Effect of Acupuncture on the Expression of NOS in Gastrointestinal Tissues after Abdominal Operation in Rats

ZHENG Fang, LI Ping, MENG Fan-zheng, ZHAO Jin-sheng.

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針刺對(duì)大鼠腹部術(shù)后胃腸組織中NOS表達(dá)的影響

鄭方1,李平2,孟凡征3,趙金生3

(1.西安市按摩醫(yī)院,陜西 710015;2.天津市第三中心醫(yī)院,天津 300170;3.天津市南開醫(yī)院,天津 300100)

目的 觀察針刺對(duì)不全性腸梗阻大鼠術(shù)后胃腸組織中一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)的影響,探討針刺治療促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂恢復(fù)的機(jī)制。方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為治療1組、治療2組、模型1組、模型2組和空白組,每組8只。治療組和模型組均采用絲線單純結(jié)扎法造成不完全性腸梗阻模型。治療組造模后采用針刺足三里和陽陵泉治療,其中治療1組和治療2組分別治療1、2 d后解剖及取材。模型1組和模型2組分別于造模1、2 d后解剖及取材。對(duì)大鼠腸組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并比較各組腸梗阻上段腸管平均周徑和胃腸組織標(biāo)本中NOS含量變化。結(jié)果 模型組大鼠造模后回盲部腸管周徑與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。模型2組回盲部腸管周徑與模型1組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療組治療后回盲部腸管周徑與模型組和治療2組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療2組回盲部腸管周徑與空白組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組腸NOS含量與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療1組治療后腸NOS含量與模型組和治療2組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。各組腸NOS含量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＞0.05)。結(jié)論 針刺可以通過調(diào)節(jié)腸組織中NOS含量變化的途徑,促進(jìn)不全性腸梗阻術(shù)后大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

針刺療法;腸梗阻,不完全性;一氧化氮合酶;大鼠

胃腸功能紊亂是一組以消化道癥狀為主的臨床綜合征,其主要臨床表現(xiàn)有腹痛、腹脹、食欲不振、惡心、嘔吐、反酸、噯氣、便秘等[1]。它是胃腸、膽道系統(tǒng)和婦產(chǎn)科疾病開放腹腔術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn),針刺治療可以縮短患者的腸蠕動(dòng)恢復(fù)時(shí)間、首次排氣時(shí)間和首次排便時(shí)間[3]。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年來研究的新熱點(diǎn),它以左旋精氨酸為底物由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化生成,與胃腸道生理病理有著密切的關(guān)系。本研究旨在觀察大鼠胃和腸組織中NOS含量的變化,來反映針刺是如何通過NO機(jī)制促進(jìn)術(shù)后胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

40只清潔級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體重(250±20) g,由天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)[SCXK-(軍)2009-003]。采用查隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為治療1組、治療2組、模型1組、模型2組和模型組,每組8只。5組大鼠性別、體重分別采用卡方檢驗(yàn)和單因素方差分析,基線均衡(＞0.05),具有可比性。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

10%水合氯醛(武漢吉和昌化工科技有限公司提供),大鼠一氧化氮合成酶 ELISA 試劑盒(E02N0092,上海藍(lán)基生物科技有限公司提供),考馬斯亮藍(lán) G250 蛋白快速染色液(南京建成生物工程研究所提供,生產(chǎn)批號(hào)20140214)。

1.2.2 主要儀器

電子秤(Libro);酶標(biāo)儀(KHB-ST -360);孵育箱(上海醫(yī)療器械七廠);洗板機(jī)(Ray to RT3000);勻漿機(jī)(天津奧佳科技公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

采用絲線單純結(jié)扎法[4]制備不全性腸梗阻大鼠模型。術(shù)前禁食12 h,自由飲水,10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,取仰臥位將其固定于大鼠手術(shù)板上,局部消毒備皮后,于大鼠腹白線左側(cè)1 cm處作一長度約2 cm的皮膚切口,逐層分離打開腹腔,用無損傷組織鑷輕輕將回盲部提出放于無菌紗布上,用帶7號(hào)絲線的圓針避開血管穿透腸系膜,在距回盲部3～5 cm處,將回腸腸管和與之并排放置的中心靜脈導(dǎo)管一并結(jié)扎,然后輕輕將中心靜脈導(dǎo)管抽出,腸管還納回腹腔原位,用連續(xù)縫合法縫合腹膜及肌層,再用間斷縫合法縫合大鼠皮膚,逐層消毒關(guān)閉腹腔。清理傷口后放入籠中。

