊試樣，取其平均值。夾持部分的長度為每邊5 mm，拉伸速度為5 mm/min，記錄被測支架斷裂前的受力動態(tài)變化，參數(shù)主要包括最大力(N)、最大力點的位移(mm)、拉伸強度(MPa)、最大力伸長率(%)、斷裂伸長率(%)等，并通過軟件計算拉伸強度和楊氏模量。

1.2.2取向靜電紡絲纖維對BMSCs增殖力的影響

人骨髓來自健康獻髓者，獻髓者事先已簽署知情同意書。將采集到的抗凝骨髓用密度梯度離心法，分離骨髓中的單個核細(xì)胞。運用差速貼壁法純化細(xì)胞，4～5 d傳代一次。收集4～6代BMSCs調(diào)整濃度2×105個/mL，分布接種于鋪有實驗組和對照組材料的24孔板中，每組復(fù)設(shè)4孔。分別于24、48、72、96、120 h棄培養(yǎng)液，每孔加入L-DMEM培養(yǎng)基200 μL、5 mg/mL MTT染液200 μL，孵育4 d后棄上清，加入DMSO 200 μL，振蕩溶解15 min，于酶標(biāo)儀上測定570 nm處的光密度(OD)值，并設(shè)參考波長650 nm。細(xì)胞數(shù)量以吸光度單位來表示。

1.2.3矢量化細(xì)胞遷移軌跡捕捉

靜電紡絲纖維膜根據(jù)取向度分為兩組，分別包裹于20 mm×20 mm 方形玻片上，隨后鑲嵌于打好孔的培養(yǎng)皿底部，以便于觀察細(xì)胞在纖維界面的長期活動(器械組裝方式見圖1)。培養(yǎng)皿通過環(huán)氧乙烷消毒，并提前浸泡于培養(yǎng)液中脫毒24 h。間充質(zhì)干細(xì)胞以中等密度接種于纖維表面上(2×105個/孔)，經(jīng)過 16～24 h 的預(yù)培養(yǎng)，將該培養(yǎng)裝置轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞工作站條件中(37℃恒溫、5% CO2飽和濕度)。通過DIC模式拍攝細(xì)胞動態(tài)照片，采取30 min的間隔觀察24 h內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)變化。照片通過ImageJ軟件分析，捕捉細(xì)胞運動軌跡。細(xì)胞的遷徙路徑和參數(shù)通過軟件自動計算，以得出細(xì)胞在不同材料和不同時間點的運動數(shù)據(jù)來做進一步的比較。

1.2.4細(xì)胞骨架標(biāo)記

間充質(zhì)干細(xì)胞通過前述方法接種于24孔板中。由于細(xì)胞間接觸抑制可干擾細(xì)胞的形態(tài)，本實驗中細(xì)胞以較低的密度植入(2×104/孔)，以減少細(xì)胞接觸所導(dǎo)致的細(xì)胞骨架異常。將細(xì)胞爬片在接種間充質(zhì)干細(xì)胞前分別包被以各組材料(取向纖維/非取向纖維/蠶絲蛋白涂層)，并設(shè)置4個重復(fù)孔。在共培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞爬片經(jīng)PBS沖洗和2.5%多聚甲醛固定10 min。 肌動蛋白通過488 nm熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton公司， 美國)進行特異性的標(biāo)記，細(xì)胞核則通過DAPI染料予以復(fù)染 (Sigma, 英國)。所有熒光染色樣品采用熒光顯微鏡(Zeiss Axio Imager, Zeiss, 英國)加以觀察并拍照。

1.2.5數(shù)據(jù)分析與處理

細(xì)胞定量移動速度以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進行表示，組間均數(shù)的顯著性比較采用單向方差分析 (One-way ANOVA)計算。為了保證實驗的可重復(fù)性，材料形貌分析采用全區(qū)域的自動分析取樣，避免人工取樣的偏差。4個隨機區(qū)域被選擇作為細(xì)胞遷移的觀察區(qū)。當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為t檢驗有顯著性；而P<0.0005時，認(rèn)為單向方差分析有顯著性。不同材料的表面纖維分布情況通過 ImageJ作傅里葉分量分析，以量化為取向度指標(biāo)。圖表通過Excel 繪制。

2 結(jié)果

2.1取向靜電紡絲纖維支架的制備與形態(tài)分布

通過調(diào)節(jié)接收電極的旋轉(zhuǎn)速度，成功使用蠶絲蛋白制備了不同取向度的靜電紡絲纖維膜。在較低轉(zhuǎn)速條件下，可制得非取向纖維表面，反之則可得到取向纖維表面。

