連翹配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜

梁俊，黃良永，楊光義

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000)

連翹為木犀科植物連翹[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]的干燥果實，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效。用于癰疽，瘰疬，乳癰，丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初起，溫?zé)崛霠I，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋澀痛[1]。主要含有揮發(fā)性成分、苯乙醇苷類、木脂素類和三萜類物質(zhì)[2]，以連翹酯苷A和連翹苷的含量較高?，F(xiàn)代研究表明，連翹酯苷A 對認(rèn)知障礙及短暫性腦缺血的神經(jīng)具有保護(hù)作用，故具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙、舒張血管、抗氧化、抗菌、抗感染、解熱、抗DNA損傷、防護(hù)耳毒性等藥理作用[3]。連翹配方顆粒是以連翹為原料，經(jīng)水提取、濃縮、噴霧干燥而制成的顆粒，有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜(HPLC)法測定連翹配方顆粒中連翹苷含量[4-5]，但還沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。筆者應(yīng)用HPLC-梯度洗脫法，建立了連翹配方顆粒的HPLC指紋圖譜，以便為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DGLC雙三元高效液相色譜儀(美國Thermo公司，雙三元梯度泵、WPS3000自動進(jìn)樣器、AccelaPDA二極管陣列檢測器、TCC柱溫箱);Chromeleon色譜工作站;Waters SunFire C18色譜柱(美國 WATERS 公司，4.6 mm ×150 mm，5 μm);520H 超聲清洗機(jī)(南京熊貓電子集團(tuán)，250 W，40 kHz);AUW120D電子分析天平(日本島津公司，感量:十萬分之一)。

1.2 試藥 甲醇為色譜純(美國賽默飛公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。連翹酯苷A對照品(批號:111810-201304，含量:94.3%)、連翹苷對照品(批號:110821-200711，含量:98.9%)均由中國食品藥品檢定研究院提供。連翹配方顆粒(廣東深圳某醫(yī)藥股份公司生產(chǎn)，每袋1 g，相當(dāng)于連翹藥材10 g，批號:10041002S-S1、1011001S-S2、1103001S-S3、1105002SS4、 1107003S-S5、 1110001S-S6、 1203001S-S7、1302002S-S8、1307003S-S9、1311001S-S10)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相 A 為乙腈，流動相B為0.4%醋酸溶液，按表1程序進(jìn)行線性梯度洗脫;流速:1.0 mL·min－1。柱溫:30 ℃;檢測波長:277 nm;進(jìn)樣 10 μL[1]。

表1 流動相線性梯度表Tab.1 Linear gradient table of mobile phase %

2.1.2 樣品溶液的制備 混合對照品溶液的制備:精密稱取連翹酯苷A對照品21.70 mg，置25 mL棕色量瓶，加甲醇溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得儲備液(每毫升含連翹酯苷A 868.0 μg);另精密稱取連翹苷對照品20.60 mg置50 mL棕色量瓶，加甲醇溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻;即貯備液(含連翹苷412.0 μg)。再分別精密量取連翹酯苷A和連翹苷貯備液2.5 mL和0.5 mL置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，即得混合對照品溶液(每毫升含連翹酯苷 A217.0 μg，連翹苷 20.60 μg)。

供試品溶液的制備:取連翹配方顆粒研碎，過五號篩，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶，精密加入70%甲醇溶液15 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 系統(tǒng)適用性實驗 精密取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.1.1”項色譜條件下，連翹配方顆粒的供試品溶液在對照品色譜相同的位置有連翹酯苷A和連翹苷的峰，二成分峰與其相鄰峰完全分離，理論板數(shù)以連翹酯苷A峰計均＞18 000。二成分峰純度經(jīng)PDA檢測器掃描對比符合度99.7%，說明和對照品的峰完全一致。結(jié)果見色譜圖1。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實驗 取同一供試品溶液(批號:1311001S-S10)，按“2.1.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 5 次，每次10 μL，記錄色譜圖，測定主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果主要共有峰13個，1～13號峰相對保留時間的RSD均＜0.10%，相對峰面積的RSD均＜0.44%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度好。