1.3.2 治療方法

穴位參照李平教授“通腹降氣”針方[3],取大鼠足三里和陽陵泉穴,定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]。造模結(jié)束后大鼠清醒即開始針刺治療。兩人配合操作,一人用手抓取活體大鼠以固定,另一人做每秒5次的快頻率提插手法操作,持續(xù)時(shí)間為1 min,每日治療2次。治療1組和治療2組分別治療1、2 d。

1.3.3 觀察指標(biāo)

治療結(jié)束后麻醉大鼠,開放腹腔,取出距手術(shù)梗阻部位以上3～5 cm腸管,將其縱行剖開,平放于濾紙上,取上中下3個(gè)位置測量標(biāo)本腸管周徑,并計(jì)算出平均周徑值,觀察大鼠腸管形態(tài)學(xué)變化;并取胃、腸組織勻漿后上清液,用大鼠NOS試劑盒檢測出 OD 值,根據(jù)OD值推算出樣品的實(shí)際濃度,除以樣本中蛋白定量的結(jié)果,再進(jìn)一步推算出每克蛋白中含有NOS的比例(pg/g),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析結(jié)果。分別判斷NOS對(duì)胃和腸運(yùn)動(dòng)功能的影響。具體實(shí)驗(yàn)流程安排見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。腸管平均周徑和胃腸組織中的NOS含量采用單因素方差分析。各組原始數(shù)據(jù)屬于正態(tài)分布,進(jìn)行兩兩比較時(shí)選用檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白組因互相撕咬死亡1只,共納入7只;治療1組因麻醉藥過量死亡1只,共納入7只。

2.1 治療組和模型組腸管形態(tài)學(xué)比較

造模后大鼠腹腔內(nèi)滲液增加,腸管內(nèi)積氣積液,腸管壁充血水腫,黏膜表面出現(xiàn)散在點(diǎn)片狀出血及糜爛灶。經(jīng)過針刺治療后觀察發(fā)現(xiàn),治療組腹腔內(nèi)僅有少量滲液,梗阻部位以上腸管輕度腫脹或未見明顯腫脹,腸管內(nèi)少量積氣積液,腸黏膜表面偶見散在點(diǎn)片狀出血。詳見圖1。

2.2 各組大鼠回盲部腸管周徑比較

由表2可見,模型組大鼠造模后回盲部腸管周徑與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),提示造模成功。模型2組回盲部腸管周徑與模型1組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療組治療后回盲部腸管周徑與模型組和治療2組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療2組回盲部腸管周徑與空白組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表2 各組梗阻部位以上腸管周徑比較 (±s,mm)

表2 各組梗阻部位以上腸管周徑比較 (±s,mm)

組別n大鼠回盲部腸管周徑 空白組76.00±0.93 模型1組89.88±1.461) 模型2組812.00±1.311)2) 治療1組78.00±0.821)2)3) 治療2組87.00±0.762)3)4)

注:與空白組比較1)＜0.05;與模型1組比較2)＜0.05;與模型2組比較3)＜0.05;與治療1組比較4)＜0.05

A 模型1組 B 治療1組

C 模型2組 D 治療2組

圖1 各組形態(tài)學(xué)示意圖

2.3 各組大鼠胃、腸NOS含量比較

由表3可見,模型組腸NOS含量與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療1組治療后腸NOS含量與模型組和治療2組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。治療2組治療后腸NOS含量與模型組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。各組腸NOS含量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表3 各組大鼠胃、腸NOS含量比較 (±s,pg/g)

表3 各組大鼠胃、腸NOS含量比較 (±s,pg/g)