在電鏡下可見兩種材料表面纖維分布得較為均勻，相關(guān)形貌可見圖3。通過較高的接收電極旋轉(zhuǎn)速度可以獲得理想的取向纖維，當(dāng)轉(zhuǎn)速為2 000 r/min時，約91%的纖維分布于主要纖維走向上；然而當(dāng)轉(zhuǎn)速較低(500 r/min)時，纖維分布于主導(dǎo)方向的僅有14%。進一步分析可知，取向纖維表面的所有纖維取向分布于一個較窄的區(qū)間中，提示該方法取得的蠶絲蛋白取向纖維均一度較高。

2.2靜電紡絲蠶絲蛋白膜力學(xué)性能測定

通過材料拉伸試驗機測定取向、非取向納米蠶絲蛋白力學(xué)性能指標(biāo)，應(yīng)力應(yīng)變曲線見圖4。取向蠶絲纖維軸向方向的最大力大于徑向方向，最大力伸長率小于徑向方向及非取向材料；楊氏模量大于徑向方向及非取向材料。

MTT法測量細(xì)胞的增殖速率的結(jié)果顯示在1、2、3、4、5 d各檢測時間點，在納米纖維材料表面，BMSCs細(xì)胞均可快速增殖。從第4 d開始，取向納米蠶絲蛋白組細(xì)胞增殖力明顯高于亂序納米蠶絲蛋白組(P<0.05，見圖5)。

2.3取向納米纖維結(jié)構(gòu)促進BMSCs的增殖

2.4矢量化細(xì)胞遷移軌跡捕捉

在較低密度接種細(xì)胞后，細(xì)胞移動主要受材料表面結(jié)構(gòu)的影響，減少了接觸抑制對細(xì)胞遷移的影響。在貼壁過程的初期，不同形貌的纖維表面對初始貼壁過程無顯著影響。

然而在12～24 h貼壁之后，細(xì)胞的黏附和活動功能趨于平穩(wěn)，在此階段，細(xì)胞的行為在不同材料表面呈現(xiàn)出一定的區(qū)別。通過把不同時間點細(xì)胞的活動距離作為二位矢量來分析，可以得出細(xì)胞的移動速度和移動方向數(shù)據(jù)。經(jīng)測算，細(xì)胞在取向纖維表面、非取向纖維表面和涂層表面的移動速度分別為7.17、7.16、6.90 μm/h。結(jié)果提示，纖維構(gòu)造的表面更好地促進了細(xì)胞的移動，但差異無顯著性。

進一步分解細(xì)胞的位移后發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞的主要移動方向上，取向納米纖維表面的細(xì)胞分解移動速度達6.66 μm/h，遠遠高于其他表面(分別為4.63和 4.34 μm/h，P<0.05)。此結(jié)果提示，細(xì)胞和其基質(zhì)的互動可以引起細(xì)胞伸展方向改變，進而使細(xì)胞的移動方向和速度產(chǎn)生差異。

圖3 取向靜電紡絲纖維、非取向纖維的排列。(a) 取向纖維表面, 比例尺為 100 μm； (b) 非取向纖維表面, 比例尺為 50 μm； (c) 取向纖維表面的纖維排列角度集中于峰值附近； (d) 非取向納米分布呈各向同性 Fig.3 Fiber alignments of aligned and non-oriented scaffolds. (a) Aligned scaffold, scale bar indicates 100 μm; (b) Non-oriented scaffold, scale bar indicates 50 μm; (c) Directionality histograms of aligned scaffold; (d) Directionality histograms of non-oriented scaffold

圖4 兩種蠶絲蛋白膜的應(yīng)力曲線Fig.4 The typical tensile stress/strain curves of electrospinning SF/PCL aligned and non-oriented scaffolds

圖5 BMSCs在不同材料表面的增殖曲線(圖中星號表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05)。Fig.5 The proliferation rate of BMSCs on different scaffolds (The asterisk means the statistical significance P<0.05).

圖6 各組細(xì)胞在正交坐標(biāo)系x和y軸上的移動速度, 設(shè)纖維取向方向為x軸，則總速度為v，細(xì)胞沿x軸移動的速度向量為vx，而垂直于纖維方向的速度向量為vy(*表示P<0.05)Fig.6 Cell migration velocity in two directions under different topographical cues. Cell migration velocity on the aligned direction(vx), perpendicular direction (vy) and universal velocity (v) were shown (*P<0.05)

2.5細(xì)胞骨架的觀察

染色后，通過軟件得出了細(xì)胞的長度，以及各組視野中細(xì)胞的延伸方向與材料界面上纖維的平均分布方向，并計算出其夾角。通過計算，在取向納米纖維材料表面生長的間充質(zhì)干細(xì)胞展現(xiàn)出最小的細(xì)胞分布夾角，僅為 6.57° ± 4.45°，顯著低于另外兩組(分別與非取向納米纖維表面為36.68° ± 26.42°，和在涂層表面的45.86° ± 25.61°)。同時，取向納米纖維表面的細(xì)胞長度有顯著提高((236.46±82.00)μm)，說明取向蠶絲蛋白納米纖維可以有效地刺激細(xì)胞在特定方向上延展和運動。在標(biāo)記出細(xì)胞骨架后，可見取向納米纖維表面的細(xì)胞骨架沿纖維分布方向重新排列，而其他兩組材料的細(xì)胞骨架呈彌散性分布，不具有定向分布的特點(見圖7)。