2.2.2 重復(fù)性實驗 取同一樣品(批號:1311001SS10)6份，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項方法進(jìn)樣測定并分別測定其色譜圖，結(jié)果其相對保留時間穩(wěn)定，主要共有峰1～13號峰相對保留時間RSD＜0.15%，相對峰面積RSD均＜0.90%，說明本方法重復(fù)性較好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品(批號:1311001SS10)溶液在0，4，12，24 h 分別按“2.1.1”項方法進(jìn)樣測定并分別記錄其色譜圖，測定主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果主要共有峰13個，1～13號峰相對保留時間RSD均＜0.10%，相對峰面積RSD均＜0.48%，結(jié)果表明供試品溶液室溫下0～24 h內(nèi)成分保持穩(wěn)定，能滿足指紋圖譜要求。

2.3 已知成分的鑒別和參比峰的確認(rèn) 供試品溶液和對照品溶液在“2.1.1”項色譜條件下得到的色譜圖，通過色譜峰的保留時間和二極管陣列檢測器的符合度檢查比對，對指紋圖譜中相應(yīng)色譜峰進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果顯示6號峰為連翹酯苷A;10號峰為連翹苷。其中6號連翹酯苷A峰的保留時間居中，峰面積值較大且穩(wěn)定，所以選擇6號峰為參比峰(圖2)。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度評價 取10批連翹配方顆粒樣品，分別按“2.1.2”項供試品的制備方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下，測定其色譜圖。

利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)軟件，采用自動匹配法生成共有模式對照圖譜R并分析各樣品之間共有峰和相似度，確定共有峰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批供試品共有13個共有峰，見圖2和圖3。各特征圖譜與共有模式對照圖譜R相似度見表2。以選定的6號峰連翹酯苷A峰為參比峰，設(shè)定其相對保留時間和峰面積為1，計算各共有峰相對它的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3和表4。

3 討論

圖3 10批樣品的HPLC指紋圖譜相似度比較Fig.3 Similarity comparison of HPLC fingerprints among ten batches of samples

在篩選色譜條件時，流動相采用《中華人民共和國藥典》2010年版連翹項下的含量測定方法，需要使用兩個色譜條件分別測定連翹酯苷A和連翹苷的含量，對于HPLC指紋圖譜的測定不太適應(yīng);筆者在本實驗中采用乙腈-0.4%醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，流動相極性由大到小，使連翹酯苷A和連翹苷與其相鄰色譜峰完全分離，可準(zhǔn)確測定二成分的含量，取得滿意結(jié)果。

建立樣品的制備方法時，用不同比例的甲醇溶液(20%，40%，50%，70%，100%)直接超聲提取，經(jīng)過比較，采用《中華人民共和國藥典》2010年版的方法，用70%乙醇溶液超聲提取，兩成分的回收率和重復(fù)性最好。

實驗中發(fā)現(xiàn)，10批樣品的HPLC指紋圖譜中，13個共有峰的相似度均＞0.999，說明連翹配方顆粒的HPLC指紋圖譜穩(wěn)定可靠;各批號樣品間13個共有指紋峰的相對保留時間比較吻合(RSD＜0.31%);相對峰面積波動較小(RSD＜10%)，說明該公司生產(chǎn)的不同批次顆粒的成分含量差異較小，生產(chǎn)顆粒的原藥材來源一致，質(zhì)量穩(wěn)定。實驗結(jié)果表明，利用HPLC色譜指紋圖譜來控制連翹配方顆粒的質(zhì)量切實可行，該法為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了可行方法。

表2 樣品特征圖譜與共有模式對照圖譜R的相似度Tab.2 Similarity between characteristic chromatogram and reference chromatogram R of mutual mode

表3 HPLC指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab.3 Relative retention time of common peaks of HPLC fingerprints

表4 特征圖譜共有峰相對峰面積Tab.4 Relative peak area of common peaks of characteristic chromatogram

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:159.

[2]孟祥樂，李俊平，李丹，等.連翹的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21(43):4117 －4118.

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[4]黃蓓蓓，賀帥.微乳液相色譜法同時測定注射用雙黃連凍干粉中三組分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(1):92 －95.

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