組別n腸胃 空白組70.86±0.470.76±0.16 模型1組8 0.50±0.101)2)0.80±0.20 模型2組8 0.45±0.221)2)0.87±0.25 治療1組71.02±0.480.91±0.29 治療2組8 0.60±0.252)0.90±0.26

注:與空白組比較1)＜0.05;與治療1組比較2)＜0.05

3 討論

胃腸功能紊亂是腹部外科術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一,除了胃腸外科手術(shù)以外,肝膽手術(shù)、婦科手術(shù)、心臟手術(shù)、脊柱手術(shù)以及麻醉都會(huì)影響術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)[6-9],術(shù)后如何盡早地恢復(fù)胃腸自主運(yùn)動(dòng)功能是患者康復(fù)的關(guān)鍵。大量文獻(xiàn)報(bào)道了針灸對(duì)術(shù)后胃腸功能恢復(fù)具有雙向調(diào)整作用,并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床胃腸疾病的治療和術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)方面[10-13]。其可能的作用機(jī)制有胃腸電生理、胃腸液分泌、胃腸激素及血流等多個(gè)方面[14]。本研究旨在探討除以上機(jī)制外,針刺還可以通過NO途徑改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能及其具體作用機(jī)制,為臨床針刺治療腹部術(shù)后胃腸功能紊亂提供更有力的支持。

自然界中的NO是一種結(jié)構(gòu)簡單的氣體分子,其化學(xué)性質(zhì)活潑,在動(dòng)物體內(nèi)的是一種神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子,在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后直接透過生物膜自由擴(kuò)散進(jìn)入周圍的靶細(xì)胞,執(zhí)行信號(hào)分子的功能。NO作為一種新型的胃腸道內(nèi)非腎上腺素能非膽堿能抑制性神經(jīng)(non adrenergical non-cholinergical, NANC)遞質(zhì),通過3種方式作用于胃腸平滑肌[15-18],①含NOS的NANC能神經(jīng)釋放NO到細(xì)胞外液中,NO再作用于平滑肌靶細(xì)胞,影響平滑肌細(xì)胞的舒張功能;②不含NOS的NANC能神經(jīng)通過釋放VIP和ATP作用于含NOS的NANC能神經(jīng)元或非神經(jīng)元細(xì)胞(如星狀膠質(zhì)細(xì)胞),刺激它們生成并釋放NO;③另外VIP和ATP這類遞質(zhì)也可直接作用于平滑肌靶細(xì)胞,激活胞漿內(nèi)NOS生成NO,NO再進(jìn)一步作用于平滑肌細(xì)胞。NO對(duì)胃腸功能是一種重要的抑制性遞質(zhì),當(dāng)其含量增加時(shí),使胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙,腸蠕動(dòng)減慢,NO的含量與胃腸運(yùn)動(dòng)呈負(fù)相關(guān),NOS與NO呈負(fù)相

關(guān),NOS與胃腸蠕動(dòng)呈正相關(guān)。生物體內(nèi)的NO是由L-精氨酸在還原型輔酶Ⅱ和氧氣存在的條件下,由NOS催化生成L-胍氨酸時(shí)釋放的[19-21]。由于NO在生物體內(nèi)半衰期極短(大約幾秒鐘),很快就被轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}/亞硝酸鹽(NO-2/NO-3)的代謝產(chǎn)物,所以臨床上不能直接測定NO含量,而是通過測定其相關(guān)代謝產(chǎn)物含量間接體現(xiàn)NO含量。本實(shí)驗(yàn)選擇通過檢測胃腸組織中的NOS濃度的變化,間接反映組織中NO的含量,并探討NOS在術(shù)后胃腸功能紊亂過程中的可能作用及其意義。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)大鼠治療前后腸管形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察,并進(jìn)一步通過大鼠腸梗阻上段腸管平均周徑,以及大鼠胃、腸組織標(biāo)本中每克蛋白所含有NOS檢測值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。造模后大鼠梗阻腸管內(nèi)積氣積液,腸管水腫和脹氣顯著,腸黏膜表面出現(xiàn)散在點(diǎn)片狀出血及糜爛灶。針刺治療后腸管形態(tài)學(xué)呈不同程度好轉(zhuǎn),腸管平均周徑減少,并隨療程延長情況進(jìn)一步改善,治療2 d后腸管脹氣情況接近于術(shù)前水平。腸組織標(biāo)本中模型組與空白組比較,NOS降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,造模成功后NOS降低,NO生成增加,對(duì)平滑肌的舒張作用增強(qiáng),腸蠕動(dòng)減慢。模型1組與模型2組比較,NOS增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),腸蠕動(dòng)不會(huì)隨著病程的延長而進(jìn)一步減緩。