圖7 細(xì)胞的骨架分布。(a) 取向納米纖維組; (b) 非取向納米纖維組; (c) 涂層表面組(圖中可見肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架(綠色)，圍繞細(xì)胞的SF/PCL 納米纖維 (綠色)，以及細(xì)胞核(藍色); 較低的細(xì)胞定植密度使得細(xì)胞可以任意鋪展，表現(xiàn)出分布的傾向性); (d)和(e)細(xì)胞長度 (μm) 與細(xì)胞分布方向與纖維走向的夾角比較(*P<0.05)Fig.7 Immunofluorescent assay of cytoskeletons. (a) Aligned scaffolds; (b) Non-oriented scaffolds; (c) Spin-coated surfaces (The actin of cytoskeleton (green), the SF/PCL fiber (green), cell nucleus (blue) were shown. The low implant density enabled free cell movement, which shows the distributional tendentiousness); (d) and (e) The cell length (μm) and cell distribution angle was compared (*P<0.05)

3 討論

蠶絲蛋白作為一種天然的材料廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，如藥物釋放和植入物設(shè)計。其生物相容性好[19-20]、可生物降解[21]，且具有較低的炎癥反應(yīng)[22]。然而，純蠶絲蛋白的靜電紡絲纖維力學(xué)性能差，制約了其應(yīng)用?；诖?，本研究通過蠶絲蛋白與PCL的共混紡絲，很好地提高了共混納米纖維產(chǎn)物的延展性，從而進一步在紡絲過程的電極高速轉(zhuǎn)動中形成連續(xù)取向的長纖維，因此制備了取向度更高的材料：91%的纖維分布于10°范圍以內(nèi)的靜電紡絲纖維骨修復(fù)材料。

用于骨科的植入材料需要具有一定的剛性及韌性。蠶絲蛋白雖然具有生物相容性好、體內(nèi)可降解、易塑形等優(yōu)點，但是其剛性及韌性較差，不能滿足骨科植入材料的需要。本研究通過共混PCL進行靜電紡絲的方法，提高了靜電紡絲產(chǎn)物纖維的延展性，進而通過旋轉(zhuǎn)電極法提高了靜電紡絲支架的取向性，因而在力學(xué)性質(zhì)上也體現(xiàn)了各向異性。軸向上的高剛度，可增加骨折斷端固定的穩(wěn)定性；而徑向上一定的彈性，也提供了骨折斷端微動的可能。在拉伸實驗中，取向靜電紡絲纖維的取向方向載荷達到最大后逐漸下降，并非迅速斷裂，反映了纖維間有一定的纏繞以及材料的厚度不均勻現(xiàn)象。力學(xué)實驗結(jié)果也從另一個方面提示，在纖維支架材料取向度提高的同時，材料徑向剛度降低，因此有必要進一步研究纖維的取向度實用范圍乃至不同取向度材料的復(fù)合應(yīng)用。

通過基質(zhì)材料表面結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞的定向移動，在組織工程學(xué)中有重大意義。其意義主要體現(xiàn)在組織修復(fù)的過程中，最先發(fā)生細(xì)胞的召集和向病灶中心的聚集，因此通過形態(tài)學(xué)的手段增加材料界面的生物活性，加速細(xì)胞向病灶轉(zhuǎn)移，將有望加速愈合的整體過程，縮短缺損組織的重建時間[15]。通過材料表面的物質(zhì)濃度變化[16]，取向排列的溝槽結(jié)構(gòu)[17]和平行排列的纖維結(jié)構(gòu)均可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞等定向移動。

多種可降解材料以及天然材料都成功通過靜電紡絲的手段制備出來，而取向纖維材料尤其引人矚目[18]。 Lee等采用PLLA的HFIF溶液，制備了約80%取向的靜電紡絲纖維材料，用于體內(nèi)和體外的骨缺損修復(fù)[23]；Chang等通過PCL的四氫呋喃溶液，制備了具有平行方向和垂直方向兩種構(gòu)型的表面材料，并在體外研究了間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)答機理[24]。這些研究均認(rèn)為，提高材料表面纖維的取向度，對加快細(xì)胞的遷移速度有利。

