液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定不同貯存期黃芩中6種黃酮類化合物含量*

徐楊璐，趙勝男，劉素麗，李守拙

(承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德 067000)

黃芩主產(chǎn)于河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古等地，是我國(guó)常用中藥材之一，已有悠久的用藥歷史。該藥為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，其性苦味寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1]。品種、產(chǎn)地、采收期及貯存期等條件不同導(dǎo)致中藥材質(zhì)量產(chǎn)生差異，影響其制劑質(zhì)量穩(wěn)定性。已有文獻(xiàn)對(duì)不同品種、產(chǎn)地、采收期黃芩中的主要成分進(jìn)行了研究[2-5]，但不同貯存期對(duì)黃芩藥材的化學(xué)組分及其質(zhì)量有無影響，筆者尚未見報(bào)道，也沒有針對(duì)黃芩貯存時(shí)間相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致保存多年的黃芩藥材還在市場(chǎng)上流通。這些藥材可能因?yàn)橄x蛀、變色、霉變等，使藥材中的化學(xué)成分比例或者成分種類產(chǎn)生變化，使藥材品質(zhì)降低，影響其安全性和有效性。因此應(yīng)科學(xué)有效地控制藥材貯存期，保證得到效果好、質(zhì)量高的中藥材。筆者采用目前廣泛應(yīng)用的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[6-11]對(duì)不同貯存期黃芩進(jìn)行研究，以黃芩中6種黃酮類化合物作為含量測(cè)定指標(biāo)，分別考察了貯存 0，1，3，6，12，18，24個(gè)月其含量變化情況及其穩(wěn)定性，以期全面有效合理地評(píng)價(jià)并控制不同貯存期黃芩的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6310系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司):6310質(zhì)譜儀，1100 Series高效液相色譜儀;HC-2062高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);Mettler AG245分析天平(梅特勒-托利多有限公司，十萬分之一天平);KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品黃芩苷(批號(hào):715-9506，含量 ＞98%)、黃芩素(批號(hào):111595-200604，含量 ＞98%)、漢黃芩素(批號(hào):111514-200403，含量＞98%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，漢黃芩苷(批號(hào):20090319，含量 ＞98%)、白楊素(批號(hào):090518，含量 ＞98%)、千層紙素A(批號(hào):20091124，含量＞98%)均購(gòu)自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈(Fisher Scientific公司)為色譜純;甲酸、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

黃芩樣品采自河北省承德地區(qū)，藥材產(chǎn)地由課題組人員親自考察，藥材由中國(guó)科學(xué)院植物研究所系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周世良研究員鑒定為正品黃芩。將藥材采用完全隨機(jī)分組法分成7批，置于室溫條件下，分別于0，1，3，6，12，18，24 個(gè)月取樣測(cè)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS)條件

2.1.1 LC條件 色譜柱為 Agilent Zorbax XDB-C18柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm);流量0.2 mL·min－1;進(jìn)樣量2 μL;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm;流動(dòng)相為0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，平衡時(shí)間為 10 min，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～10 min，18%→20%B;→18 min，20% →25%B;～30 min，25% →30%B;～40 min，30%→40%B;～60 min;40%→60%B。

2.1.2 MS 條件 離子源:電噴霧離子(electrospray ionization，ESI)源;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式;采用正離子模式檢測(cè);電噴霧電壓3 500 V，霧化氣體為氮?dú)猓F化氣壓力25 psi;干燥氣體為氮?dú)?，干燥氣體積流量10 L·min－1;離子源溫度350℃;碰撞氣體為高純氦氣。6種成分的MS參數(shù)見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素對(duì)照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取混合對(duì)照品貯備液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素濃度分別為 1 772，465，52，104，8，8 μg混合對(duì)照品溶液。

表1 6種成分的MS參數(shù)Tab.1 MS parameters of six ingredients

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取黃芩粉末約0.25 g，置平底圓底燒瓶中，精密加入溶劑(水∶乙醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸=50∶49∶5∶1)25 mL，稱定，加熱回流90 min，靜置放冷，再次稱重，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，12 000 r·min－1(r=5.5 cm)離心10 min，取上清液過孔徑0.45 μm微孔濾膜稀釋10倍，作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取不同體積混合對(duì)照品溶液，用甲醇定量稀釋，制得7種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按上述LC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表2。

表2 6種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Linear relations of six ingredients

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液適量，按上述LC-MS條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的 RSD 分別為 1.8%，2.4%，0.94%，1.1%，2.0%，1.2%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一份黃芩樣品0.25 g，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按上述LC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的含量。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素含量的平均值分別為 8.19%，0.52%，1.84%，0.51%，0.04%，0.05%，RSD 分別為 2.3%，1.5%，1.7%，1.3%，2.5%，1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的 RSD 分別為 1.86%，2.23%，1.67%，2.14%，1.95%，2.68%。表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一黃芩樣品0.125 g，共6份，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品貯備液，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，照上述LC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.8 樣品含量測(cè)定 取各貯存期的黃芩樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，照上述LC-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算各樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素的含量，結(jié)果見表4。

2.9 結(jié)果 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黃芩苷在貯存1個(gè)月含量明顯下降，貯存1～3個(gè)月含量略呈上升趨勢(shì)，貯存3～18個(gè)月含量變化不大;漢黃芩苷貯存1個(gè)月內(nèi)含量明顯下降，貯存1～6個(gè)月含量穩(wěn)定，貯存6～18個(gè)月含量略呈下降趨勢(shì);黃芩素貯存0～3個(gè)月含量下降，貯存3～6個(gè)月含量上升，貯存6～18個(gè)月含量略呈下降趨勢(shì);漢黃芩素貯存0～3個(gè)月含量下降，貯存3～18個(gè)月含量不穩(wěn)定，但變化不大;白楊素和千層紙素在黃芩中的含量很低，貯存0～18個(gè)月整體含量變化不大。

3 討論

黃酮類成分中含有酚羥基，如果采用中性流動(dòng)相會(huì)有拖尾現(xiàn)象，尤其是黃芩苷，因此需在流動(dòng)相中加入少量酸抑制其拖尾現(xiàn)象，筆者在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，峰形得到很好改善。黃酮苷元類化合物在正負(fù)離子模式都有高靈敏度的響應(yīng)，但正離子模式一般稍好于負(fù)離子模式[12]。因此測(cè)定黃芩中的黃酮類成分采用正離子模式。

中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，要體現(xiàn)其多組分、多層次、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)初步研究貯存18個(gè)月的黃芩中6個(gè)黃酮類化合物含量變化情況，從結(jié)果中可以看出貯存前3個(gè)月黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素含量整體呈下降趨勢(shì)，4～18個(gè)月它們含量變化都不明顯。筆者將繼續(xù)跟蹤貯存24個(gè)月后黃芩中6種黃酮類化合物的含量變化，以確定黃芩中主要成分含量明顯變化的時(shí)間，同時(shí)采用植物遺傳(DNA)分析、紅外光譜分析、植物代謝組學(xué)分析等技術(shù)對(duì)黃芩藥材中的化學(xué)組分進(jìn)行分析，不斷完善黃芩的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外，中藥材的質(zhì)量好壞應(yīng)該以其臨床療效為最終的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，不一定含量高療效就好，此實(shí)驗(yàn)也為揭示臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)與療效之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

表3 6種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests of six ingredients n=6

表4 不同貯存期黃芩中6種成分的含量Tab.4 Contentsofsix ingredientsin Scutellaria baicalensis Georgi with different storage period %

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