腸組織標(biāo)本中,治療1組NOS含量較模型1組顯著增加(＜0.05),治療2組NOS含量較模型2組增加 (＞0.05),治療1組NOS含量增加較治療2組更顯著(＜0.05),提示針刺治療可以促進(jìn)腸蠕動(dòng)恢復(fù),治療1 d的效果優(yōu)于治療2 d。各組間胃組織標(biāo)本中NOS比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),但造模后NOS整體呈增加趨勢,胃運(yùn)動(dòng)功能可能反射性增強(qiáng),治療1組和治療2組胃NOS含量基本一致(＞0.05),提示針刺治療對(duì)胃組織標(biāo)本的NOS含量的變化無影響,針刺不能通過刺激NO含量變化的途徑促進(jìn)術(shù)后胃蠕動(dòng)的恢復(fù)。

綜上所述,針刺可以促進(jìn)不全性腸梗阻大鼠術(shù)后胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),促進(jìn)腸管積氣積液的排出,使大鼠腸管脹氣情況得到改善,使并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)降低。針刺從多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能,這種通腸組織中NOS含量的變化,繼而影響NO的途徑來調(diào)節(jié)腸管平滑肌的收縮和舒張是其調(diào)節(jié)方式之一。而針刺不能通過NO途徑來影響胃的運(yùn)動(dòng)功能。采用針刺治療腹部術(shù)后胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂臨床療效確切,本研究從實(shí)驗(yàn)角度顯示其有效性和科學(xué)性,值得臨床進(jìn)一步推廣及應(yīng)用。

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Effect of Acupuncture on the Expression of NOS in Gastrointestinal Tissues after Abdominal Operation in Rats

1,2,-3,-3.

1.,710015,; 2.,300170,; 3.,300170,

Objective To observe the effect of acupuncture on the expression of nitricoxide synthase (NOS) in gastrointestinal tissues after operation for incomplete intestinal obstruction in rats, and to explore the mechanism of acupuncture in promoting the recovery of gastrointestinal motility. Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into treatment group 1, treatment group 2, model group 1, model group 2, and a normal control group, 8 rats in each group. The incomplete intestinal obstruction models were developed by using single ligation method in treatment groups and model groups. Afterwards, the treatment groups were intervened by acupuncture at Zusanli (ST 36) and Yanglingquan (GB 34), and rats in treatment group 1 and 2 were respectively dissected after 1-day and 2-day treatment. The rats in model group 1 and 2 were respectively dissected 1 d and 2 d after modeling. The morphological observation was performed on rat’s intestinal tissues, and the average diameter of the upper part of the obstructed intestine and the expression of NOS in gastrointestinal tissues were compared. Results The average ileocecal diameter after modeling was significantly different from that in the normal control group (＜0.05). There was a significant difference in comparing the ileocecal diameter between model group 1 and 2 (＜0.05). The ileocecal diameter in treatment group 1 was significantly different from that in treatment group 2 and model groups (P＜0.05). The ileocecal diameter in treatment group 2 was insignificantly different from that in the normal control group (＞0.05). The NOS content in model groups was significantly different from that in the normal group (＜0.05). The NOS content in treatment group 1 was markedly different from that in model groups and treatment group 2 (＜0.05) after intervention. There were no significant inter-group differences in comparing NOS content (＞0.05). Conclusions Acupuncture can promote the recovery of gastrointestinal motility by regulating intestinal NOS content in rats after operation for incomplete intestinal obstruction.

Acupuncture therapy; Intestinal obstruction, Incomplete; NOS; Rats

鄭方(1982 - ),女,主治醫(yī)師

R2-03

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.09.0888

2015-03-14

A