在刺激細(xì)胞移動的過程中，如何不影響細(xì)胞的活力、不抑制細(xì)胞的功能是一大挑戰(zhàn)。通過單純改變表面的形態(tài)，從光滑表面變?yōu)榫哂衅叫欣w維結(jié)構(gòu)的表面，可以提供刺激細(xì)胞定向移動的平臺。多個研究采用不同材料，構(gòu)建了取向纖維的結(jié)構(gòu)，并觀察到相似現(xiàn)象。其中，Lee等觀察到BMSC細(xì)胞在纖維走向上的移動速度是垂直纖維方向的10.46倍之多[23]，但由于該研究使用PLLA材料，且有98.0%的纖維處于10°的范圍以內(nèi)，故可以推測這種細(xì)胞運動的差異可能由材料的優(yōu)異性能所致。而Chang等的研究中不僅觀察到細(xì)胞的分布區(qū)別，而且首次指出了這種細(xì)胞的排布可能加速了細(xì)胞間交流(cell-cell communication),導(dǎo)致細(xì)胞可以沿纖維取向的方向更快地傳遞信號物質(zhì)[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，取向纖維材料表面生長的間充質(zhì)干細(xì)胞展現(xiàn)出最小的細(xì)胞分布夾角，僅為 6.57° ± 4.45°，顯著低于非取向表面，這與其他研究一致；本研究還發(fā)現(xiàn)，取向纖維表面的細(xì)胞長度有顯著提高(236.46±82.00) μm，細(xì)胞沿纖維走向方向的移動速度約是垂直纖維方向的4倍。

人體骨骼組織中的膠原蛋白呈高度取向的束狀分布，構(gòu)成哈弗森系統(tǒng)，因此靜電紡絲取向纖維系統(tǒng)需要從結(jié)構(gòu)上最大程度地模擬體內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞的遷移環(huán)境[26]。早在2009年，就有研究著眼于此種取向纖維的結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞取向的影響，并認(rèn)為是纖維走向上的張力大導(dǎo)致細(xì)胞在此方向上的細(xì)胞骨架重塑。本研究驗證了這種平行排列的纖維表面確實能引起細(xì)胞內(nèi)骨架的重塑，進而導(dǎo)致細(xì)胞的伸長和定向移動，這與同類研究的結(jié)果[23-24]相似，因而提示Actin信號通路可能對此過程有重要影響。同時，Chang等發(fā)現(xiàn)，取向纖維構(gòu)成的表面上細(xì)胞表達的黏著斑蛋白較少，因此有助于細(xì)胞的快速移動，這和本研究發(fā)現(xiàn)的肌動蛋白的豐富表達屬于協(xié)同過程。

4 結(jié)論

取向蠶絲蛋白靜電紡絲支架可以支持MSC細(xì)胞增殖，在體外具有力學(xué)各向異性和引導(dǎo)細(xì)胞沿纖維排列方向運動的能力。該變化可能與Actin通路的調(diào)控有關(guān)，并能觀察到細(xì)胞骨架的重排。然而在其體內(nèi)應(yīng)用后，能否加速骨創(chuàng)傷病灶處成骨細(xì)胞的運動，仍需進一步的實驗研究。

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The Mechanical Property and Human Mesenchymal Stem Cell Induction of Aligned and Random Electrospinning Fibrous Silk Fibroin Scaffolds

Yuan Han1Zheng Xin2Qiu Xushen2Chen Yixin2*

1(Drum Tower Clinical College of Integrative Medicine, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)2(Department of Orthopedic Surgery, Drum Tower Hospital, Nanjing University, Nanjing 210008, China)

Due to its mechanical strength, biocompatibility and sterilizability, silk fibroin is frequently utilized as a natural bone-regeneration material. To improve its mechanical character and reinforce cell movement induction, a highly aligned electrospinning fibrous scaffold of PCL/silk fibroin blend was fabricated with a rotating collector. Scanning electron microscope images were analyzed and mechanical properties of the scaffold were investigated by tensile mechanical tests, and compared to non-oriented scaffolds. Furthermore, mesenchymal stem cells were planted on the scaffolds to investigate its biocompatibility and cell movement in-situ. Results shows that 91% fibers on the aligned fibroin scaffold were distributed between the dominant direction +/-10°. With ideal support for stem cell proliferation, the aligned fibrous scaffold could also induce cell elongation at a length of 236.46±82 μm and distribution along the dominant fiber direction with a narrow spreading angle at 6.57±4.45 °. In conclusion, this novel aligned fibroin scaffold could provide a moderate mesenchymal stem cell engraftment interface and speed-up the early stage cell movement toward the bone defect.

electrospinning; silk fibroin; mesenchymal stem cell; aligned fibrous scaffold; cell movement

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.011

2014-06-11， 錄用日期:2015-04-20

江蘇省六大人才高峰項目(2012-WS-092)；南京市衛(wèi)生局項目(YKK13079，ZKX12016)

R318

A

0258-8021(2015) 03-0337-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail：chenyixin93@126.com